Génération d'Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules iPS à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain adulte à l’aide de vecteurs épisomaux non intégrateurs. Ce protocole peut aider les scientifiques dans le domaine des cellules souches qui souhaitent générer des cellules iPS pour la surveillance des maladies, le dépistage de médicaments et la radiomédecine régulière. Notre protocole de reprogrammation est très simple, mais très efficace.

Suite à cette procédure, on peut facilement maîtriser la technique de reprogrammation des cellules sanguines. La qualité du plasma est tout aussi importante pour une reprogrammation réussie. Les contaminants peuvent diminuer l’efficacité de la reprogrammation, c’est pourquoi nous recommandons d’utiliser des kits Endofree pour purifier les plasmides épisomaux.

Les cellules iPS sont plus fragiles que les autres cellules. La préparation de cellules pour plus d’un gène lors du passage d’un gène peut induire des morts cellulaires massives, en particulier lors des passages précoces. Pour commencer cette procédure, préparez tous les milieux de culture requis conformément au manuscrit ci-joint.

Mélangez ensuite 10 ml d’échantillon PB frais et dix ml de tampon PBS dans un tube de 50 ml et mélangez bien. Amenez PBS à température ambiante ou à 37 degrés Celsius avant utilisation. Ensuite, ajoutez 10 ml de ficoll au fond du tube.

Ce processus doit être effectué lentement pour s’assurer que la couche de ficoll ne se mélange pas avec le PB. Centrifuger le mélange à 400 x g pendant 30 minutes avec une faible accélération et décélération. Après centrifugation, les MNC PB se trouvent dans la couche blanche située entre le plasma PB et le ficoll. Aspirez lentement 10 ml de plasma PB sans perturber la couche de ficolle chamois.

Ensuite, récoltez soigneusement la couche blanche dans un nouveau tube de 50 ml. Le volume total des cellules collectées dans la couche blanche doit être d’environ trois à six ml. Après cela, ajoutez du PBS pour porter le volume total à 30 ml et mélangez bien.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 400 x g pendant dix minutes. Au bout de dix minutes, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 mL de milieu de culture. Mélangez bien et centrifugez l’échantillon à 400 x g pendant cinq minutes pour retirer la majorité des plaquettes.

Par la suite, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un à deux mL d’IMDM. Les cellules peuvent être utilisées pour une culture immédiate ou congelées pour une utilisation ultérieure. Pour la cryoconservation, ajoutez une quantité égale de milieu de cryoconservation.

Aliquote les cellules dans des cryoflacons et transférez-les immédiatement dans un congélateur à 80 degrés Celsius. Dans cette procédure, préparez cinq mL de milieu IMDM dans un tube de 15 mL. Décongelez rapidement les MNC PB congelés dans un bain-marie à 37 degrés Celsius avant de les transférer dans le tube avec un milieu IMDM.

Centrifugez l’échantillon à 400 x g pendant cinq à dix minutes. Ensuite, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu érythroïde. Comptez ensuite les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre.

Par la suite, la culture de MNC PB dans une culture non tissulaire a traité une plaque à six puits avec deux mL de milieu par puits à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Le troisième et le cinquième jour, ajoutez un ml de milieu érythroïde frais directement dans chaque puits sans changer de milieu. Le sixième jour, récoltez les MNC PB pour la nucléofection.

Un jour avant la nucléofection, pré-enrobez la plaque à six puits traitée de culture tissulaire avec 0,1 % de gélatine à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Décongelez les cellules d’alimentation MEF inactivées dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius et transférez-les immédiatement dans un tube de 15 ml contenant cinq ml de milieu MEF. Ensuite, centrifugez-les à 400 x g pendant cinq minutes et retirez le surnageant.

Retirez ensuite la gélatine de la plaque à six puits et remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu MEF. Ensuite, ensemencez les cellules MEF inactivées dans deux mL de milieu MEF dans chaque puits d’une plaque à six puits prétraitée à la gélatine et cultivez-les à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Le jour de la nucléofection, aspirez le milieu MEF et remplacez-le par un mL de milieu érythroïde.

