Name: Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Découvrez une méthode d'infection intrabronchique non chirurgicale pour établir une pneumonie bactérienne robuste chez les rongeurs immunocompétents. Cette technique permet d'évaluer l'efficacité des traitements antibactériens dans un modèle pertinent de pneumonie sévère.

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JH souhaite remercier mentor, ami et ancien directeur Valerie Berry pour la première nous enseigne ce modèle; et Gary Woodnutt, qui nous a appris les bases de et a inspiré notre engagement dans le domaine des antibactérienne PK / PD. Tous les auteurs tiennent à remercier David Payne pour son soutien et l&#39;appréciation de notre science. Nous tenons à remercier notre ancien dans collègues de microbiologie in vivo qui ont contribué à l&#39;ensemble des données générées en utilisant ces méthodes, en particulier Pete DeMarsh, Rob Straub, Roni page et Nerissa Simon. Enfin, nos remerciements vont à nos collègues in vitro de microbiologie pour leur aide, en particulier pour fournir toutes les CMI , nous demandons (Lynn McCloskey, Josh Ouest et Sharon Min); et pour notre équipe de microbiologie clinique qui fournit des conseils d&#39;experts et de soutien (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman et Deborah Butler).

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<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs sont tous payés les employés de GlaxoSmithKline Pharmaceuticals et actions propres d&#39;actions au sein de l&#39;entreprise.

