Nano-Ligand Arrays cluster dans un pris en charge Lipid bicouches

L’objectif global de cette technique est de fabriquer un réseau de nano-clusters de protéines dans une bicouche lipidique supportée, compatible avec les techniques de microscopie de surface sensibles pour les applications de biologie cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique cellulaire, en particulier comment le nano-regroupement des ligands influence l’activation et l’adhésion des lymphocytes T. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est facilement reproductible dans un laboratoire biophysique standard et qu’elle est compatible avec les techniques de microscopie sensibles aux surfaces avancées, telles que TIRF et RICM.

Bien que cette technique soit conçue pour donner un aperçu de l’immunologie, elle peut être appliquée à d’autres types de cellules avec des applications potentielles en biologie cellulaire, en oncologie et en ingénierie tissulaire. Pour commencer cette procédure, nettoyez les lames de verre et les chambres d’observation comme indiqué dans le protocole de texte. Ensuite, déposez 70 microlitres de suspension de billes de silice à 2 % goutte à goutte sur une lame de couverture maintenue à une inclinaison de 15 degrés.

Retournez le verre de 90 degrés toutes les 15 secondes pendant une minute pendant que les suspensions sèchent. Il est essentiel de créer une monocouche de billes serrée et d’éviter la formation de multicouches et d’amas d’huile. C’est pourquoi la concentration et le volume de la solution de billes ainsi que l’hydrophilie de la lame doivent être optimisés.

Une fois le liquide évaporé, placez la glissière à l’intérieur d’un dispositif de pulvérisation cathodique à radiofréquence sur une table rotative située à 105 millimètres d’une cible en aluminium et en silicium. Après cela, utilisez une pompe turbomoléculaire pour diminuer la pression dans la chambre de dépôt à 2,6 fois 10 puissance moins quatrièmes pascals. Introduire une atmosphère d’argon pur avec un flux de 10 centimètres cubes standard par minute et une pression de 0,8 pascal.

Ensuite, allumez le générateur d’énergie à radiofréquence. Une fois le plasma stabilisé, pulvérisez pendant deux minutes tout en gardant l’obturateur fermé, pour éliminer les éventuelles impuretés de la surface cible. Ouvrez l’obturateur et laissez la pulvérisation se poursuivre pendant 60 minutes pour déposer une couche d’aluminium de 200 nanomètres d’épaisseur sur la glissière.

Coupez ensuite le flux d’argon. Fermez le robinet-vanne pour isoler la pompe turbomoléculaire de la chambre de dépôt. Après cela, aérez la chambre avec de l’azote propre pour atteindre la pression ambiante.

Récupérez la lame recouverte d’aluminium de la chambre. Immergez la lame récupérée dans de l’eau ultra-pure à température ambiante et de l’ultra-sonicate à 50 watts et 50 hertz pendant 30 secondes. Ensuite, déposez 0,5 millimètres d’APTES au fond d’un dessiccateur.

Placez la lame de verre sur une grille en céramique. Placez la grille dans le dessiccateur. Connectez le dessiccateur à une pompe à membrane.

Faites ensuite fonctionner la pompe à puissance maximale pendant 30 minutes pour générer un vide faible. Fermez la vanne du dessiccateur et éteignez la pompe. Chauffer à 50 degrés Celsius pendant une heure.

Après cela, ouvrez le dessiccateur et récupérez la lame. Placez la lame collectée sur un support en PTFE. Déposez 2 millilitres de 25 microgrammes par millilitre de biotine dissoute dans du PBS.

Laissez reposer la lame pendant 30 minutes à température ambiante. Rincez ensuite 10 fois avec du PBS. Incuber la lame dans une solution d’hydroxyde de sodium et de PBS à température ambiante pendant la nuit.

Après cela, rincez la lame 10 fois avec de l’eau ultra-pure. Après avoir nettoyé l’auge Langmuir, placez les plateaux en PTFE dans l’enceinte en PTFE de l’auge. Remplissez-le ensuite d’eau ultra-pure.

Réglez la pression mesurée à zéro millinewton par mètre. À l’aide d’une seringue métallique en verre étanche au gaz, déposez 30 microlitres de 1 milligramme par millimètre de DOPC et de solution de chloroforme à la surface de l’eau. Fermez la barrière PTFE jusqu’à ce que la pression souhaitée de 27 millinewtons par mètre soit atteinte pour comprimer la monocouche lipidique.

