Name: Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Découvrez comment fabriquer des nano-clusters de protéines dans une bicouche lipidique supportée pour étudier l'adhésion cellulaire et l'activation des lymphocytes T. Cette méthode compatible avec la microscopie TIRF et RICM offre des applications en biologie cellulaire, oncologie et ingénierie tissulaire.

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Nous remercions Laurent Limozin, Pierre Dillard et Astrid Wahl pour poursuivre des discussions fructueuses sur les applications cellulaires. Nous remercions également Frederic Bedu de l&#39;installation PLANETE de salle blanche pour son aide avec les observations SEM. Ce travail a été financé en partie par le Conseil européen de la recherche par subvention n ° 307104 FP / 2007-2013 / ERC.

1. diapositives Cover-verre Nettoyage et Chambres d&#39;observation <ol><li> Disposer les lames de couvre-objet sur un plateau-diapositive multiple constituée d&#39;un matériau inerte tel que polytétrafluoroéthylène (PTFE). </li><li> Immerger le plateau avec les diapositives et la chambre d&#39;observation dans une solution d&#39;agent tensio-actif (un produit recommandé pour le nettoyage des cuvettes de quartz est approprié). </li><li> En utilisant un bain à ultrasons, ultra-sonication dans la solution d&#39;agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li><li> Rincer 5 fois avec de l&#39;eau ultrapure (18,2 MΩ.cm, 0.059 uS / cm). </li><li> Ultra-sonication dans une solution d&#39;agent tensio-actif pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li><li> Rincer 10 fois avec de l&#39;eau ultra pure. </li><li> Répétez les étapes 1,5 et 1,6 fois. </li><li> Magasin dans l&#39;eau à température ambiante (entre 20 et 30 ° C) pendant jusqu&#39;à une semaine. </li></ol> 2. Fabrication de protéines Nano-points <ol><li> Le dépôt de perles <ol><li> Deposit la suspension de billes de silice (2% v / v, 70 uL) goutte à goutte sur un couvercle coulissant (24 x 24 mm, épaisseur 170 um) maintenus à une inclinaison de 15 degrés. </li><li> Laissez la suspension répandre pendant environ 1 min tout en feuilletant le verre de 90 ° tous les 15 s. </li><li> Laisser le liquide à évaporer dans les conditions ambiantes. </li><li> Conserver dans un verre propre ou une chambre de PTFE dans les conditions ambiantes pendant 2 jours. </li></ol></li><li> Dépôt d&#39;aluminium <ol><li> Placer les lames (préparé dans la section 2.1) à l&#39; intérieur d&#39; une fréquence radio (RF) l&#39; équipement de pulvérisation cathodique à magnétron 8, sur une table rotative à une distance d&#39;environ 105 mm à partir d&#39;aluminium (99%): silicium (1%) cible. </li><li> Pomper la chambre de dépôt à 2,6 x 10 -4 Pa à l&#39; aide d&#39; une pompe turbo-moléculaire. Cette étape est importante pour l&#39;élimination des impuretés gazeuses possibles. </li><li> L&#39;introduction d&#39;air pur argon (5N, 99,999%) avec un flux de 10 sccm sous une pression de 0,8 Pa (6,6 mTorr). <br/&gt; Remarque: le flux d&#39;argon entrant est contrôlée par un contrôleur de débit massique et de la pression de processus est surveillé à l&#39;aide d&#39;un manomètre. Le flux de gaz d&#39;argon est continue et est commandé par un équilibre entre l&#39;entrée et l&#39;ouverture des vannes de sortie. </li><li> Allumez le générateur de puissance RF. REMARQUE: Ici, une gamme typique de 400-600 W puissance radiofréquence à la fréquence 13,56 MHz a été utilisé. Le générateur RF est utilisé avec un réseau d&#39;adaptation à un mode de couplage plasma capacitif. La puissance réfléchie est contrôlée et réduite au minimum en utilisant l&#39;adaptation de réseau. </li><li> Après que le plasma est stabilisé par pulvérisation pendant 2 minutes en gardant l&#39;obturateur fermé pour éliminer les impuretés à partir de la surface de la cible. </li><li> Ouvrir l&#39;obturateur et permettre à la pulvérisation cathodique se poursuivre pendant 60 min à déposer l&#39;aluminium sur la lame de verre à une épaisseur de 200 nm. </li><li> Couper le flux d&#39;argon, fermer la vanne pour isoler la pompe turbomoléculaire à partir de la chambre de dépôt et de ventilation de la chambre avec n propreitrogen pour obtenir la pression ambiante. Récupérer les lames recouvertes d&#39;aluminium. Stocker jusqu&#39;à un mois dans un verre propre et hermétique ou une boîte PTFE dans des conditions ambiantes. </li></ol></li><li> dépôt en phase vapeur d&#39;organosilane <ol><li> Immerger la lame revêtue d&#39;aluminium préparé dans l&#39;étape 2.2.6 dans l&#39;eau ultra-pure à la température ambiante et ultra-sonication pendant 30 s dans un bain à ultrasons (50 W, 50/60 Hz, entre 20 et 30 ° C). </li><li> Dépôt de 0,5 ml de (3-aminopropyl) -triéthoxysilane (APTES) au fond d&#39;un dessiccateur. ATTENTION: APTES est un organosilane, qui s&#39;évapore facilement et est toxique. APTES doivent être manipulés que sous une hotte à flux et avec des gants. </li><li> Placer les lames de verre (préparé en 2.3.1) sur une grille en céramique et place à l&#39;intérieur du dessiccateur. </li><li> Connecter le dessiccateur à une pompe à membrane et de fonctionner à la puissance maximale pendant 30 min pour produire un vide faible. </li><li> Fermez la vanne du dessicateur et éteindre la pompe. </li><li> Chauffer le dessicateurà environ 50 ° C pendant 1 h. </li><li> Ouvrez le dessicateur et recueillir les diapositives. </li><li> Transfert à un autre dessicateur propre pour le stockage jusqu&#39;à 48 h à la température ambiante (20 à 30 ° C). </li></ol></li><li> Le dépôt de la première couche de protéine - sérum-albumine bovine marquée à la biotine (BSA-biotine) <ol><li> Placez l&#39;une des lames préparées à la section 2.3 sur un support en PTFE. </li><li> Dépôt de 1 ml de 25 pg / ml de BSA-biotine dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Laisser pendant 30 min à température ambiante (20 à 30 ° C). </li><li> Rincer 10 fois avec du PBS. Stocker l&#39;échantillon pendant 24 h à 4 ° C à une distance de la source lumineuse. </li></ol></li><li> Retrait du masque en aluminium <ol><li> Incuber les lames dans une solution de NaOH dans du PBS (préparé par addition goutte à goutte de NaOH 1 M à environ 100 mL de PBS pour obtenir pH≈12) à la température ambiante pendant une nuit (entre 20 et 30 ° C). MISE EN GARDE. NaOH est corrosif et doit être manipulée avec des gants. </li><li> Rincer10 fois dans l&#39;eau ultra pure. </li></ol></li></ol> 3. Dépôt de prise en charge lipidique en deux couches (SLB) <ol><li> Nettoyage de la cuvette de Langmuir <ol><li> Retirer l&#39;eau dans l&#39;enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir en utilisant une pompe. </li><li> Nettoyer avec une serviette jetable non-tissé non pelucheux trempé dans du chloroforme. MISE EN GARDE. Le chloroforme est toxique et doit être manipulé dans une zone bien ventilée, avec un masque (ou un sous-hotte à flux) et avec des gants appropriés. </li><li> Nettoyer 4 fois avec de l&#39;eau ultrapure tiède (40 à 50 ° C). </li><li> Nettoyer au moins 6 fois avec de l&#39;eau froide ultrapure. </li></ol></li><li> Le dépôt de la première couche lipidique <ol><li> Placez les plateaux de PTFE dans l&#39;enceinte de PTFE de la cuve de Langmuir puis le remplir avec de l&#39;eau ultrapure. </li><li> Utiliser le logiciel de commande de l&#39;appareil de Langmuir pour régler la pression mesurée à 0 mN / m. </li><li> Utiliser une seringue en verre étanche au gaz / métal à déposer 30 ul d&#39;une solution de lipides de 1 mg / mL (1, 2-dioleoyl- sn - glycéro-3-phosphocholine (DOPC) dans du chloroforme) sur la surface de l&#39;eau. Le chloroforme et évapore les molécules lipidiques se forment spontanément une monocouche. </li><li> Utiliser le logiciel de commande pour comprimer la monocouche lipidique par la fermeture de la barrière de PTFE jusqu&#39;à la pression désirée (27 mN / m pour DOPC) est atteinte. </li><li> Utiliser le logiciel de commande pour tremper la lame de verre préparée dans la section 2.5.2 dans l&#39;enceinte PTFE à l&#39;aide d&#39;une pince motorisée. </li><li> Maintenir la glissière, dans la pince, perpendiculairement à l&#39;interface air-eau. Utiliser le logiciel de commande pour le porter lentement (15 mm / min) à travers l&#39;interface, tout en maintenant une pression constante à 27 mN / m. </li><li> Placer dans un environnement sec soit pour une utilisation immédiate ou pour le stockage jusqu&#39;à 24 h à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li></ol></li><li> Le dépôt de la seconde couche lipidique <ol><li> Maintenir la pression de surface dans la cuve de Langmuir à la valeur désirée de 27 mN / m. Compresser en utilisant laun logiciel de commande de l&#39;appareil de Langmuir et / ou ajouter une petite quantité de lipides pour obtenir la pression souhaitée. </li><li> Placer les lames de verre portant la monocouche lipidique, préparé dans la section 3.2.6, horizontalement sur la surface de l&#39;eau. Assurez-vous que chaque lame est flottant au-dessus d&#39;un plateau de PTFE. </li><li> Appuyez sur les lames de verre vers le bas, une lame à la fois, dans son bac de PTFE correspondant en utilisant des pinces en PTFE ou en métal de telle sorte qu&#39;ils sont immergés dans l&#39;eau. Évitez d&#39;incliner les diapositives tout en poussant. </li><li> Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer les plateaux de PTFE contenant les lames dans un cristallisoir rempli d&#39;eau ultrapure faire en sorte que les lames ne sont pas exposés à l&#39;air. </li><li> Utiliser des pinces en PTFE ou en métal