Name: Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Apprenez une technique microchirurgicale d'injection intracarotidienne de cellules cancéreuses pour créer des modèles de métastases cérébrales chez la souris. Cette méthode offre haute reproductibilité et faible variabilité pour étudier de nouvelles thérapies.

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Les auteurs n’ont aucune reconnaissance.

déclaration éthique: Toutes les études animales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université du Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Préparation de cellules cancéreuses pour injection <ol><li> Ensemencer les cellules cancéreuses d&#39;un ou deux jours avant l&#39;injection. Utilisez DMEM / F12 supplémenté avec 10% de FBS, à moins qu&#39;un moyen de spécialité est indiqué dans la littérature pour une lignée cellulaire particulière. </li><li> Le jour de l&#39;opération chirurgicale, les cellules de la récolte quand ils atteignent 70-80% de confluence par un premier lavage avec un milieu sans sérum une fois avant trypsinisation (0,25%) pendant 1 - 2 min à 37 ° C. Ajouter dans les cellules de 10% de FBS contenant du milieu DMEM / F12 pour étancher la trypsine à 0,25%. </li><li> Centrifuger les cellules à 80 × g pendant 3 min. Laver les cellules dans un milieu sans sérum deux fois pour éliminer le sérum résiduel, compter les cellules avec un hémocytomètre et remettre en suspension dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 1 - 5 x 10 6 cellules / ml, en fonction de la lignée cellulaire. Gardez sur la glacejusqu&#39;au moment de l&#39;injection. REMARQUE: MDA-MB-231 cellules de cancer du sein et des cellules de mélanome K1735 ont été utilisés dans cette étude, et les deux lignées cellulaires ont été utilisées à 2 x 10 6 cellules / ml de concentration. Gardez la durée de trypsinisation aussi courte que possible que surtraitement peut influencer les résultats des tests de métastases. </li></ol> 2. Préparer les souris pour cellules tumorales Injection <ol><li> Anesthetize souris par voie intrapéritonéale (ip) injection de kétamine / xylazine cocktail (kétamine 100 mg / kg, xylazine 10 mg / kg). </li><li> Confirmer anesthésie complète en pinçant les pieds des animaux et observer l&#39;absence de réponse. </li><li> Placez la souris sur une plaque de verre (utilisé pour la coulée de gels de protéines), et fixer avec des bandes de caoutchouc. </li><li> Si nécessaire, enlever les poils du cou par le rasage ou en appliquant une petite quantité de produit d&#39;épilation et essuyer les cheveux avec une serviette en papier. NOTE: Si vous utilisez la souris nude, sauter cette étape car ils ne possèdent pas les poils du corps. </li><li> Nettoyer la peau du cou en appliquantpovidone-iode et 70% d&#39;alcool. </li><li> Placer la souris sur platine du microscope à dissection </li><li> Faire une incision dans la peau ~ 1 cm de long avec un scalpel chirurgical. </li><li> Carrément disséquer le muscle avec une pince à dents pour exposer l&#39;artère carotide en dessous. </li><li> Séparer l&#39;artère carotide du nerf pneumogastrique adjacente avec des pinces chirurgicales. </li><li> En utilisant des pinces chirurgicales, séparer un peu de coton à partir d&#39;une boule de coton, humidifier, et de la mode dans une boule de coton plus petit. Placez cette boule de coton tampon humidifié sous l&#39;artère carotide du site prévu de l&#39;injection. </li><li> Placez une extrémité distale de suture et à proximité de la boule de coton et faire des noeuds lâches. Serrez le noeud proximal pour bloquer le flux sanguin dans le site d&#39;injection. </li><li> Passez à l&#39;injection des cellules cancéreuses si l&#39;artère carotide sur la boule de coton apparaît totalement sous pression avec du sang rouge frais. </li></ol> 3. Cancer cellulaire injection dans l&#39;artère carotide <ol><li> Vortex et d&#39;en tirer 100 pi oles cellules cancéreuses f dans la seringue. </li><li> Sous le microscope de dissection, insérez lentement le G aiguille 31 (avec biseau vers le haut) dans la lumière de l&#39;artère carotide assis sur le dessus de la boule de coton. </li><li> injecter lentement les cellules de la seringue dans l&#39;artère carotide. injection réussie peut être observée au microscope par la couleur changeante des vaisseaux sanguins à proximité et la musculature lorsque les cellules cancéreuses tamponnées sont poussés dans la circulation. </li><li> Lors de l&#39;injection de la totalité du volume est terminée, lever l&#39;artère carotide distale doucement pour éviter la régurgitation. </li><li> serrez rapidement le noeud distal pour terminer le processus d&#39;injection. </li><li> Après avoir terminé l&#39;injection, serrer les ligatures et couper la suture de soie en excès avec des micro-ciseaux sous le microscope de dissection. Reculer le muscle séparé pour couvrir le site de la plaie. Fermer la peau avec deux agrafes. </li></ol> 4. Récupération chirurgicale <ol><li> Déplacer l&#39;animal opéré sur un coussin chauffantpour la récupération. Il peut prendre 30 - 60 min pour que les animaux reprennent conscience. En attendant, administrer la buprénorphine (0,05 mg / kg) par injection sous - cutanée comme l&#39; analgésie post-chirurgicale. Remarque: L&#39;analgésie doit être fourni en fonction de votre IACUC locale protocole approuvé. </li><li> Une fois que les animaux se réveillent et reprennent leur comportement normal, retourner les souris à l&#39;emplacement de leur logement. Fournir des souris avec de la nourriture de gel pendant plusieurs jours après la chirurgie. Tenir un registre chirurgical et le garder dans la chambre. </li></ol> 5. Non-invasive imagerie in vivo <ol><li> Pour les cellules marquées avec des constructions rapporteurs luciférase, mesurer l&#39; efficacité des cellules cancéreuses d&#39;injection in vivo en utilisant le système d&#39;imagerie 14. REMARQUE: L&#39;imagerie est pas effectuée le jour de l&#39;injection pour éviter des contraintes excessives aux animaux de recherche. </li></ol>