Pour une réussite optimale dans la reproduction de ce modèle d&#39;infection, les suggestions suivantes devraient être envisagées. Virulence des nouveaux isolats peut être améliorée par passage 2 - 3 fois in vivo avant l&#39;utilisation dans une étude. Souches bactériennes congelées doivent toujours être préparés à partir d&#39; une source primaire -derived in vivo avec le moins de passages que possible de l&#39;original, et regel ou réutilisation de stock décongelé est découragé. En utilisant des isolats cliniques récents récupéré des patients atteints de pneumonie, et / ou la préparation des cultures en phase de croissance log peut également aider à améliorer la mise en place de l&#39;infection. Une dilution de cinq fois dans la gélose (par exemple 2 ml de solution saline suspension ajoutée à 8 ml de gélose) peut être utilisé au lieu de dix fois pour augmenter l&#39;inoculum bactérien, et le volume de l&#39; inoculum peut être ajustée en fonction de la taille de l&#39;animal (par exemple 200 pi / animal est habituellement inoculés dans 250 g de rats). Avant l&#39;addition de la suspension bactérienne dans la solution saléeagar - agar ( par exemple à l&#39; étape 2.3), la densité bactérienne peut être prévue ou estimée par une inspection visuelle, des normes MacFarland ou des mesures de densité optique. Il est utile de se familiariser avec les caractéristiques in vitro de croissance pour chaque isolat avant de procéder à des expériences in vivo. La cohérence de la croissance et de la manipulation permet l&#39;estimation la plus précise de la densité bactérienne pour tout isolat donné. des procédés microbiologiques classiques qui diffèrent de ceux décrits, tels que les médias et les homogénéisateurs de tissus de remplacement, peuvent être utilisés le cas échéant pour la préparation des inoculums et la numération des bactéries dans les tissus infectés. Il est fortement recommandé de préparer ou de faire fondre la gélose le jour avant l&#39;expérience et le stocker pendant une nuit dans un bain d&#39;eau séparé réglé à 50 ° C. Cela simplifiera le processus et aider à se prémunir contre l&#39;agar étant trop chaud au moment de l&#39;infection. Une température de 41 - 42 ° C permet d&#39;obtenir un bon équilibre entre entretenir cetning la gélose à l&#39;état liquide sans être trop chaud pour la survie des bactéries à court terme. Comme une alternative possible à la gélose nutritive, la gélose noble a été utilisé avec succès dans certaines expériences. Un tube d&#39;agar inoculum est généralement suffisant pour une expérience entière (et recommandé), mais plusieurs tubes peut être préparé pour infecter un grand nombre d&#39;animaux (par exemple , plus de 60) ou lorsque le processus infectant prend plus de 30 - 45 min Si tubes d&#39;inoculum multiples sont nécessaires, ajouter la suspension bactérienne saline à chaque tube d&#39;agar comme il est nécessaire. Cela réduit le risque que la survie des bactéries et / ou remise en forme seront affectés par une exposition prolongée à une température élevée avant l&#39;inoculation. Il convient de noter que l&#39;utilisation de plusieurs tubes d&#39;inoculum peuvent également nécessiter des procédures de randomisation des animaux supplémentaires. Chaque fois que possible, d&#39;infecter tous les animaux de la même préparation de l&#39;inoculum. Il est recommandé d&#39;adapter la taille des expériences au niveau actuel de compétence avec le technique. Un scientifique qualifié peut intuber et inoculer un animal en moins de 30 s et ensemencer jusqu&#39;à 5 - 6 animaux par lot (ie avec une seringue pleine d&#39;inoculum agar). Pour ceux apprentissage de la technique, la vitesse est importante que la gélose commencera à se solidifier; cependant, un positionnement précis de l&#39;inoculum est plus important. Commencez avec 1 ou 2 animaux par lot, et augmentera à mesure que la technique devient plus familier. Les animaux continuent à respirer pendant l&#39;intubation; Ainsi, la fenêtre de temps pour l&#39;inoculation dépend de la rapidité avec laquelle l&#39;animal récupère de l&#39;isoflurane, qui doit être d&#39;environ 2-3 min. Les animaux qui se réveillent au cours du processus peuvent être ré-anesthésiés et ont tenté une deuxième fois, mais il est déconseillé de le faire à plusieurs reprises. inoculation réussie au premier essai est prévu dans presque 100% des animaux une fois la compétence est atteint. A noter qu&#39;il est plus facile d&#39;apprendre la technique en utilisant des rats en premier lieu; les souris sont plus délicates et les plus petits aussils sont plus sujettes à un blocage avec de l&#39;agar solidifié sinon manipulé rapidement. seringues pré-réchauffement, tubes et salins ainsi que du maintien du dispositif d&#39;intubation sur une surface tiède (pas chaude), comme un coussin chauffant à basse température, peuvent aider à prévenir la solidification de l&#39;agar-agar. Lors de l&#39;apprentissage de la technique, il est également utile de mettre en pratique le positionnement correct de l&#39;inoculum à l&#39;aide d&#39;un colorant de couleur foncée (par exemple, on concentre le bleu de méthylène), au lieu de la suspension bactérienne dans la gélose. Effectuer la procédure comme décrit, mais euthanasier l&#39;animal immédiatement après l&#39;inoculation du colorant (ne permettant pas l&#39;animal de récupérer entre l&#39;anesthésie et l&#39;euthanasie). Disséquer pour déterminer où le colorant a été placé, et ajuster la technique en conséquence. Le critère principal de ce modèle est CFU des poumons infectés. La survie est pas un bon indicateur de la charge bactérienne et ne constitue pas un critère recommandé. Pour les études d&#39;efficacité, a suggéré le N est 5 - 6 animaux par groupe comme cela est predicted ≥1 pour détecter les différences de log 10 UFC entre les groupes d&#39;au moins 90% de la puissance. Les animaux peuvent être infectés dans des groupes tels que les compagnons de cage restent ensemble, ou un véritable processus de randomisation peuvent être suivies. Notez que si les groupes sont affectés par cage, les groupes devraient être infectés dans un ordre aléatoire avec des contrôles de croissance de fin d&#39;étude infectées dernière (pour confirmer que la survie bactérienne / remise en forme n&#39;a pas été affectée par la durée de l&#39;exposition à une température élevée dans le bain d&#39;eau). Aucune méthode de censure de données devrait être nécessaire, et aucun sont recommandés à l&#39;exception de la suppression immédiate de tout animal qui a été évidemment mis-inoculés au début de l&#39;étude (avant le début de tout traitement). Les animaux qui sont euthanasiés avant la fin de l&#39;étude devraient être échantillonnés et les résultats inclus dans l&#39;ensemble , sauf si une raison valable d&#39;exclusion a été identifiée de façon prospective les données (ie un événement sans rapport avec l&#39;infection ou le traitement). report de la drogue peut affect quelques échantillons et est une considération importante pour tous les modèles in vivo d&#39;infection. Si un composé est donnée fréquemment, à proximité du moment de l&#39; euthanasie ou a une longue demi-vie, il peut être présent dans l&#39;homogénat de tissu à une concentration suffisamment élevée pour continuer de tuer les bactéries ex vivo au cours du processus de dénombrement des bactéries (dilution et plaquage les échantillons ou sur les plaques d&#39;agar pendant une nuit d&#39;incubation). Pour éviter cela, le charbon actif et / ou un additif qui dégrade la molécule active sans léser les cellules bactériennes peuvent être ajoutés à l&#39;échantillon avant l&#39;homogénéisation. D&#39;autres procédés comprennent la centrifugation des échantillons pour éliminer la majorité du composé actif (qui doit rester dans le surnageant) et en utilisant une dilution différente et le placage des systèmes pour diluer suffisamment du composé actif à une concentration non inhibitrice. Comme en témoignent les exemples de la figure 2, ce modèle avec succès induces infections pulmonaires chez les rongeurs avec un large éventail d&#39;organismes , y compris ceux qui ne poussent pas bien dans d&#39; autres modèles (par exemple H. influenzae). Ces infections sont cohérentes et reproductibles, ce qui réduit la probabilité que les expériences devront être répétées en raison de l&#39;échec du modèle et / ou de mauvaises performances avec un isolat donné. Bien que les animaux sont immunocompétent, ils sont incapables de résoudre rapidement l&#39;infection, le cas échéant. Cela permet une plus grande souplesse dans la durée de l&#39;étude, car de nombreux isolats de maintenir une infection par viable au moins 96 heures sans la nécessité d&#39;injections répétées pour maintenir une neutropénie. L&#39;avantage potentiel d&#39;étudier l&#39; efficacité antibactérienne chez les animaux immunocompétents a été noté précédemment 20, 21, et il est évident que, pour certains composés (par exemple oxazolidinones), les données de rongeurs non neutropéniques peuvent prédire plus précisément les objectifs de l&#39; exposition humaine par rapport à ceux neutropénique rendu 5. L&#39;utilitaire polyvalent de til modèle est démontré dans les figures 3 et 4 et les tableaux 1 et 2. Ces études font partie d&#39;une grande collection de données publiées et non publiées qui a été généré avec ce modèle pour soutenir les efforts d&#39;optimisation de plomb 16, 17, 22-24, à titre de comparaison et la confirmation de la proposition de dosage humain schémas 19, 25-29 et PK / PD caractérisation 18, 30-32 .While ce modèle est d&#39; abord plus complexe à réaliser par rapport à la méthode intranasale par inhalation, il existe de nombreux avantages tels que décrits ci - dessus. Avec la pratique et l&#39;utilisation de routine, les techniques devraient être simples à effectuer. On peut noter dans certaines études que la charge bactérienne à l&#39;inclusion était inférieure à celle généralement ciblée dans d&#39;autres modèles d&#39;infection pulmonaire. Cela est dû en grande partie à la dilution requise dans de la gélose et le petit volume de défi, en particulier chez la souris. Toutefois, il convient également de noterque la croissance bactérienne a été observée dans tous les cas, même lorsque la charge initiale était relativement faible. La charge bactérienne initiale de la cible est de 6 à 6,5 log 10 UFC / poumons (6,8 à 7,3 log 10 UFC / g de tissu chez des souris sur la base du poids des poumons en moyenne) ce qui correspond à des densités estimées chez les patients humains atteints de pneumonie sévère 33. Une charge initiale plus élevée peut être obtenue en concentrant davantage l&#39;inoculum bactérien ou retarder le début de l&#39;administration du composé pour permettre la croissance bactérienne supplémentaire; Cependant, l&#39; augmentation de la charge de défi trop peut conduire à une maladie anormalement sévère et aiguë (c. -à mort en moins de 24 h) qui est réfractaire à tous les traitements antibactériens , indépendamment de la sensibilité. Bien que l&#39;inoculum est d&#39;abord placé de préférence dans le poumon gauche de l&#39;animal, l&#39;infection se propage généralement dans les deux poumons. maladie progressive du poumon, de la diffusion des bactéries à d&#39;autres organes, et la morbidité éventuelle est souvent observed avec S. pneumoniae, K. pneumoniae et P. aeruginosa. Fait intéressant, les infections à H. influenzae et A. baumannii sont généralement plus contenu et conduisent rarement à la mort à l&#39;inoculum bactérien prescrit. Les résultats d&#39;efficacité obtenus à partir de ce modèle ont une bonne corrélation avec les profils de sensibilité in vitro ainsi que des cibles / PD PK définies. La réduction de la charge bactérienne sont régulièrement observés pour les isolats considérés comme sensibles à l&#39;agent testé, tandis que ceux qui présentent résistant considéré aucun changement ou la croissance bactérienne au-dessus de la ligne de base 16, 17, 19, 24-29. Des études chez le rat évaluant deux quinolones et d&#39; un macrolide à l&#39; aide de ce modèle ont montré que 32 la cible PK / PD requise pour un 1-log 10 de réduction de S. pneumoniae par rapport au niveau de référence en corrélation avec la cible déterminée chez des souris neutropéniques et, plus important encore , avec cibles cliniques pour pneum bactérienne d&#39;origine communautaireonia 6, 7, 34, 35. Gepotidacin, un nouveau mécanisme antibiotique, a été testé contre plusieurs S. pneumoniae et nécessitait une cible PK / PD similaire pour un 1-log 10 diminution de ce modèle d&#39;infection pulmonaire 31 comme celle requise pour un 1-log 10 de réduction dans le modèle de la cuisse neutropénique 36 lorsque la pénétration du poumon a été pris en compte (données sur fichier). De même, les / cibles PD PK déterminées chez la souris pour GSK2251052 contre P. aeruginosa étaient compatibles pour la stase, 1 et 2 log 10 réductions de CFU entre ce modèle de poumon 30 et le modèle d&#39;infection de la cuisse neutropénique lorsque la pénétration du poumon a été considéré comme 37, 38 . La corrélation avec un modèle d&#39;infection pulmonaire neutropénique utilisant l&#39;inoculation intranasale était pauvre; cependant, GSK2251052 n&#39;a pas produit plus d&#39;une réponse statique dans cette étude 38. Cela peut être attribuable à l&#39;inoculum bactérien plus élevé, ce qui était de 8 log 10 UFC / souris par rapport à 6 log <sub&gt; 10 UFC / souris dans la intubation cuisse neutropénique 37 et intratrachéale 30 modèles. La collecte de données telles que ce qui est essentiel pour l&#39;analyse comparative, car il permet une comparaison directe avec des modèles et corrélation avec les données cliniques existantes pour évaluer la capacité prédictive translationnelle. Une utilisation plus répandue du poumon modèle d&#39;infection intubation trachéale fournira des données supplémentaires pour ces types d&#39;analyses. Il existe plusieurs limites de ce modèle de pneumonie immunocompétent. Tout d&#39;abord, il est pas bien adapté à l&#39;évaluation émergence de résistance spontanée parce que l&#39;inoculum bactérien élevé généralement requis pour des résultats d&#39;études en trop sévère une infection. Après les tentatives pour atteindre la charge bactérienne de 7 ou 8 log 10 UFC au départ, la morbidité rapide a été observée ( à savoir les animaux deviennent moribonds en moins de 24 h) malgré un lavage complet de l&#39;inoculum pour éliminer les toxines pré-existantes (données sur fichier). Ilpeut être possible de surmonter ce problème en utilisant de plus grands rongeurs. Les rats, les rats particulièrement lourdes (&gt; 250 g), semblent mieux tolérer inoculums plus élevé par rapport aux souris et peuvent être adaptés à ce type d&#39;étude. Une deuxième limitation est que l&#39;utilisation de l&#39;agar comme une infection-activateur peut empêcher l&#39;utilisation du modèle pour l&#39;évaluation de certains hôte: interactions pathogènes. On croit que l&#39;agar fournit un point focal protégé jusqu&#39;à l&#39;infection est pleinement établie dans le poumon. Il est possible de livrer l&#39;inoculum dans une solution saline plutôt que de l&#39;agar pour aider à surmonter ce problème; cependant, il convient de noter que cela ne provoque une infection avec des isolats. Troisièmement, il y a une courbe d&#39;apprentissage abrupte nécessaire pour devenir compétent dans la technique. La procédure peut être délicate, en particulier chez les souris. Il est facile de placer à tort la canule métallique dans l&#39;œsophage, et une force excessive peut conduire à la perforation soit l&#39;œsophage ou la trachée. le placement minutieux de l&#39;inoculum est égalementnécessaires ou les animaux peuvent soit ne pas récupérer ou non être infectées de manière adéquate. Cependant, avec patience et persévérance, on peut devenir très compétent et effectuer la technique rapidement, en douceur et avec précision. En supprimant l&#39;exigence de la neutropénie, l&#39;augmentation de la robustesse et de la reproductibilité, permettant aux enquêteurs d&#39;étudier plusieurs agents pathogènes et les isolats, l&#39;amélioration de la flexibilité de la conception expérimentale et en fournissant une infection difficile à caractériser la pharmacodynamie pour une pneumonie, ce modèle d&#39;infection pulmonaire immunocompétent ajoute une valeur importante à la découverte des antibiotiques Communauté. L&#39;utilisation accrue de ce modèle par les enquêteurs supplémentaires aidera à fournir l&#39;étalonnage nécessaire pour lui permettre de faire accepter plus largement répandue et continuer à fournir des informations de soutien pour une interprétation appropriée.