pour transférer, tout en travaillant sous l&#39;eau, une lame de verre revêtue de deux couches dans une chambre d&#39;observation. REMARQUE: La chambre d&#39;observation est placée sous l&#39;eau à l&#39;intérieur du cristalliseur. La chambre d&#39;observation est fait sur mesure et se compose d&#39;une bague de PTFE avec un joint en caoutchoucd boîtiers en acier, qui peuvent être assemblés sous l&#39;eau pour faire une chambre étanche à l&#39;eau dont la surface inférieure est réalisée à partir de la lame de verre préalablement revêtu avec la bicouche lipidique. </li><li> Fermez la chambre tout en continuant à travailler sous l&#39;eau et veiller à ce que environ 1 ml d&#39;eau est piégé dans la chambre. </li><li> Prendre la chambre assemblé hors de l&#39;eau. Assurez-vous que ce soit et sans fuite étanche à l&#39;eau. </li><li> Remplacer les 1 ml d&#39;eau présente ultrapure dans la chambre d&#39;observation avec du PBS en ajoutant et en enlevant 500 ul de PBS 10 fois. Assurez-vous que la chambre est jamais dépourvue de liquide. </li></ol></li><li> étape de blocage SLB <ol><li> Introduire 100 ug / ml d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans la chambre d&#39;observation contenant la lame préparée dans la section 3.3.6 et incuber pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li><li> Rincer la bicouche en supprimant et en ajoutant 500 ul de PBS 10 fois. La bicouche peut être conservé 24 h à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 4. fonctionnalisation avec Ligands <ol><li> Ajouter fluorescent ou non fluorescent neutravidine (NAV, une version de l&#39;avidine déglycosylée pas chargée à un pH de 7) à 2 ug / mL dans la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2 pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li><li> Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois. </li><li> Ajouter anti-CD3 biotinylé à 2 ug / mL à la chambre contenant le coulisseau préparé dans la section 3.4.2. Pour une double fonctionnalisation du SLB et les points, ajoutez Fc-ICAM1 marqueur His à 5 ug / ml (lipides ici, la double couche est faite de DOPC + 1% d&#39;acide nitrilotriacétique (NTA)). Laisser reposer pendant 30 min à température ambiante (entre 20 et 30 ° C). </li><li> Rincer en ajoutant et en supprimant 500 ul de PBS 10 fois </li><li> Remplacer le PBS avec du milieu cellulaire (PBS + BSA à 0,1%) en ajoutant et en enlevant 500 ul du milieu cellulaire 10 fois. </li><li> Laisser 200 pi de milieu cellulaire dans la chamber avec le coulisseau. </li><li> Placer la chambre pendant 10 min à 37 ° C avant d&#39;ajouter les cellules. </li></ol> 5. Le dépôt de cellules (voir la référence 7 pour les détails) <ol><li> déposer délicatement 400 ul de la suspension de cellules dans la chambre. Incuber les cellules pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Fixer la cellule avec 2% de paraformaldehyde (PFA) pendant 15 min à 37 ° C. Remplacer le PFA avec du PBS par élimination répétée et addition de 500 ul de PBS. </li></ol> 6. Observation <ol><li> Proteo-lipidique motif de Nano et la fluidité SLB <ol><li> Utiliser un microscope à fluorescence à l&#39; image du motif de protéine en mode épifluorescence en utilisant une longueur d&#39; onde d&#39;illumination appropriée (639 nm) et cubes de filtre (par exemple ici, EX TBP 483 + 564 + 642; BS TFT 506 + 582 + 659; EM TBP 526 + 601 +688). NOTE: L&#39;intensité du signal peut être quantifiée pour estimer la quantité de protéine à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieur du point. Utiliser une longueur d&#39;onde d&#39;illumination appropriée (330 nm) et fcube ilter à l&#39;image de la double couche (BP 365/12, FT 395, 397 LP), qui apparaît lumineux avec des trous noirs. </li><li> Utiliser une technique de blanchiment photographique continu (CPB) 13, 15 pour mesurer la constante de diffusion des lipides de traceur dans la bicouche. Cette observation est de préférence faite juste après le dépôt SLB. Remarque: Afin de quantifier la constante de diffusion, deux paramètres sont mesurés pendant le processus de CPB: le temps de blanchiment spécifique du colorant (tendue) et la longueur de décroissance du profil de fluorescence du halo formé autour de la zone blanchie (Taud). La première est obtenue en traçant l&#39;évolution temporelle de l&#39;intensité de fluorescence au centre du champ lumineux au cours du processus CPB. La seconde est obtenue en traçant le profil d&#39;intensité au niveau du bord de la zone éclairée (moyenne sur 12 lignes et 5 images après l&#39;état d&#39;équilibre est atteint). Les courbes sont montées pour obtenir et Taut taud. La constante de diffusion est donnée par tauD 2 / tendu (D = <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55060/55060eq1.jpg" /> ). </li></ol></li></ol>