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<li>Zhang, C., Zhang, F., Tsan, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+is+a+molecular+determinant+for+site-specific+melanoma+metastasis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 is a molecular determinant for site-specific melanoma metastasis in the brain.</a> Cancer Res. 69 (3), 828-835 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les étapes les plus critiques pour l&#39;injection artérielle carotidienne réussie de cellules cancéreuses sont: 1) une anesthésie profonde de la souris en vue d&#39;une opération chirurgicale; 2) mise en place régulière de l&#39;artère carotide au-dessus du support de coton; 3) la ligature serrée de l&#39;artère carotide après l&#39;injection réussie. anesthésie profonde de ~ 30 min est généralement nécessaire pour une performance chirurgicale régulière sous le microscope de dissection. Nou...

La métastase du cancer du système nerveux central (SNC) est une maladie dévastatrice, et peut impliquer soit le parenchyme cérébral ou les méninges ( «métastases cérébrales» désigne à la fois dans cet article). Il est la tumeur maligne intracrânienne prédominante, dépassant les gliomes primaires par&gt; 10: 1 1, 2. Le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome sont les trois principales maladies néoplasiques principales qui produisent une forte incidence de métastases cérébrales 3, 4. Au cours des dernières années, des progrès impressionnants dans de nouvelles thérapies contre le cancer ont considérablement prolongé la survie et l&#39;amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Cependant, lors de la récurrence, l&#39;incidence des métastases cérébrales augmente rapidement. Par exemple, le trastuzumab anticorps anti-HER2 (Herceptin) a démontré une efficacité clinique significative chez les patients atteints HER2 cancer du sein; encore une tendance inquiétante est apparuechez ces patients: jusqu&#39;à 1/3 de ceux dont la maladie systémique extracrânien initialement bénéficié d&#39; un traitement de trastuzumab plus tard développer des métastases cérébrales 5, 6, 7. Malheureusement, les patients atteints de métastases cérébrales sont réfractaires à presque tous les traitements actuels, connaît généralement une détérioration traumatique de la qualité de vie et leur survie à un an après le diagnostic est seulement ~ 20% 8. Les thérapies actuelles pour des métastases cérébrales (y compris des stéroïdes, la radiothérapie crânienne, et la résection chirurgicale chez des patients sélectionnés) sont palliatifs simplement, non curatif 9. Par conséquent, des métastases cérébrales est en train de devenir le prochain imposant défi en cette ère de nouvelles thérapies contre le cancer. Pour relever le défi non satisfaits des patients sont confrontés chaque jour à la clinique, il est urgent de mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de métastases cérébrales et utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles thérapies. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; colonisation réussie du cerveau par des cellules cancéreuses métastatiques nécessite des performances d&#39;une série de fonctions médiées par l&#39;interaction complexe de plusieurs joueurs biologiques, tels que le by-pass de la barrière hémato-encéphalique (BBB) ​​et d&#39;échapper à partir du cerveau de intrinsèque des mécanismes de défense immunitaire 10, aucune d&#39; entre elles est récapitulée dans une ex vivo ou in vitro. système Par conséquent, bon et fidèle des modèles in vivo sont critiques pour les études de métastases cérébrales. Un essai classique dans les métastases in vivo des cellules cancéreuses introduit par injection dans la veine caudale, ce qui entraîne la majorité des cellules à se loger dans les poumons. Lésions métastatiques cérébrales sont rarement produites dans ces modèles avant la mort animale causée par la charge tumorale dans les poumons 11. injection intracérébrale directe des cellules cancéreuses de la tumeur produit excroissance constante dans le système nerveux central et est largement utilisé dans les études de gliomes primaires. Cependant, sinjection uch compromet la BHE et provoque des lésions traumatiques au niveau du site d&#39;injection, les deux principaux points de préoccupation quant à la pertinence physiologique de ce modèle. Une autre cellule cancéreuse l&#39;introduction voie fréquemment utilisé, l&#39;injection intracardiaque, est facile à administrer et ne produit métastase expérimentale au SNC. Cependant, les métastases simultanées vers des sites d&#39;organes autres que le SNC sont toujours produites et peuvent causer la mortalité des animaux 11; par conséquent, le degré élevé de variabilité de ce modèle, il est inapproprié pour l&#39;évaluation quantitative des mécanismes biologiques ou d&#39;agents thérapeutiques avec un nombre limité d&#39;animaux. Nous décrivons ici les procédures pour produire expérimentale des métastases cérébrales via l&#39;injection de cellules cancéreuses dans l&#39;artère carotide commune. Nous avons utilisé cette approche pour disséquer les contributions des gènes individuels à la cascade métastatique des métastases cérébrales et d&#39;évaluer l&#39;efficacité d&#39;une intervention thérapeutiques 12, 13. Les principaux avantages de cette approche sont le degré élevé de reproductibilité et de faible degré de variabilité; l&#39;inconvénient majeur est la sophistication et de la dextérité nécessaire pour réaliser la microchirurgie.

<table><tbody><tr><td>Solution de chlorhydrate de kétamine/chlorhydrate de xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope de routine Leica M50</td><td>Leica</td><td>M50</td><td>Le microscope est modulaire et hautement configurable pour s’adapter à des exigences d’espace particulières.</td></tr><tr><td>Scapel chirurgical jetable</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>pour faire des incisions cutanées</td></tr><tr><td>Pince à tissus - 1 x 2 dents</td><td>Fine Science Tools</td><td>11021-12</td><td>pour disséquer brutalement les mucles</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pince à finition miroir</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-23</td><td>pour séparer et préparer l’artère carotide pour l’injection</td></tr><tr><td>Ciseaux à ressort</td><td>Outils de science fine</td><td>15025-10</td><td>pour couper les sutures</td></tr><tr><td>EZ Clip Kit</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>pour plaie cloure</td></tr><tr><td>BD Seringue à insuline</td><td>Becton Dickinson</td><td>328438</td><td>pour injection cellulaire</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Système d’imagerie</td><td>PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr></tbody></table>

intracarotidienne cancer cell injection pour produire des modèles de souris de brain métastase

