Name: Vasodilatation des vaisseaux isolés et lisolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez l'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque et les études de vasodilatation ex vivo chez la souris Tight-skin. Cette méthode permet d'évaluer l'effet du peptide inhibiteur d'IRF5 sur la progression des maladies cardiovasculaires.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) et HL-102836 (KAP) et Cimphoni Life Sciences (partie du salaire de DW). Les auteurs remercient Meghann Sytsma pour l’édition du manuscrit.

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

L&#39;objectif était de concevoir un inhibiteur de IRF5 pour élucider le rôle de IRF5 sur l&#39;inflammation, la fibrose et la fonction vasculaire dans le cœur des Tsk / + souris. Les conclusions sont que IRF5D n&#39;a pas induit la prolifération ou l&#39;apoptose. En outre, l&#39;inflammation a été réduite et la fonction vasculaire améliorée. Ces données suggèrent que IRF5 joue un rôle mécanistique important dans le développement de l&#39;inflammation et de la fibrose dans le cœur de souris + / Tsk, et qu&#39;il a le p...

<html> La régulation de la croissance cellulaire et les réponses immunitaires de mort cellulaire est essentielle pour le rôle de la famille des facteurs de transcription de facteurs de régulation de l&#39;interféron. IRF5 est soulignée comme étant cruciale pour la régulation des réponses immunitaires entre le type 1, une réponse inflammatoire et la promotion de type 2, une réparation tissulaire réponse immunitaire ciblage. IRF5 est la clé 1 dans le cancer, l&#39; auto - immunité et 2, 3, 4, 5. La souris étanche peau (Tss / +) est un modèle pour la fibrose tissulaire et la sclérodermie due à une mutation de duplication dans le gène de la fibrilline-1. Cette mutation se traduit par une peau étanche et une augmentation du tissu conjonctif. Ces souris développent une inflammation du myocarde, la fibrose et finalement une insuffisance cardiaque 5, 6, 7,&gt; 8, 9. La sclérodermie est une maladie auto - immune affectant fibrotique environ 150.000 patients aux Etats-Unis 6. Les caractéristiques de cette maladie sont une fibrose d&#39;organes internes , y compris le cœur 7, 8, 9, 10, 11. La nature de l&#39;étude a demandé la conception d&#39;un peptide inhibiteur. L&#39;approche du logiciel a été choisi sur une approche traditionnelle en utilisant un phage display. L&#39;approche du logiciel est plus facile et moins consommatrice de temps. La banque de données RCSB est utilisé pour identifier les sites de liaison appropriés 12. Pour étudier l&#39;interaction du peptide nouvellement conçu avec la protéine recombinante et de se concentrer sur les paramètres de liaison, une technique appelée interférométrie biocouche a été utilisée. Biocouche interférométrie est un techniq biocapteur baséue qui détermine l&#39;affinité de liaison, d&#39;association et de dissociation en utilisant un biocapteur et un échantillon de liaison. Le biocapteur peut être fluorescence, luminescence, radiométrique et colorimétriquement marqué. La mesure est basée sur l&#39; addition ou l&#39; épuisement de masse ressemblant à l&#39; association et la dissociation 13, 14. Le but de cette étude était de comprendre le rôle de IRF5 dans l&#39;inflammation du myocarde et de la fibrose. L&#39;objectif était de mieux comprendre le rôle de IRF5 dans le développement de la fibrose tissulaire et la sclérodermie.

<table><tbody><tr><td>&nbsp ; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-labellisé chèvre anti-souris Anticorps IgG&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford réactif</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp ;</td></tr><tr><td>Biocapteurs</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent Caspase-3/7 Substrat</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Kit de dosage de la prolifération cellulaire</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>dilution 1:1 000 dans PBS</td></tr><tr><td>âne anti rat Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>dilution 1:1 000 dans PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Après beaucoup d’essais et d’erreurs, nous sommes revenus à celui-ci</td></tr><tr><td>Microscope Eclipse TE 200-U avec logiciel</td><td></td><td></td><td></td>de balayage laser EZ C1</tr> Nikon <tr><td>chèvre anti lapin Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Dilution de 1:1 000 dans le PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp ; anti-chèvre</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td> !:10 000 dilution dans l’anti-souris TBS</td></tr><tr><td>HRP</td><td>Donkey Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>Dilution de 1:10 000 dans l’anticorps TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>Dilution de 1:200 dans l’anticorps PBS</td></tr><tr><td>IRF5 (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques Elx800</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP marqueur de neutrophiles</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Dilution 1:200 dans l’octet PBS</td></tr><tr><td>RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>liaison protéine-protéine</td></tr><tr><td>Conception peptidique&nbsp ; Logiciel Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthèse de protéines IRF5 recombinante</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>Expression des protéines, service de synthèse</td></tr><tr><td>dodécylphosphate de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>détergent</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td>Pharmacie</td><td></td><td>Substance contrôlée de l’annexe III, précision requise&nbsp ;</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5X-45X Stéréomicroscope à zoom de dissection trinoculaire avec lumières LED à col de cygne</td><td>Am Scope</td><td>SKU : SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endothélial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3124</td><td>contient des suppléments de croissance</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp ; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15 % TGX gel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>logiciel MedSuMo</td><td>Medit, Palaiseau, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris tight-peau

