Vasodilatation des vaisseaux isolés et l'isolement de la matrice extracellulaire de souris Tight-peau
24 mars 2017
Nous décrivons l’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque chez des souris témoins C57Bl/6J, des souris à peau serrée et des souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur IRF5. Nous décrivons également les études de vasodilatation sur les vaisseaux isolés de C57Bl/6J, de souris à peau serrée et de souris à peau serrée traitées avec le peptide inhibiteur d’IRF5.
L’objectif global de ces procédures d’isolement de la matrice extracellulaire et de vasodilatation ex vivo est d’étudier le traitement peptidique inhibiteur de l’IRF5 chez les rongeurs. Cette méthode peut aider à répondre à la question de savoir comment les changements dans la matrice extracellulaire peuvent augmenter ou atténuer la progression de la maladie. Le principal avantage des études de vasodilatation est de nous donner un aperçu des processus in vivo sans avoir à prendre en compte tous les composants de signalisation.
L’isolement de la matrice extracellulaire cardiaque peut être appliqué à d’autres organes tels que les membres postérieurs ou les poumons. Nous avons eu l’idée pour la première fois lorsque nous avons commencé à nous concentrer sur la duplication de la fibrilline un chez la souris à peau serrée, et avons reconnu l’impact de la matrice extracellulaire modifiée et du comportement cellulaire. Après avoir anesthésié la souris et l’avoir préparée à l’opération, ouvrez la peau à l’aide d’une paire de ciseaux.
Couper de la poitrine vers le côté de l’os de la mâchoire en prenant soin de ne pas perturber le tissu sous-jacent vers l’avant de la mâchoire. Ensuite, disséquez l’artère fasciale en retirant les tissus mous qui l’entourent. Ce faisant, veillez à ne pas endommager l’artère.
Baignez les tissus exposés dans un tampon de vadrouille pour qu’ils restent en bonne santé. Une fois que l’artère fasciale a été complètement exposée, saisissez le fascial proximal à la première bifurcation distale à l’endroit où l’artère sera coupée. Ensuite, coupez-le de l’artère mère et saisissez l’artère fasciale avec la pince.
Coupez les deux branches qui se détachent du fascial, puis soulevez doucement le vaisseau tout en coupant les connexions avec les tissus environnants jusqu’à ce que la bifurcation soit atteinte. À la bifurcation, coupez les deux artères filles pour libérer le vaisseau et transférez-le dans un plat de tampon de vadrouille où il restera hydraté jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Pour mesurer la vasodilatation, préparez d’abord à canuler les vaisseaux.
Chargez des pipettes en verre d’un diamètre terminal de 125 à 175 microns remplies d’un tampon de vadrouille. Remplissez également les réservoirs de solution avec des serpillières. Canulez maintenant les vaisseaux isolés.
Attachez-les sur des pipettes en verre à l’aide d’une suture ophtalmique. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles d’air dans les pipettes. Ensuite, montez les chambres des cuves sur un microscope inversé à l’aide de la caméra vidéo.
Diffusez la vidéo à travers le système de mesure de l’étrier vidéo pour une mesure à l’écran des navires. Maintenant, pressurisez les récipients à l’aide d’un processus en deux étapes. Soulevez d’abord les réservoirs remplis de vadrouilles à une hauteur au-dessus du récipient pour 20 millimètres de pression de mercure.
Ouvrez la conduite avec les vadrouilles vers le récipient. Au fur et à mesure que la pression du navire est à l’affût des signes de fuite autour des traverses et sur toute la longueur du navire. Si aucune fuite n’est constatée, soulevez les réservoirs pour produire 60 millimètres de mercure de pression.
Ensuite, inspectez à nouveau les récipients pour détecter les fuites. Une fois que la pression est maintenue sans fuites, équilibrez le récipient pendant 30 minutes à cette pression. Après avoir été équilibré, mesurez la vasodilatation en réponse à un composé d’intérêt.
Resserrez d’abord le récipient d’une moitié aux trois quarts en ajoutant U46619. Laissez la solution baigner les récipients pendant six minutes pour se stabiliser. Ensuite, ajoutez progressivement le composé d’essai à la solution de bain, comme l’acétylcholine.
Toutes les deux minutes, augmenter la concentration de la solution d’essai dans le bain par 10 en commençant par 000001 molaire et en progressant jusqu’à 001 molaire. Les changements dans la vasodilatation ont soulevé des questions sur la signalisation. Mais nous nous concentrons sur le cœur.
Pour réduire l’utilisation d’animaux, nous avons choisi d’isoler la matrice extracellulaire cardiaque pour nous concentrer sur la signalisation initiée de l’extérieur. Commencez par prélever le cœur d’une souris anesthésiée. Transférez-le dans un bécher chargé de 15 millilitres de dodécylsulfate de sodium hypertonique à un pour cent.