L&#39;évaluation de l&#39;efficacité des médicaments candidats potentiels dans les modèles animaux d&#39;infection est une composante essentielle du processus de découverte de médicaments antibactériens. Les études in vivo d&#39;efficacité fournissent des données importantes pour toute la durée des efforts de découverte, de élucidant les relations structure-activité (SAR) et l&#39; optimisation de série chimique de plomb à travers la détermination de pharmacocinétique-pharmacodynamique (PK / PD) caractéristiques des composés et de soutenir la sélection de dose pour la prise de décision développement clinique et l&#39;approbation réglementaire. De nombreux modèles d&#39;infection d&#39;animaux sont décrites dans la littérature pour ces fins. L&#39; un des modèles les plus courants et les plus utilisées est l&#39;infection de la cuisse de la souris neutropénique, qui a été lancée par Aigle 1, 2 et plus tard étendu par Vogelman et Craig 3, 4. Ce modèle a été inestimable pour soutenir la détermination des seuils de sensibilité bactérienne et pour fournir des cibles PK / PD pour guider le dosage humain. Il y a beaucoup examenples où la capacité prédictive de ce modèle a été prouvé 7/4. Cependant, l&#39;un des inconvénients du modèle d&#39;infection de la cuisse est le manque de pertinence directe pour les infections pulmonaires. Il y a maintenant une plus grande importance sur l&#39;adéquation entre le site de l&#39;infection dans des modèles animaux sur le site de l&#39;infection chez l&#39;homme; et, par conséquent, pour étudier des composés pour le traitement de la pneumonie, il est idéal d&#39;utiliser un modèle d&#39;infection pulmonaire chez l&#39;animal. Plusieurs méthodes pour induire des infections pulmonaires chez les animaux de laboratoire ont été décrits et utilisés pour des études d&#39;efficacité anti - bactériens , y compris par voie intranasale par inhalation, par la voie d&#39; aspiration de l&#39; oropharynx, l&#39; exposition à l&#39; aérosol et l&#39; inoculation intra - trachéale chirurgicale 8. Dans de nombreux cas, les animaux (en particulier les souris) doivent d&#39;abord être rendues neutropéniques afin de parvenir à une infection pulmonaire robuste. Malgré cet état sévèrement immunodéprimé, le nombre d&#39;agents pathogènes et de souches bactériennes qui produisent des infections viables chez les rongeurs estlimité. Par exemple, il peut être difficile d&#39;établir avec succès Haemophilus influenzae ou Acinetobacter baumannii dans les modèles de pneumonie 9, 10 et même plus virulent des agents pathogènes tels que Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae, peut poser des problèmes 11-13. En 1991, Smith a décrit un modèle d&#39;infection pulmonaire chez les rats sevrés immunocompétents où l&#39; infection a été créée en instillant des bactéries directement dans les poumons par une méthode intratrachéale nonsurgical simple intubation 14. Berry et al. plus tard modifié la méthode pour infecter des souris 15. En utilisant un inoculum à base de gélose, cette technique d&#39;inoculation provoque des infections pulmonaires solides chez les rats et les souris immunocompétentes avec S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa et Acinetobacter baumannii. Il se prête à un large éventail d&#39;isolats, y compris ceux abritant diverses résistles déterminants de la ance et ceux qui ne produisent pas une infection viable par l&#39;intermédiaire d&#39;autres voies d&#39;inoculation. Il permet également l&#39;efficacité à déterminer chez les animaux immunocompétents, une condition qui est plus pertinent que le modèle de la souris neutropénique traditionnelle pour les populations de patients qui ne sont pas sévèrement immunodéprimés. La cohérence et la fiabilité de ce modèle à travers de multiples agents pathogènes et les isolats rend bien adapté pour les études d&#39;efficacité antibactérienne.