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Les métastases, la prolifération et la croissance des cellules malignes à des sites secondaires à l&#39;intérieur du corps d&#39;un patient, représente&gt; 90% de la mortalité liée au cancer. Récemment, des progrès impressionnants dans les nouvelles thérapies ont considérablement prolongé la survie et l&#39;amélioration de la qualité de vie de nombreux patients atteints de cancer. Malheureusement, l&#39;incidence du cerveau récurrences métastatiques est en augmentation rapide, et toutes les thérapies actuelles ne sont que des palliatifs. Par conséquent, de bons modèles animaux expérimentaux sont nécessaires de toute urgence pour faciliter les études approfondies de la biologie de la maladie et d&#39;évaluer de nouveaux schémas thérapeutiques pour l&#39;évaluation préclinique. Cependant, la norme dans le dosage des métastases in vivo via une injection dans la veine caudale des cellules cancéreuses produit principalement des lésions métastasiques du poumon; animaux succombent généralement à la charge de la tumeur du poumon avant toute excroissance significative des métastases cérébrales. l&#39;injection intracardiaque de cellules tumorales produit des lésions métastatiques à des sites multiples organes, y compris le cerveau; cependant, le variabilité de la croissance tumorale produite avec ce modèle est grand, freinant son utilité dans l&#39;évaluation de l&#39;efficacité thérapeutique. Pour générer des modèles animaux fiables et cohérentes pour l&#39; étude du cerveau de métastases, ici , nous décrivons une procédure pour la production expérimentale des métastases du cerveau dans la maison de souris (Mus musculus) par injection intracarotidienne des cellules tumorales. Cette approche permet de produire un grand nombre de cerveau des souris métastase porteurs ayant des caractéristiques de croissance et de mortalité similaires, facilitant ainsi les efforts de recherche pour étudier les mécanismes biologiques de base et d&#39;évaluer de nouveaux agents thérapeutiques.

Il y a deux points où la qualité de l&#39;injection peut être évaluée. La première occasion est par l&#39;observation de l&#39;opérateur de changer les couleurs des vaisseaux sanguins lors de l&#39;injection. Fuites d&#39;injections pauvres peut être facilement observé sous le microscope de dissection. Le placement stable et sécurisé du corps de la souris (figure 1A) et son artère carotide (figure 1B) sur la boule de coton de soutien sont des facteurs cr...

métastases cérébrales est devenu un besoin médical non satisfait urgent que son incidence a augmenté tandis que les options thérapeutiques sont restés palliatifs. La création de modèles animaux expérimentaux de métastases cérébrales par injection artérielle intracarotidienne des cellules cancéreuses facilite les études mécanistiques de la biologie de la maladie et l&#39; évaluation de nouveaux schémas d&#39;intervention.

Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Le but global de cette injection microchirurgicale de cellules cancéreuses par l'artère carotide est de produire des modèles expérimentaux cohérents de métastases cérébrales in vivo chez la souris. Cette méthode peut donc aider à répondre à des questions clés dans le domaine des métastases cérébrales, comme de savoir si un nouveau traitement pourrait présenter une efficacité contre les métastases cérébrales. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de générer des métastases cérébrales expérimentales in vivo avec une forte reproductibilité et une faible variabilité.En général, les personnes novices dans cette technique éprouvent initialement des difficultés, car une pratique suffisante est nécessaire pour maintenir une main ferme afin d'injecter les cellules cancéreuses dans l'artère carotide de ces souris sous microscope. Commencez cette procédure en semant les cellules cancéreuses dans un milieu DMEM F12 enrichi avec 10 % de FPS et en les cultivant pendant un à deux jours avant l'injection. Le jour de l'intervention chirurgicale, retirez les cellules de l'incubateur et récoltez-les lorsqu'elles atteignent une confluence de 70 % à 80 % en les lavant avec un milie

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Cette vidéo démontre l’implantation de cellules tumorales dans le cerveau de souris en effectuant une injection intracrânienne.

Modèle orthotopique intracrânien : une procédure pour implanter des cellules cancéreuses dans le cerveau d’une souris

Cette vidéo démontre l’établissement d’un modèle murin de métastases cérébrales par injection intracarotidienne de cellules cancéreuses marquées par fluorescence. Le modèle murin peut être utilisé pour étudier les effets de nouvelles thérapies et les mécanismes physiologiques sous-jacents.