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<li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+integrin+binding+to+Arg-Gly-Asp+peptide+activates+actin+polymerization+and+contractile+movement+that+stimulates+outward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les étapes critiques dans le protocole décrit ci-dessus sont liées à la formation des points de nano-protéines ou de l&#39;arrière-remplissage de l&#39;espace autour des points par une bicouche lipidique supportée. La première étape critique par rapport à des points de nano-protéine est la préparation du bourrelet masque. Le nettoyage du couvercle de glissière est critique. Les lames doivent être soit nettoyée avec une solution de détergent qui est recommandé pour le nettoyage des cuvettes en quartz, ou avec un plasma d...

<html> L&#39;adhésion cellulaire a lieu par l&#39;intermédiaire des molécules d&#39;adhésion de cellules spécialisées (CAMs), des protéines présentes sur la membrane cellulaire qui sont capables de se lier à leur homologue sur la matrice extra-cellulaire ou sur une autre cellule. Sur les cellules adhérées, la plupart des molécules d&#39;adhésion , y compris l&#39;intégrine ubiquitaire et cadhérine, se trouvent sous la forme de groupes 1. L&#39;interaction des lymphocytes T (cellules T) avec des cellules présentant l&#39;antigène (APC) fournit une illustration particulièrement frappante de l&#39;importance des amas de récepteurs formés à l&#39;interface entre les deux cellules - souvent appelé une synapse immunologique. Lors de la formation du premier contact avec les APC, les récepteurs des cellules T (TCR) sur la surface de la forme de cellules T microns grappes d&#39;échelle qui servent de plates - formes de signalisation 2, 3, 4, et sont finalement centralisé pour former un cluster supramoléculaire centrale plus grande (cSMAC )lass = &quot;xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Récemment, il a été montré que, du côté APC, les ligands de TCR sont également regroupés 8. Dans le contexte de l&#39; interaction des cellules T-APC, le déploiement de systèmes hybrides, où l&#39;APC est imitée par une surface artificielle fonctionnalisés avec des protéines pertinentes, a considérablement fait progresser notre compréhension de l&#39;interface synaptique 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Dans ce contexte, il est très utile pour concevoir des surfaces APC mimétiques qui capturent un ou plusieurs aspects de la cellule cible. Par exemple, si les ligands sont greffés sur bicouches lipidiques pris en charge, ils peuvent diffuser dans le plan de la double couche, imiter la situation sur la surface APC et en même temps permettre la formation ducSMAC 6, 7. De même, les clusters sur l&#39;APC ont été mimé par la création d&#39; îlots de ligands dans une mer de polymères 9, 10, 11, 12, 13, 14. Cependant, ces deux caractéristiques ont jusqu&#39;à présent pas été combinées. Nous décrivons ici une nouvelle technique pour créer des nano-points de l&#39;anti-CD3 (un anticorps qui cible le complexe TCR) entouré par une bicouche lipidique avec des lipides diffusants. La bicouche est déposé à l&#39; aide de Langmuir-Blodgett / technique de Langmuir-Schaefer 7, 15, 16 et , si on le souhaite, peut être fonctionnalisé avec une protéine spécifique - par exemple, le ligand de l&#39;intégrine de la cellule T (appelé ICAM - 1). De plus, les points de protéine anti-CD3 COUld être remplacé par un autre anticorps ou CAM. Alors que nous avons choisi les protéines pour une utilisation future en tant que plate-forme pour les études d&#39;adhésion des cellules T, la stratégie ici détaillée peut être adaptée pour toute protéine et même l&#39;ADN.