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Le facteur régulateur de l’interféron 5 (IRF5) est crucial pour que les cellules déterminent si elles répondent de manière pro-inflammatoire ou anti-inflammatoire. La capacité d’IRF5 à faire passer les cellules d’une voie à une autre est très attrayante en tant que cible thérapeutique. Nous avons conçu un peptide leurre IRF5D avec un logiciel de modélisation moléculaire pour concevoir de petites molécules et des peptides.
IRF5D a inhibé IRF5, réduit les altérations de la matrice extracellulaire et amélioré la vasodilatation endothéliale chez la souris à peau serrée (Tsk/+). Le Kd d’IRF5D pour IRF5 recombinant est de 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, tel que déterminé par des expériences de liaison à l’aide d’expériences d’interférométrie de biocouche. La prolifération et l’apoptose des cellules endothéliales (CE) étaient inchangées à l’aide de concentrations croissantes d’IRF5D (0 à 100 μg/mL, 24 h). Des souris Tsk/+ ont été traitées par IRF5D (1 mg/kg/j par voie sous-cutanée, 21 j). Les expressions d’IRF5 et d’ICAM ont diminué après le traitement par IRF5D. La fonction endothéliale a été améliorée, comme l’a évalué la vasodilatation des artères faciales chez les souris Tsk/+ traitées avec IRF5D par rapport aux souris Tsk/+ sans traitement IRF5D. En tant que facteur de transcription, IRF5 se déplace du cytosol vers le noyau. La translocation a été évaluée par immunohistochimie sur des myocytes cardiaques cultivés sur les différentes matrices extracellulaires cardiaques. Le traitement IRF5D de la souris Tsk/+ a entraîné une réduction du nombre de noyaux positifs à IRF5 par rapport aux animaux sans traitement IRF5D (50 μg/mL, 24 h). Ces résultats démontrent le rôle important que joue IRF5 dans l’inflammation et la fibrose chez les souris Tsk/+.

Les résultats ont démontré à la figure 1 montrent comment concevoir un peptide. La figure 1, en haut à gauche montre la zone (entre les 2 flèches jaunes, les acides aminés (aa) 425-436) dans IRF5 qui est phosphorylée par un certain nombre de kinases. Figure 1, en haut à droite, montre un ovale jaune où domaine phosphorylée de IRF5 lie. La structure dimérique de 3DSH a été mis en rotation pour observer une fente ou une vallée à la gauche ...

Nous décrivons l’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque chez des souris témoins C57Bl/6J, des souris à peau serrée et des souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur IRF5. Nous décrivons également les études de vasodilatation sur les vaisseaux isolés de C57Bl/6J, de souris à peau serrée et de souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur d’IRF5.

Vasodilatation des vaisseaux isolés et l&#39;isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

