Name: 通过神经树桩将钙染料加载到青蛙神经末梢:青蛙神经肌肉接头中的钙瞬态登记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 5 s
Description: 学习通过神经树桩将钙敏感染料加载到青蛙神经末梢的方法，用于记录和分析突触活动中的快速钙瞬态。该技术有助于研究药物对突触前钙水平的影响，深化对神经肌肉接头钙信号机制的理解。

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本研究在俄罗斯政府支持喀山联邦大学竞争力提升计划以及俄罗斯基础研究基金会（16-04-01051；16-34-00817；15-04-02983）的资助下完成。感谢四位匿名审稿人对本文初稿提出的宝贵意见。感谢尤利娅·阿拉茨卡娅（Yuliya Aratskaya）提供语音录制。我们衷心感谢维克托·伊里因博士（Dr. Victor Ilyin）提出的诸多有益建议，以及在文稿最终编辑过程中提供的帮助。

实验采用Rana ridibunda蛙的musculus cutaneous pectoris（胸皮肌）离体神经-肌肉标本进行。雌雄动物体长约为5–9 cm。实验操作遵循喀山联邦大学和喀山医科大学关于实验动物使用的指南，并符合《美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南》。实验方案符合欧洲共同体理事会指令86/609/EEC的要求，并经喀山医科大学伦理委员会批准。
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>任氏液的配制。
	<ol>
		<li>配制任氏液：113.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、3.0 mM NaHCO3 和 1.8 mM CaCl2。调节 pH 至 7.2–7.4。</li>
		<li>配制低 Ca2+ 高 Mg2+ 的任氏液：113.0 mM NaCl、2.5 mM KCl、3.0 mM NaHCO3、6.0 mM MgCl2、0.9 mM CaCl2。调节 pH 至 7.2–7.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染料负载溶液的配制。
	<ol>
		<li>配制含 10 mM HEPES-Na 的水溶液（pH 7.2–7.4）。</li>
		<li>向含有染料30 的小瓶中加入 14 µL HEPES 溶液。 
		注意：Ca2+ 指示染料为每瓶 500 µL，含 500 µg 粉末。</li>
		<li>涡旋混匀后离心，确保充分混合。</li>
		<li>稀释溶液，使 Ca2+ 指示剂的终浓度为 30 mM。避免光照，于 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 染料负载步骤
<ol>
	<li>用一块胸皮肌进行解剖 胸固有肌 神经 
	注意：解剖步骤详见Blioch发表的论文免费下载版本 等, 196831.
	<ol>
		<li>解剖操作时，使用两把精细镊子和角膜剪（参见 材料列表将解剖后的组织转移至预先加入任氏液的硅胶弹性体包被的培养皿中，并用细不锈钢针固定组织，使其在培养皿中轻微拉伸。</li>
		<li>重新用一份新鲜的任氏液填充培养皿。去除结缔组织，注意不要损伤神经。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备填充移液管：使用剃刀刀片，从标准塑料移液管的锥形部分切下一段长约2 mm的片段 10 µL 移液器吸头</li>
	<li>准备一块油灰泥，用于将填充移液管固定在培养皿上。</li>
	<li>通过硅胶管和由移液枪头制成的塑料连接适配器，将填充移液管的后端连接至塑料注射器。</li>
	<li>在染料加载程序之前，使用塑料移液管从培养皿中移除任氏液。用精细的注射器将肌肉-神经标本吸干；这可以防止钙指示剂被稀释2+ 染料在随后填充移液管时的加载情况。</li>
	<li>去除 Ca2+ 从冷冻箱中取出指示剂小瓶，置于避光处室温下解冻。</li>
	<li>在体视显微镜下以低倍率（10×）观察，辨认肌肉与神经的连接处。使用精细镊子和剪刀剪断 胸肌 proprius 神经靠近肌肉表面处（见步骤2.1），保留约2 mm长的神经残端。</li>
	<li>使用油灰固定连接在管路和注射器上的填充移液管，并将其固定在培养皿上。</li>
	<li>将移液器尖端移至靠近神经残端处。</li>
	<li>在不夹捏的情况下，轻柔地将神经残端吸入灌注移液管的尖端。</li>
	<li>将吸液管从填充移液管的钝端取下。</li>
	<li>使用带有长针头的注射器小心吸除填充移液管中的多余溶液（参见 材料列表）。不要夹捏神经残端。</li>
	<li>将灌注移液管的尖端略微垂直上提，同时保持神经残端被吸入在尖端内。</li>
	<li>使用凡士林将神经残端被抽吸部分与填充移液管尖端外部隔绝。</li>
	<li>必要时使填充移液管中绝缘的神经残端干燥：使用带长针头的注射器轻轻抽吸填充移液管中多余的溶液。</li>
	<li>绘制 0.5 µL 使用带长吸头的移液器加入染料负载溶液（见步骤1）。</li>
	<li>轻轻将装有上样溶液的移液枪头插入灌注毛细管中，直接将混合液排出至神经残端。</li>
	<li>用凡士林密封填充移液管的开口端。</li>
	<li>向培养皿中加入少量林格氏液，以保持标本湿润。</li>
	<li>在室温、避光且湿润的条件下孵育样品5小时。</li>
	<li>移除装有加载溶液的填充移液管，用任氏液冲洗制备样本，并将其置于冰箱中过夜保存于 8 °C.</li>
</ol>
3. 显微镜观察前的组织制备
<ol>
	<li>将制备好的样本放入涂有硅胶弹性体的腔室中，并用钢制微针固定，使其轻微拉伸。</li>
	<li>用一份新鲜的任氏液冲洗组织。</li>
	<li>使用吸吮电极刺激神经；电极的构建方法可从Kazakov et al., 201532 的论文免费下载获取。将电极尖端靠近神经的切断端，并将神经残端吸入电极孔中。</li>
	<li>将制备腔室安装在显微镜载物台上。将温度探头以及灌流系统的进液和出液管路置于腔室内。</li>
	<li>将电源线连接至帕尔贴元件。</li>
	<li>采用简单的重力驱动系统对样本进行灌流。为去除多余的溶液，开启灌流吸引泵。</li>
	<li>打开温控装置。</li>
	<li>将温度设定为 20 °C。</li>