<table><tbody><tr><td>Lamelles en verre</td><td>Assistent, Karl Hecht KG&nbsp ;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chambre d’observation</td> Concentré <td>de</td> tensioactif alcalin fait <td></td><td></td>maison</tr><tr><td>(Hellmanex)</td><td>Hella Analytics</td><td>9-307-011-4-507</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-sonicateur</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dessiccateur</td><td>Labbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cristalliseur&nbsp ;</td><td>Shott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidine</td><td>Thermo Fischer Scientifique</td><td>84607</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp ;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Eau MQ&nbsp ;</td><td>ELGA, Veolia France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perles de silice</td><td>Corpuscular Inc</td><td>147114-10</td><td></td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Biotine</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Dansyl-PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810330C</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Seringue</td> étanche <td>au gaz 650471</td><td></td>Sigma-aldrich</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Dominique Dustcher , France</td><td>74453</td><td></td></tr><tr><td>Balance de film</td><td>NIMA</td><td>Medium</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td>Système</td><td></td>TIRF-III</tr><tr><td>Cible en aluminium&nbsp ;</td><td>Kurt J. Lesker Compagny, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système de pulvérisation cathodique magnétron radiofréquence ; me&nbsp ;</td><td>Outil SMC 600 modifié par ALCATEL, France</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nano-ligand arrays cluster dans un pris en charge lipid bicouches