<table><tbody><tr><td>Gélose de soja TSA II trypticase avec 5 % de sang de mouton</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Broth modifié</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase Bouillon de soja avec 20 % de glycérol</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>support de stockage pour </td></tr><tr><td>Boucle d’inoculation</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9 % de chlorure de sodium, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>Tube à centrifuger autonome de 30 mL avec capuchon</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique en polypropylène 30 x 115 mm</td><td>Falcon, un</td> tube à fond rond en polypropylène <td>352070</td><td></td></tr> de <tr>marque Corning<td>14 ml 17 x 100 mm</td><td>Falcon, un</td> outil de guidage <td>352059</td><td></td>de marque Corning</tr><tr><td></td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>canule métallique sur mesure pour rats</td></tr><tr><td>90' Tube Portex</td><td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>canule en plastique pour rats</td></tr><tr><td>1 mL TB embout coulissant</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Aiguille PrecisionGlide 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille d’alimentation animale - droite 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>utilisée pour créer une canule métallique pour souris</td></tr><tr><td>Tube en polyéthylène Intramedic</td><td>de marque Clay Adams - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>canule en plastique pour souris&nbsp ;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 et micro ; Seringue L 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>Seringue d’injection de verre HPLC</td></tr><tr><td>Tube Pyrex, culture 25x150 bouchon à vis avec doublure en caoutchouc</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>pour autoclave/stockage canules métalliques</td></tr><tr><td>70 % d’alcool isopropylique</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp ;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 sacs classiques</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de dosage, 96 puits, fond rond</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>en option, pour la dilution en série</td></tr><tr><td>Blood Omni Plates</td><td>Hardy</td><td>#A127</td><td>en option, plaques de sang rectangulaires</td></tr></tbody></table>

un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents rongeurs pour évaluer efficacité antibactérienne contre<i&gt; s. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; h. influenzae</i&gt;,<i&gt; k. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; p. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; a. baumannii</em

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacité des traitements antibactériens candidats doit être démontrée dans des modèles animaux d&#39;infection dans le cadre du processus de découverte et de développement, de préférence dans des modèles qui imitent l&#39;indication clinique prévue. Procédé pour induire des infections pulmonaires solides chez des rats et des souris immunocompétentes est décrit qui permet l&#39;évaluation des traitements dans un modèle de pneumonie grave causée par S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ou Acinetobacter baumannii. Les animaux sont anesthésiés et un inoculum à base de gélose est déposée dans le poumon profond par intubation intra-trachéale non chirurgicale. L&#39;infection résulte est cohérente, reproductible et stable pendant au moins 48 heures et jusqu&#39;à 96 heures pour la plupart des isolats. Des études avec des antibactériens commercialisés ont démontré une bonne corrélation entre l&#39; efficacité in vivo et in vitro de la sensibilité, et la concordance entre pharmacocinétiques / pharmacodynamiques cibles déterminéesdans ce modèle et les cibles cliniquement acceptées a été observée. Bien qu&#39;il y ait un investissement initial de temps lors de l&#39;apprentissage de la technique, elle peut être effectuée rapidement et efficacement une fois la compétence est atteint. Les avantages du modèle comprennent l&#39;élimination de l&#39;exigence neutropénique, une robustesse accrue et la reproductibilité, la capacité à étudier plusieurs agents pathogènes et isole, une meilleure flexibilité dans la conception de l&#39;étude et de l&#39;établissement d&#39;une infection difficile dans un hôte immunocompétent.