	<li>安装紫外防护罩。</li>
	<li>将刺激导线电极连接至电刺激器，并在显微镜下使用 4× 物镜观察肌肉收缩情况。</li>
	<li>用低 Ca2+、高 Mg2+ 的任氏液填充灌流系统。 
	注意：该溶液用于防止肌肉收缩。降低细胞外钙浓度并提高镁浓度可减小 Ca2+ 瞬变的幅度。然而，根据以往经验，0.9 mM CaCl2 和 6 mM MgCl2 仍足以可靠地检测 Ca2+ 瞬变的幅度。需要指出的是，还存在其他一些在不降低 Ca2+ 浓度的情况下抑制肌肉收缩的方法。例如，使用 d-筒箭毒碱或 α-银环蛇毒素（烟碱型乙酰胆碱受体的特异性阻断剂）可完全或部分阻断肌肉抽搐17,27,28,30。然而，添加这些毒素也可能影响突触前钙离子内流33。为避免此问题，可使用 µ-芋螺毒素 GIIIA27。</li>
	<li>启动泵，开始用低 Ca2+、高 Mg2+ 的任氏液对样本进行灌流。</li>
	<li>切换至显微镜的 40× 物镜。</li>
	<li>打开单色器（参见 材料表）。</li>
	<li>在单色器控制软件中选择 488 nm 的发射波长，并设置为连续照明模式。</li>
	<li>在荧光模式下使用高倍镜观察，确认神经末梢已成功加载染料。</li>
</ol>
<img alt="神经元荧光显微镜、细胞结构、树突可视化、显微成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：载有Ca2+指示剂的神经及末梢。（A）加载Ca2+指示剂后神经的填充情况。比例尺 = 200 µm。（B）神经末梢中充满Ca2+指示剂。比例尺 = 20 µm。（C）神经末梢中Ca2+指示剂的荧光清晰可见。比例尺 = 20 µm。<a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="17">
	<li>在低 Ca2+ 和高 Mg2+ 溶液中，使样品至少平衡 30 分钟。</li>
</ol>
4. 使用数字CCD相机进行视频采集
注意：捕获荧光信号的具体参数因显微镜和相机类型而异，但关键因素是图像采集速度。
<ol>
	<li>在记录神经肌肉接头（NMJ）单个 Ca2+ 瞬变时，应使用 1 kHz 作为最低采集频率。 
	注意：荧光成像需要使用高速数字 CCD 相机（参见材料表）。此处使用数据采集系统及配套软件（参见材料表）实现相机、单色仪和刺激器的同步。简而言之，本方案可通过数据采集系统的数字输出生成同步脉冲，以控制快门开启、视频信号采集和刺激启动。所有时间参数均可在实验协议和/或设备上进行设置。典型的采集方案为以 1 kHz 采集 500 帧图像（80 × 80 像素）。激发光照射可能导致 Ca2+ 指示剂漂白并对细胞组织造成光损伤，因此应避免长时间暴露于激发光下。在本方案中，快门仅在采集视频所需的时间内开启。每个特定神经末梢需采集 20 组序列。本实验的目标是在对照组和给药后持续监测相同位点。</li>
	<li>在显微镜 4X 物镜下，使用明场模式观察肌肉和神经分支。</li>
	<li>切换至 40X 物镜，使用落射荧光模式并设置激发波长为 488 nm，寻找染料标记的神经末梢，确定感兴趣的神经末梢区域。</li>
	<li>在显微镜三目镜筒上，选择光路切换档位：100% 光线导向相机。</li>
	<li>启动 CCD 相机的采集软件。</li>
	<li>在“实时”模式下，找到感兴趣区域（ROI）并调节焦距。</li>
	<li>选择菜单中的“更改”设置。</li>
	<li>使用“基本配置”，设置帧速率为每秒 1,000 帧（fps），分辨率为 80 × 80。</li>
	<li>设置输入帧数为 500 帧。</li>
	<li>输入实验名称。</li>
	<li>选择“外部触发”模式。</li>
	<li>将触发前时间设置为 10 ms。</li>
	<li>设置重复次数为 20 次。</li>
	<li>在单色仪控制软件中，选择发射波长为 488 nm，并启用“外部触发照明”模式。</li>
	<li>运行数据采集软件。</li>
	<li>加载刺激方案。</li>
	<li>在录制视频前，使用视频采集软件采集暗场图像。</li>
	<li>运行刺激方案。</li>
	<li>选择感兴趣区域（ROI）并检查所记录的信号。</li>
</ol>
5. 数据分析
注意：进行数据分析时，使用CCD相机软件和ImageJ；数据以电子表格程序中的曲线形式呈现。在CCD相机软件中，对20次重复进行平均，并将结果导出为ImageJ支持文件。在ImageJ中，选择感兴趣区域（ROI）和背景区域。从ROI中减去背景信号。将数据表示为比率形式：(ΔF/F0 -1) × 100%，其中ΔF为刺激期间的荧光强度，F0为静息状态下的荧光强度。
<ol>
	<li>在CCD相机的采集软件中，点击文件 &gt; 平均文件。选择文件并对其进行平均处理。</li>
	<li>点击“另存为Fit文件”将平均后的文件保存为.fit文件。</li>
	<li>运行ImageJ软件。执行以下步骤：</li>
	<li>点击图像 &gt; 调整 &gt; 亮度/对比度。</li>
	<li>点击图像 &gt; 图像栈 &gt; 工具 &gt; 图像栈排序器。</li>
	<li>点击分析 &gt; 工具 &gt; ROI管理器。</li>
	<li>将平均后的.fit文件拖放到ImageJ窗口中。</li>
	<li>放大窗口以获得更好的视野。</li>
	<li>通过移动光标，选择最后一帧并将其删除（此为暗帧）。</li>
	<li>在认为是背景的区域上选择一个矩形ROI，并将其添加到ROI管理器中。</li>
	<li>点击更多 &gt; 多次测量，测量背景。记录平均值（MEAN）。复制数据并导出至电子表格程序，计算用于比率分析的阈值平均值。</li>
	<li>点击处理 &gt; 主功能 &gt; 减去，从图像栈中减去该阈值。输入计算得到的阈值平均值。</li>
	<li>在神经末梢周围选择一个矩形ROI，并将其添加到ROI管理器中。</li>
	<li>点击更多 &gt; 多次测量进行测量。记录平均值（MEAN）。复制并导出至电子表格程序。</li>
	<li>对信号的偏移量进行平均。 
	注意：使用前几十个未受刺激时显示基础染料荧光的点；此即静息状态下的荧光。</li>
	<li>将信号除以静息状态下的荧光值。</li>
	<li>减去“1”后乘以100%。</li>
	<li>绘制信号曲线，并计算Ca2+瞬变的幅度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何披露信息。