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

À l&#39;heure actuelle, il y a un intérêt considérable dans la création de réseaux ordonnés d&#39;îlots de protéines adhésives dans une mer de surface passivée pour les études biologiques cellulaires. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus clair que les cellules vivantes répondent, non seulement à la nature biochimique des molécules qui leur sont présentées, mais aussi à la façon dont ces molécules sont présentées. Création de micro-motifs de protéines est donc maintenant la norme dans de nombreux laboratoires de biologie; nano-modèles sont également plus accessibles. Cependant, dans le contexte des interactions cellule-cellule, il est nécessaire de modèle non seulement des protéines, mais aussi des bicouches lipidiques. Un tel double patterning proteo-est jusqu&#39;à présent lipidique pas été facilement accessible. Nous vous proposons une technique facile pour créer des protéines nano-points pris en charge sur le verre et de proposer une méthode pour remblayer l&#39;espace inter-points avec une bicouche lipidique pris en charge (SLB). De photo-blanchiment de lipides fluorescents traceur inclus dans le SLB, nous démontrons que la double couche présente beaucoup en plane fluidité. Fonctionnaliser les points de protéines avec des groupes fluorescents permet d&#39;imager eux et de montrer qu&#39;ils sont ordonnés dans un réseau hexagonal régulier. La taille de point typique est d&#39;environ 800 nm et l&#39;espacement montré ici est de 2 microns. Ces substrats sont censés servir de plates-formes utiles pour l&#39;adhésion cellulaire, la migration et les études mécano-détection.

Les images de fluorescence ont été analysés pour mesurer l&#39;espacement et la taille des points. Espacement typique a été trouvé que 1 900 ± 80 nm et typiquement la taille des points est de 600 ± 100 nm (figure 1g). L&#39;espacement est défini par la taille des billes utilisées pour le masque. Le point de taille est fixé par le bourrelet de taille, ainsi que des conditions de dépôt. Le SLB est déposé uniquement autour des points de protéines et pas sur eux (fig...

Nous présentons un protocole pour fonctionnaliser verre avec des taches de protéines nanométriques entourées par une bicouche lipidique fluide. Ces substrats sont compatibles avec la microscopie optique de pointe et devraient servir de plate-forme pour les études d&#39;adhésion cellulaire et la migration.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

L'objectif général de cette technique est de fabriquer un réseau de nano-agrégats protéiques dans un bicouche lipidique supportée, compatible avec des techniques de microscopie de surface sensibles pour des applications en biologie cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique cellulaire, notamment à savoir comment le nano-assemblage des ligands influence l'activation et l'adhésion des lymphocytes T. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est facilement reproductible dans un laboratoire de biophysique standard et qu'elle est compatible avec des techniques avancées de microscopie sensible à la surface, telles que la microscopie par fluorescence induite par réflexion totale (TIRF) et la microscopie par contraste interférentiel de réflexion (RICM).Bien que cette technique soit conçue pour fournir des informations en immunologie, elle peut être appliquée à d'autres types cellulaires avec des applications potentielles en biologie cellulaire, en oncologie et en génie tissulaire. Pour commencer cette procédure, nettoyez les lamelles en verre et les chambres d'observation comme indiqué dans le protocole écrit. Ensuite,

ligand-nano-cluster-arrays-in-a-supported-lipid-bilayer

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Cette vidéo décrit la technique d’étude de l’assemblage de la protéine septine sur des microsphères recouvertes de bicouches lipidiques. Cette technique aide à comprendre les assemblages de protéines dépendants de la courbure sur des surfaces courbes.