Modèle murin de métastases cérébrales : méthode de génération d’un modèle murin de métastases cérébrales par injection intracarotidienne de cellules cancéreuses

Source : Lim, M.,  et al. Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne. J. Vis. Exp. (2022)Dans cette vidéo, une souris anesthésiée subit une intervention chirurgicale au cours de laquelle des cellules cancéreuses sont injectées dans l’artère carotide commune (ACC) pour faciliter l’administration ciblée au cerveau. La procédure implique une suture précise et une manipulation des artères carotides pour diriger les cellules injectées...

Modélisation des métastases tumorales cérébrales par injection interne de cellules cancéreuses dans l’artère carotide

Un modèle murin de cancer du cerveau de métastase est établi par échographie injection intracardiaque guidée par imagerie de cellules MDA-MB231/Br-GFP. Développement des métastases intracrâniennes multifocales a été suivie longitudinalement en utilisant à haute résolution de 9,4 T IRM.

Ultrasound Imaging guidée injection intracardiaque de développer un modèle de souris de cancer du sein métastases cérébrales Suivi par IRM longitudinale

La modélisation intracrânienne de métastase de cerveau est compliquée par une incapacité de surveiller la taille et la réponse de tumeur au traitement avec des méthodes précises et opportunes. La méthodologie présentée couple l’injection intracrânienne de tumeur avec l’analyse de formation image de résonance magnétique, qui une fois combinée, cultive des injections précises et cohérentes, la surveillance accrue d’animal, et les mesures précises de volume de tumeur.

Modélisation des métastases cérébrales par injection intracrânienne et imagerie par résonance magnétique

Nous décrivons un modèle murin xénogreffé de métastases cérébrales du cancer du sein générées par injection veineuse de la queue d’une lignée cellulaire de cancer inflammatoire du sein amplifiée par HER2 de manière endogène.

Modélisation des métastases cérébrales par injection veineuse de cellules inflammatoires du cancer du sein

Les métastases cérébrales sont une cause de morbidité et de mortalité sévères chez les patients atteints de cancer. La plupart des modèles murins de métastases cérébrales sont compliqués par des métastases systémiques confondant l’analyse de la mortalité et des résultats des interventions thérapeutiques. Présenté ici est un protocole pour l’injection carotidienne interne de cellules cancéreuses qui produit des tumeurs intracrâniennes cohérentes avec des tumeurs systémiques minimales.

Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne

Les tumeurs du système nerveux central (SNC) sont la principale cause de décès liés au cancer chez les enfants, et les thérapies immunitaires locorégionales sont de plus en plus testées pour les patients dans les essais cliniques. Ce protocole décrit des méthodes d’implantation de canules locorégionales chez la souris pour l’évaluation préclinique de perfusions immunothérapeutiques ciblant les tumeurs du SNC.

Implantation intracrânienne de canules pour des perfusions de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) locorégional en série chez la souris

La réparation de l’artère intracarotide dans un modèle murin après injection ramène le flux sanguin vers l’artère sans affecter négativement la distribution du matériau injecté. La réparation du site d’injection facilite les injections ultérieures par la même artère et prévient l’ischémie cérébrale chez les souches de souris qui n’ont pas un cercle complet de Willis.

Facilitation des injections intracarotidiennes répétées dans des modèles murins par une nouvelle technique de réparation du site d’injection

Ce manuscrit présente en détail la procédure d’injection intra-iliaque dans l’artère iliaque (AII), une technique permettant d’administrer des cellules cancéreuses spécifiquement aux tissus des membres postérieurs, y compris les os, afin d’établir des métastases osseuses expérimentales. Bien qu’initialement établi avec des modèles de tumeurs mammaires, ce protocole peut être facilement étendu à d’autres types de cancer.

Intra-iliaque Artère injection pour la modélisation efficace et sélective des métastases osseuses Microscopique

Apprenez une technique microchirurgicale d'injection intracarotidienne de cellules cancéreuses pour créer des modèles de métastases cérébrales chez la souris. Cette méthode offre haute reproductibilité et faible variabilité pour étudier de nouvelles thérapies.

Intracarotidienne Cancer Cell Injection pour produire des modèles de souris de Brain Métastase

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