Les outils requis, l&#39; orientation de l&#39;animal, et la profondeur de l&#39; intubation sont représentés sur la figure 1. Est également représenté un exemple représentatif des colonies se développant sur une plaque de gélose après dilution en série et trois boîtes de Petri d&#39;un échantillon d&#39;homogénat pulmonaire. Une augmentation de la charge bactérienne de plusieurs log 10 UFC au- dessus des contrôles de base est généralement observée dans les poumons infectés pour la plupart des isolats bactériens, même après l&#39;infection de 96 h, et la variabilité entre les animaux est faible (Figure 2). Pour certains H. influenzae, il peut y avoir peu de croissance; Toutefois, l&#39;infection ne doit pas commencer à auto-détermination dans un laps de temps de 48 ou de 96 h (figure 2B). Ce modèle d&#39;infection pulmonaire peut être utilisé lors de l&#39; optimisation des séries chimiques conduisent à soutenir RS, comme représenté sur la figure 3 pour des composés représentatifs de deux séries différentes 16, 17. Il fournit un uniforme, reproductible rencontréhod pour évaluer PK / PD chez les animaux immunocompétents et a été utilisé pour déterminer que la zone de médicament libre sous la courbe concentration-temps sur la concentration minimale inhibitrice (Fauc / MIC) en corrélation avec l&#39; efficacité d&#39;un nouveau déformylase polypeptide (PDF) inhibiteur contre S. pneumoniae et H. influenzae (figure 4). En outre, les Fauc / cibles MIC pour la stase et un 1-log 10 UFC réduction des contrôles de base ont été déterminés dans 11 S. pneumoniae et 5 isolats de H. influenzae (tableau 1) 18. Coupler ce modèle d&#39;infection par un système de délivrance de médicament pour recréer les profils pharmacocinétiques chez des rats humains crée un outil puissant pour évaluer les schémas posologiques humains avant les études cliniques. Un exemple de ceci est résumé dans le tableau 2, qui montre qu&#39;une formulation à libération prolongée de l&#39; amoxicilline-clavulanate était plus efficace que les régimes de dose existants pour les organismes avec elevavaleurs ted MIC 19. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig1.jpg" /> Figure 1: Nonsurgical Intratrachéal intubation. Les outils sont présentés pour intuber le rat (A) et la souris (B). Une fois anesthésié, l&#39;animal doit être positionné comme indiqué dans C, avec la tête vers la droite et la queue vers la gauche si la personne effectuant la technique est droitier. Placez l&#39;index gauche doucement sur la gorge pour aider à palper les anneaux trachéaux pour la confirmation du placement de canule correcte. L&#39;inoculum doit être placé profondément dans le poumon gauche, comme le montre la vue ventrale d&#39;un poumon de rat (D). Les colonies en croissance sur gélose après dilution en série et le placage d&#39;un échantillon doit ressembler à celle représentée sur E. Figure 1D, Copyright © Gill Smith [les animaux de laboratoire, Volume 25 (1991), G. Smith, Améthode non-chirurgicale simple instillation intrabronchique pour l&#39;établissement d&#39;infections respiratoires chez le rat, pages 46 - 49] 14. Reproduit avec la permission. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig2.jpg" /> Figure 2: Exemples représentatifs de la croissance bactérienne dans les poumons des animaux infectés. Moyenne ± écart type de données standard CFU de N = 5 animaux / groupe est représenté par différents isolats de S. pneumoniae (A), H. influenzae (B), P. aeruginosa (C), K. pneumoniae (D) et A. baumannii (E). La première barre de chaque paire (gris clair) est le bacte de basefardeau rial après l&#39;infection 1 ou 2 h, tandis que la deuxième barre est le contrôle de la croissance de la fin de l&#39;étude à 48 h infection post (gris foncé) ou après l&#39;infection 96 h (noir). Aucune méthode de censure de données ont été appliquées; Ainsi, ces résultats comprennent des données de tous les 5 animaux par groupe. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig3.jpg" /> Figure 3: Évaluation de l&#39;efficacité des diverses séries chimiques lors de l&#39; optimisation de plomb. modèles d&#39;infection pulmonaire en utilisant les techniques décrites ont été utilisées pour explorer les relations structure-activité dans le cadre du programme de type abactérienne IIA topoisomérase. Des composés prometteurs 7 et 1 ont été évalués contre quinolone-sensibles (A) 16 ou résistants aux quinolones(B) 17 isolats de S. pneumoniae, respectivement. Chaque symbole représente CFU déterminé à partir des poumons d&#39;un rat avec des lignes représentant la moyenne du groupe et l&#39;écart-type. Limite inférieure de quantification (LIQ) était de 1,7 log 10 UFC / poumons. Les composés ont été pesés (56 ou 112 mg de molécule mère libre pure), dissous dans 9 ml d&#39;eau stérile, on dilue 3 ml en ml d&#39;eau 3 (1: 1) et administré par gavage par voie orale de 1 ml / 125 g de rat, deux fois par jour ( 6 - 7 h d&#39;intervalle) pendant 2 jours, à partir de l&#39;infection post 1 h. témoins non traités (NTC) ont été prélevés après l&#39;infection 1 h à la ligne de base ou traités avec du sérum physiologique et échantillonnés à la fin de l&#39;étude (48 h) pour le contrôle de la croissance. Figure 3A réimprimé de Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 21, TJ Miles et al, cyclohexyl-amides nouveaux comme antibactériens puissants type de ciblage bactérienne IIA topoisomérases, Pages 7483 -. 7488, Copyright (2011) 16, avec la permission de Elsevier.Figure 3B réimprimé de Bioorganic &amp; Medicinal Chemistry Letters, Volume 26, TJ Miles et al, tricycliques nouveaux (par exemple GSK945237) comme de puissants inhibiteurs de type bactérien IIA topoisomérases, Pages 2464 -. 2469, Copyright (2016) 17, avec la permission de Elsevier. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/55068/55068fig4.jpg" /> Figure 4: PK / PD Caractérisation d&#39;un inhibiteur de PDF Novel. Modèles Emax ont été créés en utilisant la dose allant des données d&#39;efficacité chez des souris immunocompétentes infectées dans le poumon avec des isolats de S. pneumoniae (A) ou H. influenzae (B) pour déterminer les cibles / PD PK pour un nouvel inhibiteur de PDF 18. Cerclesreprésenter la charge bactérienne moyenne de 4 à 5 souris / groupe traité avec des doses variables du composé. Les analyses ont été effectuées pour établir une corrélation entre l&#39;efficacité avec médicament libre 24 h AUC (cercles ouverts) ou AUC / MIC (cercles pleins). Reproduit avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 60, 2016, pages 180 - 189] 18. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55068/55068fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Stase </td><td colspan="2"> 1-log 10 de réduction </td><td></td></tr><tr><td> Organisme </td><td> MIC (pg / ml) </td><td> R 2 représente ligne fit (%) </td><td> Fauc </td><td> Fauc / MIC </td><td> Fauc </td><td> Fauc / MIC </td><td> tuer Max (log 10 réduction) </td></tr><tr><td> S. pneumoniae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10127 </td><td> 0,25 </td><td> 99,9 </td><td> 2.0 </td><td> 8.1 </td><td> 3.6 </td><td> 14.