Dosage de la bicouche lipidique à support sphérique : une technique pour observer l’assemblage de la septine sur des microsphères

Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.

Formation de biomembrane puces à ADN avec une méthode Assemblée basée à raclette

Nous rapportons une application intelligente des nanotubes de carbone pour la stabilisation cinétique des particules lipidiques qui contiennent des nanostructures auto-assemblées dans leurs noyaux. La préparation de particules lipidiques nécessite des concentrations plutôt faibles de nanotubes de carbone, ce qui permet leur utilisation dans des applications biomédicales telles que l’administration de médicaments.

Préparation Facile d&#39;intérieur auto-assemblées particules lipides stabilisés par des nanotubes de carbone

Nous démontrons un système stockable, transportable lipidique formation bicouche. Une membrane lipidique à deux couches peut être formée à l'intérieur de 1 heure avec un taux de succès supérieur à 80% lors d'un précurseur de membrane congelée est ramené à température ambiante. Ce système permettra de réduire les processus laborieux et expertise associés aux canaux ioniques.

Formation automatisée Lipid bicouche Membrane Utilisation d&#39;un Thin Film Polydiméthylsiloxane

De nombreuses protéines remplissent leur fonction lorsqu’elles sont attachées à des surfaces membranaires. La liaison des protéines extrinsèques sur les membranes des nanodisques peut être imagée indirectement par microscopie électronique à transmission. Nous montrons que l’empilement caractéristique (rouleau) des nanodisques induit par la coloration négative phosphotungstate de sodium est empêché par la liaison de protéines extrinsèques.

Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.

Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante

Nous rapportons un protocole pour produire une membrane hybride de lipide à l’interface eau/air en dopant la bicouche lipidique avec des molécules de cuivre (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-phthalocyanine (CuPc). La membrane lipidique hybride résultante a une structure lipidique/CuPc/lipide de sandwich. Ce protocole peut également être appliqué à la formation d’autres nanomatériaux fonctionnels.

Auto-assemblage de membranes lipidiques hybrides dopées de molécules organiques hydrophobes à l’interface eau/air

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Les monocouches lipidiques sont utilisées comme base pour former des cristaux de protéines bidimensionnelles (2D) pour des études structurelles depuis des décennies. Ils sont stables à l’interface air-eau et peuvent servir de matériau de support mince pour l’imagerie électronique. Nous présentons ici les étapes éprouvées de la préparation des monocouches lipidiques pour les études biologiques.

Préparation d’échantillons à l’aide d’une méthode monocouche lipidique pour les études cristallographiques électroniques

Ici, un système bicouche lipidique soutenu par nanobar est développé pour fournir une membrane synthétique avec une courbure définie qui permet la caractérisation de protéines ayant une capacité de détection de courbure in vitro.

Système bicouche lipidique supporté par nanobar pour l’étude in vitro de protéines de détection de courbure membranaire

Ici, un protocole est décrit pour générer des motifs protéiques régulés par la lumière et réversibles avec une grande précision spatio-temporelle au niveau de membranes lipidiques artificielles. La méthode consiste en la photoactivation localisée de la protéine iLID (dimère inductible par la lumière améliorée) immobilisée sur des membranes modèles qui, sous la lumière bleue, se lie à sa protéine partenaire Nano (SspB de type sauvage).

Motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles

Découvrez comment fabriquer des nano-clusters de protéines dans une bicouche lipidique supportée pour étudier l'adhésion cellulaire et l'activation des lymphocytes T. Cette méthode compatible avec la microscopie TIRF et RICM offre des applications en biologie cellulaire, oncologie et ingénierie tissulaire.

Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

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