Name: Vasodilatation des vaisseaux isolés et lisolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez l'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque et les études de vasodilatation ex vivo chez la souris Tight-skin. Cette méthode permet d'évaluer l'effet du peptide inhibiteur d'IRF5 sur la progression des maladies cardiovasculaires.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) et HL-102836 (KAP) et Cimphoni Life Sciences (partie du salaire de DW). Les auteurs remercient Meghann Sytsma pour l’édition du manuscrit.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;objectif était de concevoir un inhibiteur de IRF5 pour élucider le rôle de IRF5 sur l&#39;inflammation, la fibrose et la fonction vasculaire dans le cœur des Tsk / + souris. Les conclusions sont que IRF5D n&#39;a pas induit la prolifération ou l&#39;apoptose. En outre, l&#39;inflammation a été réduite et la fonction vasculaire améliorée. Ces données suggèrent que IRF5 joue un rôle mécanistique important dans le développement de l&#39;inflammation et de la fibrose dans le cœur de souris + / Tsk, et qu&#39;il a le p...

<html> La régulation de la croissance cellulaire et les réponses immunitaires de mort cellulaire est essentielle pour le rôle de la famille des facteurs de transcription de facteurs de régulation de l&#39;interféron. IRF5 est soulignée comme étant cruciale pour la régulation des réponses immunitaires entre le type 1, une réponse inflammatoire et la promotion de type 2, une réparation tissulaire réponse immunitaire ciblage. IRF5 est la clé 1 dans le cancer, l&#39; auto - immunité et 2, 3, 4, 5. La souris étanche peau (Tss / +) est un modèle pour la fibrose tissulaire et la sclérodermie due à une mutation de duplication dans le gène de la fibrilline-1. Cette mutation se traduit par une peau étanche et une augmentation du tissu conjonctif. Ces souris développent une inflammation du myocarde, la fibrose et finalement une insuffisance cardiaque 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La sclérodermie est une maladie auto - immune affectant fibrotique environ 150.000 patients aux Etats-Unis 6. Les caractéristiques de cette maladie sont une fibrose d&#39;organes internes , y compris le cœur 7, 8, 9, 10, 11. La nature de l&#39;étude a demandé la conception d&#39;un peptide inhibiteur. L&#39;approche du logiciel a été choisi sur une approche traditionnelle en utilisant un phage display. L&#39;approche du logiciel est plus facile et moins consommatrice de temps. La banque de données RCSB est utilisé pour identifier les sites de liaison appropriés 12. Pour étudier l&#39;interaction du peptide nouvellement conçu avec la protéine recombinante et de se concentrer sur les paramètres de liaison, une technique appelée interférométrie biocouche a été utilisée. Biocouche interférométrie est un techniq biocapteur baséue qui détermine l&#39;affinité de liaison, d&#39;association et de dissociation en utilisant un biocapteur et un échantillon de liaison. Le biocapteur peut être fluorescence, luminescence, radiométrique et colorimétriquement marqué. La mesure est basée sur l&#39; addition ou l&#39; épuisement de masse ressemblant à l&#39; association et la dissociation 13, 14. Le but de cette étude était de comprendre le rôle de IRF5 dans l&#39;inflammation du myocarde et de la fibrose. L&#39;objectif était de mieux comprendre le rôle de IRF5 dans le développement de la fibrose tissulaire et la sclérodermie.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labellisé chèvre anti-souris Anticorps IgG&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford réactif</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp ;</td></tr><tr><td>Biocapteurs</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrat</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Kit de dosage de la prolifération cellulaire</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>dilution 1:1 000 dans PBS</td></tr><tr><td>âne anti rat Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>dilution 1:1 000 dans PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Après beaucoup d’essais et d’erreurs, nous sommes revenus à celui-ci</td></tr><tr><td>Microscope Eclipse TE 200-U avec logiciel</td><td></td><td></td><td></td>de balayage laser EZ C1</tr> Nikon <tr><td>chèvre anti lapin Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Dilution de 1:1 000 dans le PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp ; anti-chèvre</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td> !:10 000 dilution dans l’anti-souris TBS</td></tr><tr><td>HRP</td><td>Donkey Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Dilution de 1:10 000 dans l’anticorps TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Dilution de 1:200 dans l’anticorps PBS</td></tr><tr><td>IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marqueur de neutrophiles</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Dilution 1:200 dans l’octet PBS</td></tr><tr><td>RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>liaison protéine-protéine</td></tr><tr><td>Conception peptidique&nbsp ; Logiciel Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthèse de protéines IRF5 recombinante</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>Expression des protéines, service de synthèse</td></tr><tr><td>dodécylphosphate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>détergent</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Pharmacie</td><td></td><td>Substance contrôlée de l’annexe III, précision requise&nbsp ;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Stéréomicroscope à zoom de dissection trinoculaire avec lumières LED à col de cygne</td><td>Am Scope</td><td>SKU : SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endothélial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contient des suppléments de croissance</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp ; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15 % TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>logiciel MedSuMo</td><td>Medit, Palaiseau, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris tight-peau