Ensuite, pré-équilibrez la plaque de culture pendant 10 à 30 minutes à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5 % de dioxyde de carbone. Ajoutez deux microgrammes de PEV OCT4 à Sox2, un microgramme de PEV MYC, un microgramme de PEV KLF4 et 0,5 microgramme de PEV Bcl-XL dans un tube stérile de 1,5 ml. Chauffez le tube à 50 degrés Celsius pendant cinq minutes pour éviter toute contamination, puis refroidissez-le à température ambiante.

Ensuite, ajoutez 57 microlitres de tampon de nucléofection et 13 microlitres de tampon de supplément à l’échantillon. Récolter deux fois dix à sixième PBMNC cultivés dans un tube de cinq mL par centrifugation à 200 x g pendant sept minutes. Après cela, retirez le surnageant et ajoutez le mélange de plasmide et de tampon de nucléofection à la pastille cellulaire.

Ensuite, mélangez bien en effleurant le tube avec un doigt. Ensuite, transférez l’ADN en suspension cellulaire dans la cuvette fournie par le kit et bouchez la cuvette. Sélectionnez le programme U-008 sur l’appareil de nucléification.

Ensuite, insérez la cuvette dans le support et appuyez sur OK. Ensuite, sortez la cuvette du support. Ajoutez 0,5 à 1 ml de milieu érythroïde préchauffé dans chaque cuvette et transférez immédiatement les cellules sur la plaque MEF pré-équilibrée. Pour certains échantillons, vous pouvez obtenir des milliers de colonies à partir d’un mil de sang.

Si vous souhaitez choisir une seule colonie pour une culture ultérieure, vous devrez peut-être bien ensemencer un puits supplémentaire avec seulement 1 million de cellules. Juste avant de placer la chambre d’hypoxie dans l’incubateur, secouez doucement la chambre plusieurs fois pour créer une répartition uniforme des cellules dans les puits de culture. Transférez ensuite la plaque dans une chambre d’hypoxie.

Rincez la chambre avec un gaz mélangé pendant une à deux minutes à raison de 20 litres par minute. Ensuite, scellez la chambre et cultivez l’échantillon à 37 degrés Celsius. Le deuxième jour après la nucléification, ajouter deux mL de milieu iPSC directement dans chaque puits.

Le quatrième jour après la nucléification, prélever trois mL de milieu et ajouter deux mL de milieu iPSC frais. À ce stade, la plupart des cellules vivantes se sont attachées à la couche nourricière. Après le sixième jour après la nucléofection, changez le milieu tous les deux jours en laissant 500 microlitres de milieu épuisé et en ajoutant deux ml de milieu E8 frais complété par 0,25 millimolaire de butyrate de sodium jusqu’aux jours 14 à 18.

Voici un schéma du protocole de reprogrammation des cellules sanguines périphériques. Cette image montre l’AP debout dans le bol, et celle-ci montre une colonie typique d’iPSC de type ESC le jour 14 après la nucléofection des MNCs PB. Voici des diagrammes FACS représentatifs des iPSC au passage cinq exprimant TRA-1-60 ou SSEA4.

Voici les images confocales représentatives des colonies d’iPSC exprimant NANOG et OCT4. Les images ci-dessous montrent la coloration H&E du terratome, comprenant les trois couches germinales. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des cellules iPS sans intégration à partir de cellules mononucléées de sang périphérique humain.

Une fois maîtrisé, on peut générer de grandes quantités de cellules iPS en trois semaines, de sorte que le temps de manipulation sera inférieur à trois heures. Nous avons mis au point un système de vecteurs épisomiques simple pour une reprogrammation efficace des cellules sanguines. Nous pensons que ce système abordable peut être facilement adopté, en particulier dans les petits laboratoires aux ressources limitées.

N’oubliez pas que travailler avec du sang et des plasmas humains peut être dangereux et que des précautions doivent être prises, telles que le port de gants et de blouses de laboratoire lors de cette procédure.