Un modèle de pneumonie robuste en immunocompétents Rongeurs pour évaluer Efficacité antibactérienne contre S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa ou A. baumannii

L’objectif global de cette procédure d’infection intrabronchique non chirurgicale est d’établir une pneumonie bactérienne robuste chez les rongeurs immunocompétents. Cette méthode ajoute de la valeur pour la découverte et le développement d’antibactériens en permettant d’évaluer l’efficacité des traitements potentiels dans un modèle immunocompétent de pneumonie sévère. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’établir une infection pulmonaire robuste et reproductible avec de nombreux isolats, y compris ceux qui nécessitent généralement que les animaux soient neutropéniques ou des isolats qui ne produisent pas d’infection viable avec d’autres méthodes.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette procédure auront des difficultés. Une bonne intubation est une procédure à l’aveugle qui nécessite d’apprendre la bonne sensation pour intuber la trachée au lieu de l’œsophage. Une bonne intubation est différente pour chaque scientifique.

L’angle exact de la canule peut ne pas être le même pour tout le monde. La clé est de sentir les crêtes de la trachée. Cindy Mininger, une scientifique de notre laboratoire, fera la démonstration de cette technique.

Pour commencer, préparez des suspensions bactériennes salines à partir de cultures de bouillon pendant la nuit, comme indiqué dans le protocole textuel, ou à partir de plaques de gélose, comme démontré ici. Récoltez la croissance de nuit sur des plaques de gélose en utilisant une boucle stérile pour gratter les colonies de la surface. Transférez le matériel récolté dans cinq millilitres de solution saline stérile jusqu’à l’obtention d’une suspension trouble et opaque, et agitez doucement la culture jusqu’à ce qu’elle soit homogène.

Diluez ensuite en série et plaquez une aliquote de chaque dilution selon le protocole de texte. Après avoir préparé la gélose et assemblé les outils nécessaires au processus d’infection, selon le protocole de texte, aliquotez neuf millilitres de gélose dans un tube stérile, puis placez le tube dans le bain-marie jusqu’à ce que la gélose s’équilibre à environ 42 degrés Celsius. Ajoutez un millilitre de la suspension bactérienne saline préalablement préparée dans le tube d’agar.

Ensuite, retournez le tube plusieurs fois pour le mélanger et remettez-le à l’eau. Placez un tapis propre et jetable sur le plan de travail près du bain-marie. Pour préparer la surface de travail et le dispositif d’intubation, stérilisez d’abord la canule métallique et le tube en polyéthylène conformément au protocole textuel, puis transférez-les dans son tube de stockage en verre sur la surface de travail.

Ensuite, retirez le capuchon du tube de stockage et faites glisser l’extrémité de la poignée de la canule vers l’extrémité ouverte du tube. À l’aide d’une pince stérile, retirez une longueur de tube en polyéthylène du bécher et insérez-la à l’intérieur de la canule métallique stérile, en vous assurant qu’elle se déplace librement. Placez un repère à un endroit prédéterminé avec un stylo indélébile.

Ensuite, installez une aiguille stérile jetable de calibre 25 sur l’extrémité libre du tube en polyéthylène en glissant l’aiguille sur plusieurs millimètres dans le tube. Ensuite, utilisez une solution saline stérile pour remplir une seringue jetable fraîche d’un millilitre. Fixez la seringue à l’aiguille fixée sur le tube en polyéthylène et rincez tout le volume de solution saline à travers le tube.

Jetez la seringue usagée dans le récipient pour objets tranchants. Ensuite, remplissez une nouvelle seringue stérile jetable d’un millilitre avec l’inoculum à base d’agar du bain-marie. Remettez en place l’aiguille et le tube de calibre 25 et rincez la gélose à travers le tube en appuyant sur le piston jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli de gélose.

Après avoir anesthésié le rat selon le protocole textuel, placez l’animal en position couchée sur le tapis jetable, la tête tournée vers la droite et la queue vers la gauche. Ensuite, insérez l’extrémité libre de la canule métallique dans la bouche de l’animal. Tournez la canule de manière à ce que l’extrémité libre soit inclinée vers le haut et avancez-la doucement dans la trachée, en contournant soigneusement les structures laryngées avec un léger mouvement de torsion.

Confirmez l’insertion dans la trachée, plutôt que dans l’œsophage, en faisant glisser doucement la canule légèrement vers l’avant et vers l’arrière à plusieurs reprises tout en utilisant l’index gauche pour palper les anneaux trachéaux. Pour assurer l’intubation dans la trachée, et non dans l’œsophage, déplacez légèrement la canule d’avant en arrière et palpez les crêtes. Si la canule glisse doucement dans la gorge et que les crêtes ne sont pas perceptibles, retirez l’appareil et réessayez.