L'objectif général de ces procédures d'isolement de la matrice extracellulaire et de vasodilatation ex vivo est d'étudier le traitement par un peptide inhibiteur d'IRF5 chez les rongeurs. Cette méthode peut aider à comprendre comment les modifications de la matrice extracellulaire peuvent amplifier ou atténuer la progression de la maladie. Le principal avantage des études de vasodilatation est de nous fournir un aperçu des processus in vivo sans devoir prendre en compte tous les composants du signalisation.L'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque peut être appliqué à d'autres organes tels que la patte postérieure ou le poumon. Nous avons eu cette idée pour la première fois lorsque nous avons commencé à nous concentrer sur la duplication de la fibrilline-1 chez la souris au pelage serré, et que nous avons reconnu l'impact d'une matrice extracellulaire modifiée sur le comportement cellulaire. Après avoir anesthésié la souris et l'avoir préparée pour la chirurgie, ouvrez la peau à l'aide d'une paire de ciseaux.Inciser depuis la poitrine jusqu'au niveau latéral de la mâchoire inférieure, avec précaution pour ne pas perturber les tissus sous-jacents vers l'avant de la mâchoire. Ensuite, disséquer l'artère fascialis en retirant les tissus mous qui l'entourent. Pendant cette manipulation, veiller à ne pas endommager l'artère.Plonger le tissu exposé dans du tampon MOPS afin qu'il reste sain. Une fois l'artère fasciale complètement exposée, saisir l'artère fasciale à proximité de la première bifurcation située en aval de l'endroit où l'artère sera coupée. Ensuite, la détacher de l'artère mère et saisir l'artère fasciale avec la pince.Coupez les deux branches provenant du fascialis, puis soulevez délicatement le vaisseau tout en sectionnant les connexions avec les tissus environnants jusqu'à atteindre la bifurcation. À la bifurcation, sectionez les deux artères filles pour libérer le vaisseau et transférez-le dans une boîte de Pétri contenant du tampon MOPS, où il restera hydraté jusqu'à son utilisation. Pour mesurer la vasodilatation, préparez d'abord la canulation des vaisseaux.Remplir des pipettes en verre ayant un diamètre terminal de 125 à 175 microns avec du tampon MOPS. Remplir également les réservoirs de solution avec du MOPS. Cannuler maintenant les vaisseaux isolés.Fixez-les sur des pipettes en verre à l’aide d’un fil chirurgical ophtalmique. Veillez à éviter la formation de bulles d’air dans les pipettes. Ensuite, fixez les chambres vasculaires sur un microscope inversé équipé d’un dispositif de caméra vidéo.Exécutez la vidéo dans le système de mesure au palmer vidéo pour obtenir une mesure à l'écran des vaisseaux. Maintenant, presurisez les vaisseaux selon un processus en deux étapes. Élevez d'abord les réservoirs remplis de tampons à une hauteur permettant une pression de 20 millimètres de mercure au-dessus du vaisseau.Ouvrir la ligne avec les tampons vers le récipient. Lorsque le récipient se presse, rechercher des signes de fuite autour des attaches et sur toute la longueur du récipient. Si aucune fuite n'est détectée, monter les réservoirs pour produire une pression de 60 millimètres de mercure.Ensuite, inspecter les vaisseaux à nouveau pour détecter d'éventuelles fuites. Une fois que la pression est maintenue sans fuite, équilibrer le vaisseau pendant 30 minutes à cette pression. Après l'équilibre, mesurer la vasodilatation en réponse à un composé d'intérêt.Commencez par contracter le vaisseau d'environ la moitié à trois quarts en ajoutant du U46619. Laissez la solution baigner les vaisseaux pendant six minutes afin de stabiliser la préparation. Ensuite, ajoutez progressivement le composé testé à la solution de bain, par exemple l'acétylcholine.Toutes les deux minutes, augmentez la concentration de la solution test dans le bain de 10, en partant de 0,00001 molaire et en progressant jusqu'à 0,01 molaire. Les changements observés dans la vasodilatation ont soulevé des questions concernant la signalisation. Mais notre attention se concentre sur le cœur.Pour réduire l'utilisation d'animaux, nous avons choisi d'isoler la matrice extracellulaire cardiaque afin de nous concentrer sur les signaux initiés depuis l'extérieur. Commencez par prélever le cœur d'une souris anesthésiée. Transférez-le dans un bécher contenant 15 millilitres de dodécylsulfate de sodium hypertonique à un pour cent.Conserver la solution en agitation douce sur un agitateur magnétique à température ambiante pendant 18 heures. Le jour suivant, remplacer la solution par 15 millilitres de Triton X-100 à 5 % pendant 30 minutes, puis par 15 millilitres de PBS pendant 15 minutes. Ensuite, congeler rapidement la matrice extracellulaire (ECM) à l’aide d’azote liquide dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Une fois congelé, transférez le tissu dans un mortier et un pilon prérefroidis et broyez-le en poudre. Suspendez la poudre dans du PBS additionné d'antibiotique à une concentration de 1:100 dans une solution visqueuse. Soniquez la suspension pendant 30 à 60 secondes dans un bain de glace à un réglage élevé de la sonication.La protéine de la MEC est désormais isolée et doit rester froide. Avant d'utiliser la protéine, mesurez sa concentration à l'aide d'un dosage de Bradford. Le peptide IRF5D est un peptide inhibiteur qui diffère fortement du IRF5 normal.IRF5D compte seulement 17 acides aminés et se lie au site de phosphorylation d'IRF5. Cela empêche la phosphorylation et l'homodimérisation, interférant ainsi avec la formation de l'état actif d'IRF5. Des souris hétérozygotes à peau serrée ont été traitées par IRF5D par voie sous-cutanée pendant trois semaines.Le nombre de neutrophiles et de CD64 a diminué, comme déterminé par immunohistochimie, en fonction du nombre moyen de cellules marquées par champ microscopique. Les traitements par IRF5D ont amélioré la vasodilatation induite par l'acétylcholine dans les artères fasciales de souris hétérozygotes à peau serrée traitées par IRF5D, par rapport à celles traitées au tampon phosphate. Dans des myocytes en culture issus du tissu cardiaque de souris transgéniques, on observait un plus grand nombre de cellules positives pour IRF5 dans les cultures provenant de souris hétérozygotes à peau serrée que dans celles de souris témoins.Le traitement de l'une ou l'autre culture avec IRF5D a entraîné une réduction du nombre de noyaux positifs pour IRF5. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment décellulariser un cœur. Une fois maîtrisée, cette technique peut être transposée à de nombreux organes et aider à répondre à diverses questions. Et n'oubliez pas qu'il est important de ne pas trop digérer la matrice.Vous devez également bien comprendre comment disséquer et suspendre l'artère fascialis. Une fois maîtrisée, cette technique prend environ 60 minutes et peut être utilisée sur pratiquement n'importe quel lit vasculaire. Il est important de garder à l'esprit la fragilité de l'endothélium ; procédez donc avec précaution lors de la dissection.Il n'est pas rare d'avoir un muscle lisse sain et un endothélium endommagé.

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