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1316009S </td><td> 0,25 </td><td> 96,1 </td><td> 6.5 </td><td> 26,0 </td><td> 15.1 </td><td> 60,3 </td><td> 1.8 </td></tr><tr><td> ATCC10813 </td><td> 0,5 </td><td> 100 </td><td> 8.4 </td><td> 16,9 </td><td> 22.2 </td><td> 44,5 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> 1307007S </td><td> 1 </td&gt; <td> 95,8 </td><td> 16.1 </td><td> 16.1 </td><td> 20.1 </td><td> 20.1 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> ATCC6303 </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 19,8 </td><td> 19,8 </td><td> 24.8 </td><td> 24.8 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> 1629 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 15.8 </td><td> 7.9 </td><td> 21.2 </td><td> 10.6 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> 298443 </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 26,5 </td><td> 13.2 </td><td> 31,0 </td><td> 15.5 </td><td> 2.3 </td></tr><tr><td> 336808 </td><td> 2 </td><td> 86 </td><td> 8.2 </td><td> 4.2 </td><td> 19,0 </td><td> 9.5 </td><td> 2.6 </td></tr><tr><td> 338860 </td><td> 2 </td><td> 99,5 </td><td> 2.9 </td><td> 1.5 </td><td> 6.7 </td><td> 3.4 </td><td> 2.8 </td></tr><tr><td> &amp; #160; 340449 </td><td> 2 </td><td> 94,6 </td><td> 8.0 </td><td> 4.0 </td><td> 14.9 </td><td> 7.4 </td><td> 2.1 </td></tr><tr><td> L11259 </td><td> 2 </td><td> 100 </td><td> 7.1 </td><td> 3.5 </td><td> 9.0 </td><td> 4.5 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> SO a </td><td> N / A </td><td> 11,0 ± 7,5 </td><td> 11,0 ± 7,9 </td><td> 17,0 ± 8,2 </td><td> 19,5 ± 17,8 </td><td> 2,3 ± 0,5 </td></tr><tr><td> Médian </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 8.2 </td><td> 8.1 </td><td> 19,0 </td><td> 14.4 </td><td> 2.4 </td></tr><tr><td> H. influenzae </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1998-100-126H </td><td> 1 </td><td> 99,7 </td><td> 7.3 </td><td> 7.3 </td><td> 13.4 </td><td> 13.4 </td><td> 2.9 </td></tr><tr><td> 503-008H </td><td> 1 </td><td> 99,8 </td><td> 7.1 </td><td> 7.1 </td><td> 13.9 </td><td> 13.9 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 08003H </td><td> 2 </td><td> 99,9 </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 8.3 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> H128 </td><td> 2 </td><td> 96,6 </td><td> 15.3 </td><td> 7.6 </td><td> 26,0 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> 19001H </td><td> 4 </td><td> 91,9 </td><td> 14.8 </td><td> 3.7 </td><td> 37,3 </td><td> 9.3 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> Moyenne ± SD </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 11,8 ± 4,2 </td><td> 6.6 ± 1.6 </td><td> 21,5 ± 10.2 </td><td> 11,6 ± 2,6 </td><td> 2,8 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Médian </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 14.5 </td><td> 7.2 </td><td> 16.7 </td><td> 13,0 </td><td> 2.7 </td></tr><tr><td> un NA, non applicable. </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 1: PK Cibles / PD pour un Inhibiteur PDF Novel contre S. pneumoniae et H. influenzae isolements. AUC libre-médicament et ASC / cibles MIC pour la stase et à 1 log 10 UFC réduction de base ont été déterminées pour 11 S. pneumoniae et H. influenzae 5 chez les souris immunocompétentes infectées dans le poumon et traités avec le composé 18. La data été utilisé pour aider les doses humaines sélectionner pour le développement clinique. Ce tableau a été adapté et réimprimé avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 60, 2016, pages 180 - 189] 18. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Groupe de traitement d&#39; un </td><td colspan="8"> Logarithmique moyen 10 S. pneumoniae (CFU / poumon) b ± SD pour la souche (AMX / CA MIC): </td></tr><tr><td> 05010S (2 pg / ml) </td><td> 16001S c (4 ug / ml) </td><td> 16001S (4 ug / ml) </td><td> 30005S (4 ug / ml) </td><td> 20009S (4 ug / ml) </td><td> 05003S (8 pg / ml) </td><td> 404053 (8 pg / ml) </td><td> 47003S (8 pg / ml) </td></tr><tr><td> Contrôle </strong&gt; </td><td> 7,3 ± 0,4 </td><td> 7,0 ± 0,8 </td><td> 5,7 ± 1,2 </td><td> 7,1 ± 0,7 </td><td> 7,1 ± 0,4 </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 6,8 ± 0,4 </td><td> 6,0 ± 0,3 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2000/125 mg bid (rapport 16: 1) </td><td> ≤ 1,7 ** </td><td> 2,8 ± 1,2 ** </td><td> 2,2 ± 0,8 ** </td><td> 2,3 ± 0,9 ** </td><td> 2,5 ± 0,9 ** </td><td> 2,0 ± 0,9 ** </td><td> 3,8 ± 1,4 ** </td><td> 1,8 ± 0,2 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg tid (rapport 8: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 2,8 ± 0,5 ** </td><td> 2,7 ± 1,3 ** </td><td> 3,3 ± 0,9 ** </td><td> 4,9 ± 0,5 ** </td><td> 6,6 ± 1,3 </td><td> 4,7 ± 0,7 ** </td></tr><tr> &lt;td&gt; 875/125 mg tid (rapport 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 3,0 ± 1,3 * </td><td> 2,1 ± 0,7 ** </td><td> 3,2 ± 0,4 ** </td><td> 5,2 ± 0,9 * </td><td> 6,4 ± 0,6 </td><td> 4,9 ± 0,4 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapport 7: 1) </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,5 ± 1,2 * </td><td> 5,6 ± 1,3 * </td><td> 5,2 ± 0,7 ** </td><td> 6,3 ± 0,7 </td><td> 6,4 ± 0,7 </td><td> 5,5 ± 0,4 </td></tr><tr><td> 500/125 mg tid (rapport 4: 1) </td><td> 3,1 ± 1,3 ** </td><td> 4,5 ± 0,9 ** </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td></tr><tr><td> Azithromycine, 1000/500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 5,8 ± 2,0 </td><td> 7,1 ± 0,9 </td><td> 3,1 ± 1,0 ** </td><td> 6,6 ± 0,4 </td><td> 6.07; 0,6 </td></tr><tr><td> Lévofloxacine, 500 mg od </td><td> NT </td><td> NT </td><td> 4,2 ± 0,8 * </td><td> 5,7 ± 0,8 * </td><td> 4,9 ± 0,8 ** </td><td> 3,0 ± 1,3 ** </td><td> 3,5 ± 0,2 ** </td><td> 3,9 ± 0,8 ** </td></tr><tr><td rowspan="2"> Groupe de traitement d </td><td colspan="8"> Moyenne log 10 H. influenzae (CFU / poumon) ± écart - type pour la souche: </td></tr><tr><td colspan="4"> H128 (β-lactamase positive) </td><td colspan="4"> Chesterfield (β-lactamase négatif, résistant à l&#39; ampicilline) </td></tr><tr><td> Contrôle </td><td colspan="4"> 6,4 ± 0,6 </td><td colspan="4"> 6,7 ± 0,6 </td></tr><tr><td> AMX / CA </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2000/125 mg bid (rapport 16: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,7 ** </td><td colspan="4"> 3,1 ± 0,9 ** </td></tr><tr><td> 1000/125 mg tid (rapport 8: 1) </td><td colspan="4"> 2,1 ± 1,0 ** </td><td colspan="4"> 3,6 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg tid (rapport 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,8 ± 1,3 ** </td><td colspan="4"> 3,8 ± 1,3 ** </td></tr><tr><td> 875/125 mg bid (rapport 7: 1) </td><td colspan="4"> 2,0 ± 0,8 ** </td><td colspan="4"> 5,1 ± 1,1 ** </td></tr><tr><td> Azithromycine, 1000/500 mg od </td><td colspan="4"> 3,2 ± 1,7 * </td><td colspan="4"> 5,8 ± 1,1 </td></tr><tr><td> Lévofloxacine, 500 mg od </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td><td colspan="4"> ≤ 1,7 ** </td></tr><tr><td colspan="9"> un AMX / CA, amoxicilline-acide clavulanique; offre, deux fois par jour; tid., trois fois par jour; od, une fois par jour. </td></tr><tr><td colspan="9"> b La limite de détection était &lt;1,7; * Significativement différent du témoin (P ≤ 0,05); ** Significativement différent du témoin (P ≤ 0,01); NT, non testé. </td></tr><tr><td colspan="9"> La souche c 16001S a été testée dans deux expériences distinctes. </td></tr><tr><td colspan="9"> d amoxicilline-clavulanate 500/125 mg (4: 1) trois fois par jour n&#39;a pas été testé contre les souches de H. influenzae. </td></tr></tbody></table> Tableau 2: Efficacité des profils d&#39;exposition Recreated plasma humain pour différents Amoxicilline / Clavulanate schémas posologiques. Les données générées chez les rats immunocompétents infectés dans le poumon avec des isolats de S. pneumoniae ou H. influenzae en utilisant ce modèle ont démontré qu&#39;une formulation améliorée de l&#39; amoxicilline-acide clavulanique (2000/125 mg deux fois par jour) était plus efficace que les schémas posologiques standards contre les isolats avec élévation de la sensibilité in vitro 19. Ce tableau a été adapté et réimprimé avec la permission, Copyright © American Society for Microbiology, [ les agents antimicrobiens et la chimiothérapie, le volume 49, 2005, pages 908 - 915] 19.