Ensuite, à l’aide d’une pince motorisée, trempez la glissière en verre préparée dans le boîtier en PTFE. Tenez la glissière dans la pince perpendiculairement à l’interface air-eau. Soulevez la glissière à travers l’interface à une vitesse de 15 millimètres par minute tout en maintenant une pression constante de 27 millinewtons par mètre.

Ensuite, placez la lame de verre horizontalement à la surface de l’eau au-dessus d’un plateau en PTFE. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler métallique, enfoncez la glissière dans le plateau en PTFE, en l’immergeant dans l’eau ultra-pure. À l’aide de la pince à épiler, transférez le plateau en PTFE contenant la lame dans un cristalliseur rempli d’eau ultra-pure.

Transférez la lame revêtue sous l’eau dans une chambre d’observation. Après cela, fermez la chambre en vous assurant qu’environ 1 millilitre d’eau est piégé à l’intérieur. Une autre étape délicate est l’assemblage de la chambre d’échantillonnage sous l’eau.

Et il faut absolument éviter le contact avec l’air des bicouches déposées, donc pour s’en assurer, utilisez un grand volume d’eau et assurez-vous que tout le processus d’assemblage peut se dérouler sous l’eau. Retirez la chambre assemblée de l’eau, assurez-vous que la chambre est étanche et exempte de fuites. Ajoutez 500 microlitres de PBS, puis retirez 500 microlitres de liquide de la chambre.

Répétez ce processus 10 fois pour remplacer complètement le millilitre d’eau ultra-pure dans la chambre par du PBS. Ensuite, introduisez 100 microgrammes par millilitre d’albumen sérique bovin dans la chambre d’observation. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes.

Après cela, rincez la bicouche en retirant et en ajoutant 500 microlitres de la chambre, 10 fois. Ensuite, fonctionnalisez avec des ligands, déposez des cellules et observez le nanomotif protéolipipide et la fluidité SLB comme indiqué dans le protocole de texte. Dans ce protocole, un masque à billes est utilisé pour créer un masque métallique secondaire par dépôt contrôlé d’aluminium.

Ensuite, le masque de perles est retiré, laissant une couche d’aluminium avec des trous. Ensuite, une organo-amino siline, appelée APTES, est déposée en phase vapeur, suivie d’un dépôt de BSA-Biotine en phase aqueuse. Ensuite, l’aluminium est retiré, révélant des taches de protéines nanométriques.

Enfin, l’espace inter-points est remblayé par une bicouche lipidique soutenue. Des images d’épifluorescence sont ensuite prises des nano-points et de la bicouche lipidique soutenue. Une image composite montre une complémentarité parfaite avec la bicouche lipidique déposée uniquement autour des points de protéines, mais pas sur ceux-ci.

Dans une image d’épifluorescence d’une bicouche lipidique soutenue fraîchement déposée, les points de protéines apparaissent comme des taches sombres dans une mer brillante de lipides. Cependant, après un photoblanchiment continu pendant 50 secondes, l’image montre un halo à l’intérieur de la région délimitée par le diaphragme de champ, indiquant que les lipides sont mobiles. L’analyse du profil d’intensité moyenne le long du bord du diaphragme de champ, et de la décroissance de cette intensité au fil du temps pendant le processus de blanchiment, révèle que la constante de diffusion est de cinq micromètres carrés par seconde.

Cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est effectuée correctement. Il est important de maintenir des conditions très propres pendant le dépôt d’aluminium et de calibrer soigneusement la courbe de dépôt. À la suite de cette procédure, la diapositive à motifs peut être davantage fonctionnalisée.

Par exemple, en ajoutant une autre biomolécule dans la bicouche. Nous l’utilisons pour imiter l’antigène des cellules mangeuses de plantes, afin d’étudier l’activation des lymphocytes T. Ainsi, après son développement, cette technique devrait intéresser des publics divers.

Par exemple, les ingénieurs tissulaires peuvent vouloir l’utiliser comme échafaudage pour cultiver des tissus artificiels, et les oncologues peuvent l’utiliser comme une plate-forme pour poser des questions fondamentales sur l’ajout de cellules cancéreuses. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de fabriquer une zone de nano-clusters de protéines dans une bicouche lipidique supportée, ce qui est compatible avec une technique de microscopie avancée. Bien que nous l’utilisions pour étudier les lymphocytes T, nous pensons que ce substrat a le potentiel de devenir la plate-forme de choix pour étudier l’interaction de tout type de cellules avec une membrane protéolipipique contrôlée.