在本文中，我们介绍了进行 Ca2+-通过神经残端将对敏感性染料加载至蛙类神经末梢。在染料加载过程结束时，神经近端部分的所有末梢均显示出显著的荧光水平。据估计，末梢内的探针浓度在40至150 µM之间17.
孵育过程分为两个步骤：首先在室温下进行，然后在冰箱中较低温度下继续。控制组织在室温下与染料孵育的时间非常重要。根据神经残端的实际长度、所用染料的种类以及温度的不同，孵育时间可能有所变化。如果孵育时间过长，靠近神经残端近端的末梢可能会过度负载。然而，在神经的中段，仍有可能找到染料负载情况满意的末梢。在冰箱中长时间孵育过程中，染料会均匀分布于神经末梢。
我们自己的观察结果33,35以及其他研究者的数据30均证明，染料加载过程对突触后反应的幅度或微型终板电位的频率均无明显影响。在已加载的标本中，观察到了良好的长期存活性。我们希望强调一些重要的注意事项。在神经切除后数分钟内必须将神经残端放入染料加载溶液中，以使染料能够进入切断的神经轴突；延迟操作可能导致加载效率低下，这可能是由于神经轴突发生再封闭所致27,36。一些研究者在切除神经后立即将其残端浸入100 mM EDTA（一种Ca2+和Mg2+螯合剂）中，以防止切断的轴突再封闭。1-2分钟后去除缓冲液，并替换为染料加载溶液37。在加载过程中使用石蜡油围成的凹槽而非塑料套管，可允许使用更短的神经残端。采用该方法时，在神经浸入含染料的HEPES溶液后才进行切断，由于染料溶液中缺乏二价离子，轴突不会发生再封闭27,28。
在本研究中，我们采用了水溶性的 Ca2+ 指示剂盐形式，而非葡聚糖形式。与盐形式相比，葡聚糖偶联物在轴突中的扩散速度较慢。然而，使用葡聚糖偶联物可减少染料在神经及神经肌肉接头处的区室化现象和细胞处理。钙绿素 Green 1-3,000 MW 葡聚糖偶联物具有良好的扩散速率，并表现出较低的区室化倾向38。
避免对组织进行长时间的荧光照射非常重要，因为这会影响其健康和存活。我们在可见光通道中使用诺马尔斯基光学器件来寻找神经末梢。在记录过程中，我们使用光圈来限制照明视野。
值得注意的是，这种加样方法仅适用于能够耐受长时间孵育的样本。当对较为脆弱的组织（例如，温血动物的突触）进行研究时，为缩短染料加载时间，有必要缩短神经残端长度，并使用微管吸头进行加样29,39。
这种加载技术非常适合在单次神经刺激和节律性突触活动条件下，利用荧光指示剂对胞质内Ca2+的变化进行成像17,27,35。通过分析Ca2+瞬变幅度，可用于研究不同物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响33。