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Le facteur régulateur de l’interféron 5 (IRF5) est crucial pour que les cellules déterminent si elles répondent de manière pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. La capacité d’IRF5 à faire passer les cellules d’une voie à une autre est très attrayante en tant que cible thérapeutique. Nous avons conçu un peptide leurre IRF5D avec un logiciel de modélisation moléculaire pour concevoir de petites molécules et des peptides.
IRF5D a inhibé IRF5, réduit les altérations de la matrice extracellulaire et amélioré la vasodilatation endothéliale chez la souris à peau serrée (Tsk/+). Le Kd d’IRF5D pour IRF5 recombinant est de 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, tel que déterminé par des expériences de liaison à l’aide d’expériences d’interférométrie de biocouche. La prolifération et l’apoptose des cellules endothéliales (CE) étaient inchangées à l’aide de concentrations croissantes d’IRF5D (0 à 100 μg/mL, 24 h). Des souris Tsk/+ ont été traitées par IRF5D (1 mg/kg/j par voie sous-cutanée, 21 j). Les expressions d’IRF5 et d’ICAM ont diminué après le traitement par IRF5D. La fonction endothéliale a été améliorée, comme l’a évalué la vasodilatation des artères faciales chez les souris Tsk/+ traitées avec IRF5D par rapport aux souris Tsk/+ sans traitement IRF5D. En tant que facteur de transcription, IRF5 se déplace du cytosol vers le noyau. La translocation a été évaluée par immunohistochimie sur des myocytes cardiaques cultivés sur les différentes matrices extracellulaires cardiaques. Le traitement IRF5D de la souris Tsk/+ a entraîné une réduction du nombre de noyaux positifs à IRF5 par rapport aux animaux sans traitement IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Ces résultats démontrent le rôle important que joue IRF5 dans l’inflammation et la fibrose chez les souris Tsk/+.

Les résultats ont démontré à la figure 1 montrent comment concevoir un peptide. La figure 1, en haut à gauche montre la zone (entre les 2 flèches jaunes, les acides aminés (aa) 425-436) dans IRF5 qui est phosphorylée par un certain nombre de kinases. Figure 1, en haut à droite, montre un ovale jaune où domaine phosphorylée de IRF5 lie. La structure dimérique de 3DSH a été mis en rotation pour observer une fente ou une vallée à la gauche ...

Nous décrivons l’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque chez des souris témoins C57Bl/6J, des souris à peau serrée et des souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur IRF5. Nous décrivons également les études de vasodilatation sur les vaisseaux isolés de C57Bl/6J, de souris à peau serrée et de souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur d’IRF5.

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

L'objectif général de ces procédures d'isolement de la matrice extracellulaire et de vasodilatation ex vivo est d'étudier le traitement par un peptide inhibiteur d'IRF5 chez les rongeurs. Cette méthode peut aider à comprendre comment les modifications de la matrice extracellulaire peuvent amplifier ou atténuer la progression de la maladie. Le principal avantage des études de vasodilatation est de nous fournir un aperçu des processus in vivo sans devoir prendre en compte tous les composants du signalisation.L'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque peut être appliqué à d'autres organes tels que la patte postérieure ou le poumon. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous avons commencé à nous concentrer sur la duplication de la fibrilline-1 chez la souris au pelage serré, et que nous avons reconnu l'impact d'une matrice extracellulaire modifiée sur le comportement cellulaire. Après avoir anesthésié la souris et l'avoir préparée pour la chirurgie, ouvrez la peau à l'aide d'une paire de ciseaux.Inciser depuis la poitrine jusqu'au niveau latéral de la mâchoire inférieure, avec précaution pour ne pas perturber les tissus sous-jacents vers l'avant de la mâchoir

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous présentons une préparation pour la visualisation et la manipulation de la signalisation calcique dans indigène, intact endothélium microvasculaire. Tubes endothéliales fraîchement isolées des artères de résistance de souris fournissant le muscle squelettique de conserver la morphologie in vivo et la signalisation dynamique au sein et entre les cellules voisines. Tubes endotheliales peuvent être préparés à partir de micro-vaisseaux d'autres tissus et organes.

Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

La matrice extracellulaire subit un remodelage important lors de la cicatrisation des plaies, l'inflammation et la tumorigenèse. Nous présentons une nouvelle approche de microscopie par immunofluorescence intravitale de visualiser la dynamique des fibrillaire ainsi que maille-comme composants de la matrice avec une résolution spatiale et temporelle en utilisant épifluorescence ou la microscopie à deux photons.

À long terme intravitale immunofluorescence imagerie de tissus composants matriciels avec épifluorescence et deux microscopie biphotonique

La fenêtre de la chambre du pli cutané dorsal murin présenté visualise une zone d'ischémie aiguë et persistante d'un lambeau musculo. Intravitales épi-fluorescence permet de microscopie pour l'évaluation directe et répétitive de la microvascularisation et la quantification de l'hémodynamique. Morphologique et résultats hémodynamiques peuvent en outre être en corrélation avec des analyses histologiques et moléculaires.

Lésion tissulaire ischémique dans le pli de la Chambre Souris Dorsale: Un lambeau de peau modèle pour étudier l&#39;ischémie aiguë et persistante

Le but de ce protocole est de démontrer les techniques d'isolement et de culture de cellules murines primaires musculaires lisses vasculaires (CMLV) de la circulation coronaire. Une fois que les CMLV ont été isolés, ils peuvent être utilisés pour de nombreuses techniques de culture standard.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

Nous présentons un protocole pour étudier les interactions endothéliale péricytes humaines chez la souris en utilisant une variante du test d'angiogenèse bouchon de gel de matrice.

Etude in vivo de Human Interaction Endothelial-péricytes Utilisation du Gel Matrice Plug - test chez la souris

Protocoles pour l’étude de l’aorte murin embryonnaire et périnatale à l’aide en vivo clonale analyse et cartographie sort, explants aortiques et muscle lisse isolé des cellules sont détaillées ici. Ces diverses approches facilitent l’enquête de la morphogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale dans le développement normal et la pathogenèse de la maladie.

À l’aide de In Vivo et tissulaire et cellulaire Explant approches à l’étude de la morphogénèse et la pathogenèse de l’aorte embryonnaire et périnatale

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des souris entière et intacte pour étudier l’expression de la matrice extracellulaire (ECM) et de la morphologie ductal des glandes mammaires. La souris #4 glandes abdominales ont été extraits des 8-10 semaines vieux nullipares les souris femelles, fixés dans du formol tamponné neutre, sectionnés et colorés par immunohistochimie pour protéines ECM.

Isolement des glandes mammaires de souris intacte, toute analyse d’Expression de la matrice extracellulaire et la morphologie de la glande

Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la perméabilité vasculaire induite par l’administration intradermique des agents favorisant la perméabilité dans la peau de souris. Cette technique peut servir à déterminer la capacité des molécules à promouvoir ou à inhiber une fuite vasculaire ou d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la perméabilité vasculaire.

Évaluation vasculaires hyperperméabilité inducteurs enzymatiques de la peau avec le test de Miles

Ce manuscrit décrit un protocole simple pour l’isolement des artérioles de la rétine de rat qui peut être utilisé dans, calcium imagerie et pression myographie des études électrophysiologiques.

Isolement des artérioles rétiniennes Ex Vivo études de physiologie cellulaire

Ici, nous présentons un protocole pour un test de rayure in vitro utilisant les fibroblastes primaires et pour un test de guérison in vivo de blessure de peau chez les souris. Les deux essais sont des méthodes simples pour évaluer la cicatrisation in vitro et in vivo des plaies.

Scratch Migration Assay et Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing Scratch Migration

La préparation intensive de « tubes » endothéliaux cérébraux intacts de souris à partir d’artérioles parenchymateuses cérébrales est illustrée pour étudier la régulation du flux sanguin cérébral. De plus, nous démontrons les forces expérimentales de ce modèle d’étude endothéliale pour l’imagerie par fluorescence et la mesure électrophysiologique des principales voies de signalisation cellulaire, y compris les changements dans le potentiel intracellulaire [Ca2+] et membranaire.

Isolement et analyse fonctionnelle de l’endothélium artériolaire du parenchyme cérébral de souris

Découvrez l'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque et les études de vasodilatation ex vivo chez la souris Tight-skin. Cette méthode permet d'évaluer l'effet du peptide inhibiteur d'IRF5 sur la progression des maladies cardiovasculaires.

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l'isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

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