Lorsque la canule atteint la bifurcation où la trachée se divise en bronches gauche et droite, faites un léger mouvement de torsion vers le côté gauche de l’animal pour vous assurer que la canule est insérée dans la bronche gauche. Une erreur courante consiste à ne pas placer l’inoculum assez profondément dans le poumon, ce qui peut bloquer les voies respiratoires et inhiber la respiration. Lorsque la canule est tournée dans le bon angle, elle doit glisser facilement dans la bronche gauche et avancer doucement jusqu’à la profondeur appropriée.

Avancez la canule métallique jusqu’à ce que l’extrémité soit à mi-chemin des trois quarts du poumon gauche, en utilisant le repère précédemment placé pour confirmer que la profondeur appropriée a été atteinte. Avec la canule métallique en place, avancez le tube en polyéthylène de plusieurs millimètres à l’aide du repère précédemment placé sur le tube pour vous assurer qu’il n’est avancé que suffisamment loin pour sortir de l’extrémité de la canule métallique et ne pas perforer le poumon. Avec les deux canules en place, utilisez la seringue attachée pour instiller 100 microlitres de suspension de gélose profondément dans le grand lobe du poumon gauche.

Prélevez plusieurs millimètres de la tubulure et retirez délicatement le dispositif d’intubation intact. Remettez-le dans le tube de stockage en verre et placez l’animal dans une cage fraîche pour récupérer. Préparez la surface de travail et la canule comme nous venons de le démontrer pour les rats, à l’aide de l’équipement de taille appropriée pour les souris.

Utilisez une seringue stérile jetable de 1 millilitre et une aiguille stérile de calibre 25 pour remplir la seringue de micro-injection en verre avec une solution saline stérile. Ensuite, rincez la solution saline à travers l’appareil remonté. Ensuite, utilisez une nouvelle seringue stérile jetable d’un millilitre et une aiguille stérile de calibre 25 pour remplir la seringue de micro-injection avec l’inoculum de gélose.

Ensuite, remontez l’appareil et rincez la gélose à travers le tube jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli de gélose. Après avoir anesthésié la souris conformément au protocole textuel, positionnez l’animal dans la même orientation que celle démontrée pour le rat et utilisez une pression constante mais douce pour intuber la trachée de la même manière que chez le rat. Évitez d’utiliser la force car la technique est plus délicate chez la souris.

Assurez-vous que la canule est insérée dans la trachée en tâtant les anneaux trachéaux. Tournez légèrement et avancez la canule dans la bronche gauche, en l’insérant profondément dans le poumon à l’aide de repères de guidage préalablement placés. Avec la canule métallique en place, avancez le tube en polyéthylène de plusieurs millimètres et instillez 20 microlitres de suspension de gélose.

Voici un exemple représentatif de colonies se développant sur une plaque de gélose après dilution en série et placage en trois exemplaires d’un échantillon d’homogénat pulmonaire. Comme le montre ce graphique avec S. pneumoniae, une augmentation de la charge bactérienne de plusieurs UFC de base log dix au-dessus des témoins de base est généralement observée dans les poumons infectés pour la plupart des isolats bactériens, même 96 heures après l’infection, et la variabilité entre les animaux est faible. Dans cette expérience, deux composés ont été évalués contre des isolats de S. pneumoniae sensibles ou résistants aux quinolones pour illustrer que ce modèle d’infection pulmonaire peut être utilisé lors de l’optimisation d’une série chimique principale pour soutenir les relations structure-activité.

Chaque symbole représente l’UFC déterminée à partir des poumons d’un rat. Voici des modèles E max créés à l’aide de données d’efficacité dose-variable chez des souris immunocompétentes infectées dans les poumons par des isolats de S. pneumoniae ou de H. influenzae afin de déterminer des cibles pharmacocinétiques et pharmacodynamiques pour un nouvel inhibiteur de la polypeptide déformylase. Les cercles représentent la charge bactérienne moyenne de quatre à cinq souris par groupe traitées avec des doses variables de composé.

Les cercles vides représentent l’aire libre sous la courbe et les cercles pleins représentent l’aire sous la courbe de temps de concentration au-dessus de la concentration minimale inhibitrice. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 30 secondes par animal, avec jusqu’à cinq ou six animaux inoculés par seringue d’inoculum d’agar. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer cette méthode d’infection intrabronchique non chirurgicale et être en mesure de l’utiliser pour établir des infections pulmonaires avec de nombreux isolats bactériens différents.

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