钙离子（Ca2+）参与多种神经元信号传导过程，包括递质释放的启动、维持以及可塑性1,2,3,4,5。当动作电位到达时，细胞外的 Ca2+ 进入神经末梢，从而启动神经递质的释放。在某些突触中，钙电流可通过电生理学方法直接测量6,7,8。然而，在神经肌肉接头（NMJ）处，由于神经末梢尺寸极小，无法使用直接的膜片钳或双电极电压钳技术进行测量。
可通过间接电生理学方法记录神经肌肉接头（NMJ）神经末梢的内向Ca2+电流9,10。然而，这些方法需要预先使用钠离子和钾离子通道阻断剂处理突触。光学方法则无需对神经末梢中的离子电流进行药理学分离，能够记录由动作电位触发的Ca2+内流以及随后轴浆中Ca2+离子浓度的升高11,12,13,14。这些方法基于特异性Ca2+敏感性染料在结合游离Ca2+离子后荧光信号变化的记录15,16,17,18,19。
根据实验目的的不同，可通过多种方法将Ca2+指示剂载入细胞。研究人员常采用灌流方式施加膜通透性染料20,21、通过膜片钳电极加载22，或进行显微注射23,24,25。然而，由于神经肌肉接头（NMJ）在突触结构上的特殊性，上述所有方法在应用于NMJ时均存在一定局限性。对于NMJ而言，最方便且成功的方法是通过神经残端加载染料，即顺向填充法26,27,28,29。该技术可用于将多种荧光染料载入外周神经末梢。此方法已成功应用于果蝇（Drosophila）神经末梢28、蜥蜴运动神经28以及蛙类运动神经末梢17,26,27,30。根据研究对象的不同，具体操作细节可能有所调整。对于幼虫的小神经，可使用玻璃微电极进行操作28。已有若干研究人员描述过一种方法27,28，即将支配肌肉的神经新鲜切断端浸入预先盛有染料的小孔中，随后将标本静置数小时以使染料充分浸入。染料被轴突吸收后，可顺向运输至神经末梢。本文中，我们介绍一种通过神经残端将荧光指示剂载入蛙类运动神经末梢的方法。本实验方案采用塑料移液器吸头作为组织与染料共孵育的容器。同时，我们也描述了如何采集和分析Ca2+ 荧光瞬变信号。