Maintenez la solution en remuant doucement sur une plaque à mélanger à température ambiante pendant 18 heures. Le lendemain, changez la solution à 15 millilitres de triton X100 à 5 % pendant 30 minutes, suivis de 15 millilitres de PBS pendant 15 minutes. Ensuite, congelez l’ECM et l’azote liquide dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.
Une fois congelé, transférez le tissu dans un mortier et un pilon pré-refroidis et broyez-le en poudre. Mettre la poudre en suspension dans du PBS avec l’ajout d’un antibiotique à une concentration de 1:100 dans une solution visqueuse. Sonicez la suspension pendant 30 à 60 secondes dans un bain de glace à un réglage de sonication élevée.
La protéine ECM est maintenant isolée et doit rester froide. Avant d’utiliser la protéine, mesurez sa concentration à l’aide d’un test Bradford. Le peptide IRF5D est un peptide inhibiteur qui diffère grandement de l’IRF5 normal.
IRF5D ne possède que 17 acides aminés et se lie au site de phosphorylation d’IRF5. Cela empêche la phosphorylation et l’homodimérisation, interférant ainsi avec la formation de l’état actif IRF5. Des souris hétérozygotes à peau tendue ont été traitées par voie sous-cutanée avec IRF5D pendant trois semaines.
Le nombre de neutrophiles et de CD64 a diminué, comme déterminé par l’immunohistochimie, dans le nombre moyen de cellules colorées par champ de vision. Les traitements IRF5D ont amélioré la vasodilatation des artères fasciales induite par l’acétylcholine chez les souris hétérozygotes à peau tendue traitées avec IRF5D par rapport à celles traitées avec un tampon phosphate. Dans les myocytes cultivés dérivés du tissu cardiaque des souris transgéniques, il y avait plus de cellules IRF5 positives dans les cultures de souris hétérozygotes à peau serrée que chez les souris témoins.
Le traitement de l’une ou l’autre culture avec IRF5D a entraîné une réduction des noyaux IRF5 positifs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de décellulariser un cœur. Une fois maîtrisée, cette technique peut être transposée à de nombreux organes et aider à répondre à une variété de questions Et rappelez-vous qu’il est important de ne pas trop digérer la matrice.
Vous devez également avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer et de suspendre l’artère fasciale. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ 60 minutes et peut être utilisée sur à peu près n’importe quel lit vasculaire. Il est important de se rappeler à quel point l’endothélium est fragile, procédez avec prudence lors de la dissection.
Il n’est pas rare d’avoir des muscles lisses sains et un endothélium endommagé.
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Aperçu
Cet article décrit l'isolement de la matrice extracellulaire cardiaque à partir de divers modèles murins et les études de vasodilatation ultérieures. L'accent est mis sur la compréhension des effets du traitement par un peptide inhibiteur de IRF5 sur la progression de la maladie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cardiovasculaire
- Recherche sur la matrice extracellulaire
Contexte
- L'isolement de la matrice extracellulaire est essentiel pour étudier son rôle dans les maladies.
- IRF5 est impliqué dans la progression de certaines maladies.
- Les souris au pelage serré présentent des propriétés altérées de la matrice extracellulaire.
- Les études sur la vasodilatation fournissent des informations sur la fonction vasculaire.
Objectif de l'étude
- Isoler la matrice extracellulaire cardiaque pour des analyses supplémentaires.
- Évaluer l'impact du peptide inhibiteur de IRF5 sur les réponses vasculaires.
- Comprendre comment les modifications de la matrice extracellulaire influencent la progression de la maladie.
Méthodes utilisées
- Isolation de la matrice extracellulaire cardiaque à partir de modèles murins.
- Études de vasodilatation ex vivo sur des vaisseaux isolés.
- Comparaison des réponses entre souris témoins et souris traitées.
- Préparation chirurgicale des souris pour l'isolement de la matrice.
Résultats principaux
- Isolation réussie de la matrice extracellulaire cardiaque à partir de différentes souches de souris.
- Les réponses de vasodilatation variaient entre les souris témoins et celles traitées au peptide IRF5.
- Acquisition de connaissances sur le rôle de la matrice extracellulaire dans la fonction vasculaire.
- Applications potentielles de la méthode d'isolement à d'autres organes.
Conclusions
- L'étude souligne l'importance de la matrice extracellulaire dans la santé cardiovasculaire.
- Le traitement par un peptide inhibiteur de l'IRF5 montre des résultats prometteurs pour la modification des réponses vasculaires.
- Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour explorer les implications en matière de prise en charge des maladies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Cette méthode permet une démolition mécanistique du risque associé à IRF5 en tant que cible thérapeutique, en établissant un lien entre le remodelage de la matrice extracellulaire et la dysfonction vasculaire dans la fibrose inflammatoire. Le test de vasodilatation ex vivo fournit des mesures quantitatives et reproductibles de la fonction endothéliale, indépendantes des facteurs de confusion systémiques, soutenant ainsi la validation de la cible dans des modèles précliniques. L'isolement de la matrice extracellulaire pertinente pour la maladie facilite le criblage phénotypique et l'élucidation des voies impliquées, dans le cadre de la découverte de médicaments anti-fibrosants.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Interroge l'hypothèse thérapeutique selon laquelle l'inhibition de l'IRF5 réduit la signalisation pro-inflammatoire et le dépôt de la matrice extracellulaire chez les souris à peau serrée.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de la cible grâce à la mesure de la translocation nucléaire de l'IRF5 et de l'expression en aval de l'ICAM dans les cardiomyocytes.
- Valeur prédictive : Soutient le tri du portefeuille en démontrant une amélioration de la vasodilatation endothéliale comme biomarqueur fonctionnel de l'engagement de la cible.
Développement de tests et criblage
- Prêt-à-l’emploi du test : La matrice extracellulaire cardiaque isolée fournit un système normalisé et pertinent sur le plan pathologique pour évaluer les effets de composés sur le comportement cellulaire et la signalisation.
- Résultats quantitatifs : Des mesures de vasodilatation ex vivo à l’aide de courbes dose-réponse à l’acétylcholine permettent une évaluation précise de la fonction endothéliale dans des artères faciales isolées.
- Réutilisation de la plateforme : Le protocole d’isolement de la MEC peut être transposé aux membres postérieurs, aux poumons ou à d’autres lits vasculaires afin de soutenir la validation croisée des cibles selon les organes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour la maladie : Utilise le modèle murin « tight-skin », qui présente une fibrose et une dysfonction vasculaire analogues à celles observées dans la sclérodermie humaine.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre l'inhibition de l'IRF5 et la réduction des altérations de la matrice extracellulaire ainsi qu'une amélioration de la vasodilatation, soutenant ainsi une dé-risquisation mécanistique pour la translation clinique.
- Utilité du modèle préclinique : Permet de prendre des décisions d'orientation fondées sur le risque en démontrant une amélioration, médiée par la cible, de la fonction vasculaire après administration sous-cutanée chronique.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre dans le continuum de découverte, de la validation de la cible jusqu'à l'évaluation préclinique de l'efficacité, permettant une conception itérative de composés modulant IRF5 en fonction des phénotypes vasculaires et matriciels.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en isolant la matrice extracellulaire afin d'étudier la signalisation du dehors vers l'intérieur qui active IRF5 et déclenche des réponses pro-inflammatoires.
- Écrans : Fournit des tissus vasculaires prêts à l'emploi présentant des réponses de vasodilatation reproductibles pour évaluer la puissance et la sélectivité de composés.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (variations du diamètre des vaisseaux) et des résultats statistiques (CE50, pourcentage de vasodilatation) afin de comparer les effets des traitements entre groupes.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre l'engagement du site moléculaire ciblé (réduction nucléaire d'IRF5), les conséquences au niveau tissulaire (remodelage de la matrice extracellulaire) et l'amélioration fonctionnelle (vasodilatation) dans un système pertinent pour la maladie.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une capacité réutilisable pour étudier les interactions matrice extracellulaire-vaisseaux sanguins dans plusieurs systèmes organiques et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique en isolant la fonction vasculaire des variables systémiques, renforçant ainsi la confiance dans les relations cible-maladie.
- Valeur opérationnelle : Standardise les procédures de vasodilatation et d'isolement de la MEC, améliorant la reproductibilité entre laboratoires et permettant une collaboration pluridisciplinaire.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en reliant l'inhibition de la cible à des résultats fonctionnels vasculaires, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée des programmes contre la fibrose.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des thérapies ciblant IRF5, fondée sur une amélioration démontrée de la fonction endothéliale et de l'homéostasie matricielle.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en dissection microvasculaire, en myographie sous pression et en biochimie de la matrice extracellulaire.
- Dépend d'un équipement spécialisé comprenant des systèmes de mesure vidéo, des microscopes inversés et des réservoirs sous pression pour les études de vasodilatation.
- Exige une standardisation de la manipulation des tissus, de la composition du tampon (MOPS) et des protocoles de contraction (pré-contraction avec U46619) afin d'assurer la comparabilité des données.
- Implique des adaptations à considérer lors de l'application de l'isolement de la MEC à des tissus non cardiaques, notamment l'optimisation des réactifs de décellularisation (SDS, Triton X-100) et de leur durée d'action.
- Limite pratique : la fragilité de l'endothélium isolé exige une technique méticuleuse afin d'éviter tout dommage mécanique durant la canulation et la pressurisation du vaisseau.