Une méthode d’établissement des infections pulmonaires chez les rongeurs immunocompétents est décrite. Avec de l’habileté, cette méthode peut être mise en œuvre rapidement et facilement pour induire une infection stable avec de nombreux isolats de S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae et A. baumannii.

Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

L’objectif global de cette procédure d’infection intrabronchique non chirurgicale est d’établir une pneumonie bactérienne robuste chez les rongeurs immunocompétents. Cette méthode ajoute de la valeur pour la découverte et le développement d’antibactériens en permettant d’évaluer l’efficacité des traitements potentiels dans un modèle immunocompétent de pneumonie sévère. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’établir une infection pulmonaire robuste et reproductible avec de nombreux isolats, y compris ceux qui nécessitent généralement que les animaux soient neutropéniques ou des isolats qui ne produisent pas d’infection viable avec d’autres méthodes.En général, les personnes qui ne connaissent pas cette procédure auront des difficultés. Une bonne intubation est une procédure à l’aveugle qui nécessite d’apprendre la bonne sensation pour intuber la trachée au lieu de l’œsophage. Une bonne intubation est différente pour chaque scientifique.L’angle exact de la canule peut ne pas être le même pour tout le monde. La clé est de sentir les crêtes de la trachée. Cindy Mininger, une scientifique de notre laboratoire, fera la démonstration de cette technique.Pour commencer, préparez des suspensions bactériennes salines à partir de cultures de bouillon pendant la nuit, comme indiqué dans le protocole textuel, ou à partir de plaques de gélose, comme démontré ici. Récoltez la croissance de nuit sur des plaques de gélose en utilisant une boucle stérile pour gratter les colonies de la surface. Transférez le matériel récolté dans cinq millilitres de solution saline stérile jusqu’à l’obtention d’une suspension trouble et opaque, et agitez doucement la culture jusqu’à ce qu’elle soit homogène.Diluez ensuite en série et plaquez une aliquote de chaque dilution selon le protocole de texte. Après avoir préparé la gélose et assemblé les outils nécessaires au processus d’infection, selon le protocole de texte, aliquotez neuf millilitres de gélose dans un tube stérile, puis placez le tube dans le bain-marie jusqu’à ce que la gélose s’équilibre à environ 42 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de la suspension bactérienne saline préalablement préparée dans le tube d’agar.Ensuite, retournez le tube plusieurs fois pour le mélanger et remettez-le à l’eau. Placez un tapis propre et jetable sur le plan de travail près du bain-marie. Pour préparer la surface de travail et le dispositif d’intubation, stérilisez d’abord la canule métallique et le tube en polyéthylène conformément au protocole textuel, puis transférez-les dans son tube de stockage en verre sur la surface de travail.Ensuite, retirez le capuchon du tube de stockage et faites glisser l’extrémité de la poignée de la canule vers l’extrémité ouverte du tube. À l’aide d’une pince stérile, retirez une longueur de tube en polyéthylène du bécher et insérez-la à l’intérieur de la canule métallique stérile, en vous assurant qu’elle se déplace librement. Placez un repère à un endroit prédéterminé avec un stylo indélébile.Ensuite, installez une aiguille stérile jetable de calibre 25 sur l’extrémité libre du tube en polyéthylène en glissant l’aiguille sur plusieurs millimètres dans le tube. Ensuite, utilisez une solution saline stérile pour remplir une seringue jetable fraîche d’un millilitre. Fixez la seringue à l’aiguille fixée sur le tube en polyéthylène et rincez tout le volume de solution saline à travers le tube.Jetez la seringue usagée dans le récipient pour objets tranchants. Ensuite, remplissez une nouvelle seringue stérile jetable d’un millilitre avec l’inoculum à base d’agar du bain-marie. Remettez en place l’aiguille et le tube de calibre 25 et rincez la gélose à travers le tube en appuyant sur le piston jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli de gélose.Après avoir anesthésié le rat selon le protocole textuel, placez l’animal en position couchée sur le tapis jetable, la tête tournée vers la droite et la queue vers la gauche. Ensuite, insérez l’extrémité libre de la canule métallique dans la bouche de l’animal. Tournez la canule de manière à ce que l’extrémité libre soit inclinée vers le haut et avancez-la doucement dans la trachée, en contournant soigneusement les structures laryngées avec un léger mouvement de torsion.Confirmez l’insertion dans la trachée, plutôt que dans l’œsophage, en faisant glisser doucement la canule légèrement vers l’avant et vers l’arrière à plusieurs reprises tout en utilisant l’index gauche pour palper les anneaux trachéaux. Pour assurer l’intubation dans la trachée, et non dans l’œsophage, déplacez légèrement la canule d’avant en arrière et palpez les crêtes. Si la canule glisse doucement dans la gorge et que les crêtes ne sont pas perceptibles, retirez l’appareil et réessayez.Lorsque la canule atteint la bifurcation où la trachée se divise en bronches gauche et droite, faites un léger mouvement de torsion vers le côté gauche de l’animal pour vous assurer que la canule est insérée dans la bronche gauche. Une erreur courante consiste à ne pas placer l’inoculum assez profondément dans le poumon, ce qui peut bloquer les voies respiratoires et inhiber la respiration. Lorsque la canule est tournée dans le bon angle, elle doit glisser facilement dans la bronche gauche et avancer doucement jusqu’à la profondeur appropriée.Avancez la canule métallique jusqu’à ce que l’extrémité soit à mi-chemin des trois quarts du poumon gauche, en utilisant le repère précédemment placé pour confirmer que la profondeur appropriée a été atteinte. Avec la canule métallique en place, avancez le tube en polyéthylène de plusieurs millimètres à l’aide du repère précédemment placé sur le tube pour vous assurer qu’il n’est avancé que suffisamment loin pour sortir de l’extrémité de la canule métallique et ne pas perforer le poumon. Avec les deux canules en place, utilisez la seringue attachée pour instiller 100 microlitres de suspension de gélose profondément dans le grand lobe du poumon gauche.Prélevez plusieurs millimètres de la tubulure et retirez délicatement le dispositif d’intubation intact. Remettez-le dans le tube de stockage en verre et placez l’animal dans une cage fraîche pour récupérer. Préparez la surface de travail et la canule comme nous venons de le démontrer pour les rats, à l’aide de l’équipement de taille appropriée pour les souris.Utilisez une seringue stérile jetable de 1 millilitre et une aiguille stérile de calibre 25 pour remplir la seringue de micro-injection en verre avec une solution saline stérile. Ensuite, rincez la solution saline à travers l’appareil remonté. Ensuite, utilisez une nouvelle seringue stérile jetable d’un millilitre et une aiguille stérile de calibre 25 pour remplir la seringue de micro-injection avec l’inoculum de gélose.Ensuite, remontez l’appareil et rincez la gélose à travers le tube jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli de gélose. Après avoir anesthésié la souris conformément au protocole textuel, positionnez l’animal dans la même orientation que celle démontrée pour le rat et utilisez une pression constante mais douce pour intuber la trachée de la même manière que chez le rat. Évitez d’utiliser la force car la technique est plus délicate chez la souris.Assurez-vous que la canule est insérée dans la trachée en tâtant les anneaux trachéaux. Tournez légèrement et avancez la canule dans la bronche gauche, en l’insérant profondément dans le poumon à l’aide de repères de guidage préalablement placés. Avec la canule métallique en place, avancez le tube en polyéthylène de plusieurs millimètres et instillez 20 microlitres de suspension de gélose.Voici un exemple représentatif de colonies se développant sur une plaque de gélose après dilution en série et placage en trois exemplaires d’un échantillon d’homogénat pulmonaire. Comme le montre ce graphique avec S. pneumoniae, une augmentation de la charge bactérienne de plusieurs UFC de base log dix au-dessus des témoins de base est généralement observée dans les poumons infectés pour la plupart des isolats bactériens, même 96 heures après l’infection, et la variabilité entre les animaux est faible. Dans cette expérience, deux composés ont été évalués contre des isolats de S. pneumoniae sensibles ou résistants aux quinolones pour illustrer que ce modèle d’infection pulmonaire peut être utilisé lors de l’optimisation d’une série chimique principale pour soutenir les relations structure-activité.Chaque symbole représente l’UFC déterminée à partir des poumons d’un rat. Voici des modèles E max créés à l’aide de données d’efficacité dose-variable chez des souris immunocompétentes infectées dans les poumons par des isolats de S. pneumoniae ou de H. influenzae afin de déterminer des cibles pharmacocinétiques et pharmacodynamiques pour un nouvel inhibiteur de la polypeptide déformylase. Les cercles représentent la charge bactérienne moyenne de quatre à cinq souris par groupe traitées avec des doses variables de composé.Les cercles vides représentent l’aire libre sous la courbe et les cercles pleins représentent l’aire sous la courbe de temps de concentration au-dessus de la concentration minimale inhibitrice. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 secondes par animal, avec jusqu’à cinq ou six animaux inoculés par seringue d’inoculum d’agar. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer cette méthode d’infection intrabronchique non chirurgicale et être en mesure de l’utiliser pour établir des infections pulmonaires avec de nombreux isolats bactériens différents.Energie Instrumetnal

