Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines

L'objectif général de ce protocole est de formuler des technologies permettant une transduction génique réussie dans les cellules tueuses naturelles primaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'immunothérapie, comme l'effet de la modification génétique sur les lymphocytes effecteurs, tels que les cellules tueuses naturelles, ou cellules NK. Le principal avantage de cette technique réside dans l'expression efficace d'un gène d'intérêt dans des cellules NK primaires de souris ou humaines.

Après avoir préparé et titré les vecteurs lentiviraux conformément au protocole décrit, purifiez les cellules NK primaires murines en faisant passer des suspensions cellulaires uniques de rate à travers des colonnes en laine de nylon afin de dépléter les populations adhérentes composées de cellules B et de macrophages. Utilisez 1 000 unités par millilitre d'interleukine-2 dans du milieu complet RPMI1640 pour cultiver la population non adhérente contenant les cellules NK. Au quatrième jour de culture, remplacez le milieu en utilisant 20 millilitres de milieu complet RPMI1640 et 1 000 unités par millilitre d'IL-2 afin d'éliminer les cellules T et NKT non adhérentes.

Le septième jour, utilisez des marqueurs spécifiques aux cellules NK pour vérifier la pureté des cellules NK murines par cytométrie en flux, en utilisant des préparations contenant plus de 95 % de population négative pour CD3 et positive pour NK1.1. Pour isoler les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, déposez soigneusement 35 millilitres de cellules diluées de moitié sur un gradient de densité de 15 millilitres dans un tube conique de 50 millilitres. Effectuez une centrifugation du gradient dans un rotor à godets oscillants à 400 × g et à 20 °C pendant 30 minutes sans frein.

Après avoir purifié les cellules NK primaires humaines selon le protocole décrit, déterminer la pureté des cellules en ajoutant deux microgrammes par millilitre d'anticorps anti-CD3 et deux microgrammes par millilitre d'anticorps anti-CD56. Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Utiliser du PBS pour laver les cellules deux fois.

Ensuite, analyser les cellules par cytométrie en flux. La population de cellules NK sera positive pour le CD56 à la surface cellulaire et négative pour le CD3. Suspendre les cellules NK primaires de souris ou humaines dans les puits d'une plaque de 24 puits à 0,5 fois 10⁵ par millilitre de milieu avec le surnageant de lentivirus GFP, à un NLY de cinq, dix et vingt.

Ensuite, en présence de polybrene, de sulfate de protamine ou de dextran, centrifuger les plaques à 1 000 × g pendant 60 minutes. Puis, sans décantation du surnageant, cultiver les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius enrichi en 5,2 % de dioxyde de carbone.

Après avoir lavé les cellules avec 10 millilitres de PBS, utilisez deux millilitres de milieu RPMI1640 contenant de l'IL-2 pour resuspendre les cellules. La veille de la récolte des cellules, recouvrez des plaques en polystyrène hautement absorbantes de 96 puits avec des anticorps monoclonaux anti-MKG2D à une concentration de 2,5 microgrammes par millilitre et incubez les plaques à température ambiante ou au réfrigérateur toute la nuit.

Le jour suivant, utiliser 100 microlitres de PBS pour laver chaque puits trois fois. Récolter les cellules NK transduites en tapotant doucement les plaques, puis ajouter 100 microlitres des cellules dans chaque puits des plaques de 96 puits. De 16 à 18 heures après l'activation, utiliser une pipette multipuits pour collecter les surnageants.

Ensuite, à l'aide du cytokine recombinant provenant d'un kit ELISA, générer une courbe standard et quantifier les cytokines, telles que l'interféron gamma, dans le surnageant. Pour évaluer la viabilité des cellules NK, quatre jours après la transduction, laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS froid. Puis, récolter les cellules et les colorer à l'aide de l'XM5 7-aminoactinomycine D.

Utilisez la cytométrie en flux pour déterminer le pourcentage de cellules nécrotiques parmi les cellules NK transformées, puis analysez les données conformément au protocole décrit dans le texte. Cette figure montre que les cellules NK humaines incubées avec l'IL-2 recombinante, puis transduites avec un lentivirus exprimant la GFP, ont atteint une efficacité de transduction plus élevée et une augmentation du titre viral lorsque du dextran a été ajouté au milieu de culture, par rapport à l'ajout de polybrene ou de sulfate de protamine. Comme on le voit ici, des résultats similaires ont été obtenus avec les cellules NK murines, où le dextran améliore l'efficacité des vecteurs lentiviraux par rapport au polybrene ou au sulfate de protamine.

Dans cette expérience, la capacité cytotoxique des cellules NK primaires transduites a été examinée par un dosage de libération de CR contre K562 et YAC-1 en tant que cellules cibles. La transduction des cellules NK par la dextrane n'altère pas négativement le potentiel de destruction des cellules NK transformées par rapport aux cellules NK non transduites. Ici, des cellules NK primaires humaines transduites ont été cultivées en co-culture avec K562 pendant 24 heures, et les surnageants ont été collectés pour mesurer l'interféron gamma.

Les résultats indiquent que le dextran n'a aucun effet sur la capacité des cellules NK transduites à produire des cytokines. En outre, une validation indépendante a montré que les cellules NK traitées au dextran et activées avec des anticorps monoclonaux anti-NKG2DA10 fixés sur plaque étaient toujours capables de produire la cytokine interféron gamma. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de centrifuger les cellules transduites.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes comme la transfection peuvent s'avérer très utiles pour répondre à des questions supplémentaires, telles que la manière d'améliorer la livraison des gènes. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'immunologie, leur permettant d'explorer la manipulation génétique des cellules NK. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transduire des cellules NK.