Vasodilatation des vaisseaux isolés et l'isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau

Nous décrivons l’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque chez des souris témoins C57Bl/6J, des souris à peau serrée et des souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur IRF5. Nous décrivons également les études de vasodilatation sur les vaisseaux isolés de C57Bl/6J, de souris à peau serrée et de souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur d’IRF5.

L’objectif global de ces procédures d’isolement de la matrice extracellulaire et de vasodilatation ex vivo est d’étudier le traitement peptidique inhibiteur de l’IRF5 chez les rongeurs. Cette méthode peut aider à répondre à la question de savoir comment les changements dans la matrice extracellulaire peuvent augmenter ou atténuer la progression de la maladie. Le principal avantage des études de vasodilatation est de nous donner un aperçu des processus in vivo sans avoir à prendre en compte tous les composants de signalisation.

L’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque peut être appliqué à d’autres organes tels que les membres postérieurs ou les poumons. Nous avons eu l’idée pour la première fois lorsque nous avons commencé à nous concentrer sur la duplication de la fibrilline un chez la souris à peau serrée, et avons reconnu l’impact de la matrice extracellulaire modifiée et du comportement cellulaire. Après avoir anesthésié la souris et l’avoir préparée à l’opération, ouvrez la peau à l’aide d’une paire de ciseaux.

Couper de la poitrine vers le côté de l’os de la mâchoire en prenant soin de ne pas perturber le tissu sous-jacent vers l’avant de la mâchoire. Ensuite, disséquez l’artère fasciale en retirant les tissus mous qui l’entourent. Ce faisant, veillez à ne pas endommager l’artère.

Baignez les tissus exposés dans un tampon de vadrouille pour qu’ils restent en bonne santé. Une fois que l’artère fasciale a été complètement exposée, saisissez le fascial proximal à la première bifurcation distale à l’endroit où l’artère sera coupée. Ensuite, coupez-le de l’artère mère et saisissez l’artère fasciale avec la pince.

Coupez les deux branches qui se détachent du fascial, puis soulevez doucement le vaisseau tout en coupant les connexions avec les tissus environnants jusqu’à ce que la bifurcation soit atteinte. À la bifurcation, coupez les deux artères filles pour libérer le vaisseau et transférez-le dans un plat de tampon de vadrouille où il restera hydraté jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour mesurer la vasodilatation, préparez d’abord à canuler les vaisseaux.

Chargez des pipettes en verre d’un diamètre terminal de 125 à 175 microns remplies d’un tampon de vadrouille. Remplissez également les réservoirs de solution avec des serpillières. Canulez maintenant les vaisseaux isolés.

Attachez-les sur des pipettes en verre à l’aide d’une suture ophtalmique. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles d’air dans les pipettes. Ensuite, montez les chambres des cuves sur un microscope inversé à l’aide de la caméra vidéo.

Diffusez la vidéo à travers le système de mesure de l’étrier vidéo pour une mesure à l’écran des navires. Maintenant, pressurisez les récipients à l’aide d’un processus en deux étapes. Soulevez d’abord les réservoirs remplis de vadrouilles à une hauteur au-dessus du récipient pour 20 millimètres de pression de mercure.

Ouvrez la conduite avec les vadrouilles vers le récipient. Au fur et à mesure que la pression du navire est à l’affût des signes de fuite autour des traverses et sur toute la longueur du navire. Si aucune fuite n’est constatée, soulevez les réservoirs pour produire 60 millimètres de mercure de pression.

Ensuite, inspectez à nouveau les récipients pour détecter les fuites. Une fois que la pression est maintenue sans fuites, équilibrez le récipient pendant 30 minutes à cette pression. Après avoir été équilibré, mesurez la vasodilatation en réponse à un composé d’intérêt.

Resserrez d’abord le récipient d’une moitié aux trois quarts en ajoutant U46619. Laissez la solution baigner les récipients pendant six minutes pour se stabiliser. Ensuite, ajoutez progressivement le composé d’essai à la solution de bain, comme l’acétylcholine.

Toutes les deux minutes, augmenter la concentration de la solution d’essai dans le bain par 10 en commençant par 000001 molaire et en progressant jusqu’à 001 molaire. Les changements dans la vasodilatation ont soulevé des questions sur la signalisation. Mais nous nous concentrons sur le cœur.

Pour réduire l’utilisation d’animaux, nous avons choisi d’isoler la matrice extracellulaire cardiaque pour nous concentrer sur la signalisation initiée de l’extérieur. Commencez par prélever le cœur d’une souris anesthésiée. Transférez-le dans un bécher chargé de 15 millilitres de dodécylsulfate de sodium hypertonique à un pour cent.

Maintenez la solution en remuant doucement sur une plaque à mélanger à température ambiante pendant 18 heures. Le lendemain, changez la solution à 15 millilitres de triton X100 à 5 % pendant 30 minutes, suivis de 15 millilitres de PBS pendant 15 minutes. Ensuite, congelez l’ECM et l’azote liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.

Une fois congelé, transférez le tissu dans un mortier et un pilon pré-refroidis et broyez-le en poudre. Mettre la poudre en suspension dans du PBS avec l’ajout d’un antibiotique à une concentration de 1:100 dans une solution visqueuse. Sonicez la suspension pendant 30 à 60 secondes dans un bain de glace à un réglage de sonication élevée.

La protéine ECM est maintenant isolée et doit rester froide. Avant d’utiliser la protéine, mesurez sa concentration à l’aide d’un test Bradford. Le peptide IRF5D est un peptide inhibiteur qui diffère grandement de l’IRF5 normal.

IRF5D ne possède que 17 acides aminés et se lie au site de phosphorylation d’IRF5. Cela empêche la phosphorylation et l’homodimérisation, interférant ainsi avec la formation de l’état actif IRF5. Des souris hétérozygotes à peau tendue ont été traitées par voie sous-cutanée avec IRF5D pendant trois semaines.

Le nombre de neutrophiles et de CD64 a diminué, comme déterminé par l’immunohistochimie, dans le nombre moyen de cellules colorées par champ de vision. Les traitements IRF5D ont amélioré la vasodilatation des artères fasciales induite par l’acétylcholine chez les souris hétérozygotes à peau tendue traitées avec IRF5D par rapport à celles traitées avec un tampon phosphate. Dans les myocytes cultivés dérivés du tissu cardiaque des souris transgéniques, il y avait plus de cellules IRF5 positives dans les cultures de souris hétérozygotes à peau serrée que chez les souris témoins.

Le traitement de l’une ou l’autre culture avec IRF5D a entraîné une réduction des noyaux IRF5 positifs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de décellulariser un cœur. Une fois maîtrisée, cette technique peut être transposée à de nombreux organes et aider à répondre à une variété de questions Et rappelez-vous qu’il est important de ne pas trop digérer la matrice.

Vous devez également avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de suspendre l’artère fasciale. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ 60 minutes et peut être utilisée sur à peu près n’importe quel lit vasculaire. Il est important de se rappeler à quel point l’endothélium est fragile, procédez avec prudence lors de la dissection.

Il n’est pas rare d’avoir des muscles lisses sains et un endothélium endommagé.