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Lenhard, A. et al. Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à agent pathogène après une co-infection virale récapitule une maladie aggravée par l’âge. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo présente un modèle de co-infection chez la souris dans lequel le virus de la grippe déclenche la transition de Streptococcus pneumoniae d’un colonisateur à un agent pathogène. Il décrit les étapes impliquées dans la colonisation bactérienne, l’infection virale et la...

Un modèle murin pour étudier la transition pathogène de Streptococcus pneumoniae après une co-infection virale

Cette vidéo montre l’établissement d’une infection pulmonaire chez un modèle de rongeur immunocompétent par intubation et installation de suspensions bactériennes dans les lobes pulmonaires. Ce modèle permet d’étudier l’efficacité antibactérienne chez des animaux immunocompétents.

Instillation intrabronchique de Streptococcus pneumoniae dans des modèles de rongeurs immunocompétents

Streptococcus pneumoniae est l'agent pathogène menant pneumopathies sévères acquis communautaire et responsable de plus de 2 millions de décès dans le monde. L'impact des facteurs bactériens impliqués dans la virulence de remise en forme ou peut être contrôlé en temps réel dans une pneumonie ou une bactériémie modèle de souris en utilisant des bactéries bioluminescentes aiguë.

Après en temps réel l&#39;impact des facteurs de virulence contre le pneumocoque dans une souris modèle pneumonie aiguë avec bactéries bioluminescentes

Nous avons développé un modèle de lésions pulmonaires chez la souris par injection intra-trachéale de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ce modèle imite les lésions pulmonaires lors d’une pneumonie et est cliniquement pertinent.

Pseudomonas aeruginosa lésion pulmonaire induite par modèle

Plusieurs procédés ont été décrits dans la littérature pour la modélisation de la pneumonie bactérienne chez les souris. Nous décrivons ici un peu coûteux, un procédé rapide et non invasif destiné à induire une pneumonie par aspiration ( par exemple, inhalation) , d'un inoculum bactérien pipeté dans l'oropharynx. méthodes en aval pour l'évaluation de la réponse immunitaire innée pulmonaire sont également détaillées.

Une méthode non-invasive et technique non-intensif pour Induction et phénotypage of Experimental pneumonie bactérienne chez les souris

La pneumonie infectieuse est parmi les infections les plus courantes chez l’homme. Un modèle approprié en vivo est essentiel pour comprendre la pathogenèse de la maladie et de tester l’efficacité de nouveaux médicaments. Avec ce modèle de pneumonie murine aspiration oropharyngée, on peut examiner la pathogénie et nouveaux traitements contre ces infections mortelles.

Modèle murin Aspiration oropharyngée de pneumonie bactérienne associée à et nosocomiales

Ici, nous présentons des méthodes pour améliorer les études secondaires de pneumonie bactérienne en fournissant une voie non-invasive de l'instillation dans les voies respiratoires inférieures suivies du rétablissement d'agent pathogène et de l'analyse de transcription. Ces procédures sont reproductibles et peuvent être effectuées sans équipement spécialisé tel que des canules, des fils de guidage, ou des câbles de fibre optique.

Un système précis de livraison et de récupération d'agents pathogènes pour les modèles murines de pneumonie bactérienne secondaire

Ce manuscrit décrit l’établissement d’un modèle infectieux de pneumonie chez la souris et la caractérisation respective de la résolution des lésions ainsi que les méthodes de croissance bactérienne et d’instillation intratrachéale. Une nouvelle approche utilisant la cytométrie en flux de grande dimension pour évaluer le paysage immunitaire est également décrite.

Modèle expérimental pour évaluer la résolution de la pneumonie

Cet article décrit un nouveau modèle murin pour la transition du pneumocoque d’un colonisateur asymptomatique à un agent pathogène pathogène au cours d’une infection virale. Ce modèle peut être facilement adapté pour étudier les interactions polymicrobiennes et hôte-pathogène au cours des différentes phases de la progression de la maladie et entre divers hôtes.

Un modèle murin pour la transition de Streptococcus pneumoniae de colonisateur à pathogène lors d’une co-infection virale récapitule la maladie exacerbée par l’âge

Les souris sont généralement résistantes aux infections par Mycobacterium abscessus, ce qui complique la découverte et le développement d’antibiotiques indispensables contre les infections pulmonaires. Ici, nous décrivons une méthode de préparation d’inoculum et d’infection intratrachéale qui s’est avérée entraîner une infection durable chez les souris immunocompétentes.

Préparation de Mycobacterium abscessus enrobé de perle de gélose pour inoculer des souris immunocompétentes par voie intratrachéale

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle d’immunosuppression de la septicémie chez la souris via une instillation intranasale de Klebsiella pneumoniae et validons le modèle à l’aide de divers indicateurs.

Établissement d’un modèle d’immunosuppression induite par septicémie chez la souris par instillation intranasale de bactéries

Découvrez une méthode d'infection intrabronchique non chirurgicale pour établir une pneumonie bactérienne robuste chez les rongeurs immunocompétents. Cette technique permet d'évaluer l'efficacité des traitements antibactériens dans un modèle pertinent de pneumonie sévère.

Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii (Vidéo) | JoVE Journal

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