<table><tbody><tr><td>Ca2+ 指示剂</td><td>Molecular Probes, USA</td><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 六钾盐, O6806</td><td>500 &amp;mu;g</td></tr><tr><td>硅橡胶弹性体</td><td>Dow Corning, USA</td><td>Sylgard 184 弹性体</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Biohit, Russia</td><td>720210</td><td>0.5-10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>02-707-175</td><td>10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Biohit, Russia</td><td>781349</td><td>10&amp;micro;L</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>微型固定针</td><td>Fine Science Tools, Canada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>角膜微型剪刀</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>S-1111</td><td></td></tr><tr><td>珠宝匠镊子</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9610</td><td></td></tr><tr><td>珠宝匠镊子</td><td>MT MEDI CORP, Canada</td><td>F-9611</td><td></td></tr><tr><td>模型黏土</td><td>本地生产商</td><td></td><td>可由任何本地生产商的产品替代</td></tr><tr><td>凡士林</td><td>本地生产商</td><td></td><td>可由任何本地生产商的产品替代</td></tr><tr><td>Microspin FV 2400&amp;nbsp;</td><td>Biosan, Latvia</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Latvia</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>一次性皮下注射针头</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0.4&amp;times;40 mm</td></tr><tr><td>注射器</td><td>本地生产商</td><td></td><td>0.5 ml</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>显微镜，BX51</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据采集系统&amp;nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>Digitdata 1550</td><td></td></tr><tr><td>软件</td><td>Molecular Devices, USA</td><td>pClamp 软件，版本 10</td><td>协议可从以下网址下载：http://kpfu.ru/portal/docs/F_230007060/Video.capture.with.&lt;br/&gt; RedShirt.Neuro.CCD.camera.pro</td></tr><tr><td>浴槽及浴槽温度控制器</td><td>Experimental Builder</td><td></td><td>可用任何带温度控制的灌流槽替代。例如来自 https://www.warneronline.com/&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>单色仪</td><td>Till Photonics, Germany</td><td>Polychrome V</td><td>已不再供应，可由其他适用于 488 nm 的稳定光源替代&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>单色仪控制软件</td><td>Till Photonics, Germany</td><td>Polycon</td><td></td></tr><tr><td>数字 CCD 相机</td><td>Redshirt Imaging, USA</td><td>Neuro CCD SMQ</td><td></td></tr><tr><td>Model 2100 隔离脉冲刺激器</td><td>A-M Systems, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机采集软件</td><td>Redshirt Imaging, USA</td><td>Turbo SM 软件</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院，USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>电子表格程序</td><td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

通过神经残端将钙染料载入蛙类神经末梢：蛙类神经肌肉接头中钙瞬变的记录

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

测量突触前神经末梢内突触前钙水平最可行的方法之一是光学记录法。该方法基于使用钙敏感性荧光染料，其发射光的强度或波长会随细胞内游离钙浓度的变化而改变。目前有多种方法可用于将钙染料标记到细胞中，最常见的是通过微移液管将染料注入细胞，或预先用染料的乙酰氧基甲酯（acetoxymethyl ester）形式进行孵育。然而，由于方法学上的限制，这些方法在神经肌肉接头（NMJs）中的应用受到一定限制。本文介绍一种通过蛙类神经残端将钙敏感性染料导入神经末梢的方法。由于外部钙离子进入神经末梢并结合钙染料的过程发生在毫秒时间尺度内，因此必须使用快速成像系统来记录这些动态相互作用。本文中，我们描述了一种利用高速CCD相机记录钙瞬变的实验方案。

染料负载后，在运动神经受到刺激时，可在神经末梢检测到荧光信号（Ca2+瞬变）幅度的增加（见图2）。Ca2+瞬变的参数列于表1中。定量而言，本研究中测得的Ca2+瞬变参数与先前其他科学家在冷血动物突触上获得的数据相近15,34。Ca2+瞬变的参数取决于Ca2+与染料结合及其后续解离的速率。Ca2+进入神经末梢的速率、与染料的相互作用以及在细胞质中的扩散均会影响Ca2+瞬变上升时间。荧光信号的衰减时间则取决于染料的亲和力、Ca2+与细胞内缓冲物质相互作用的速度以及离子泵的清除作用35。通过分析Ca2+瞬变的幅度，可用于研究各种物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响33。
<img alt="瞬态吸收图，∆F/F₀ 随时间变化，显示毫秒级光激发响应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55122/55122fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：蛙神经肌肉接头中测得的平均 Ca2+ 瞬态变化。 Ca2+ 瞬态变化基于来自 13 个蛙神经肌肉接头信号的平均值计算得出。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55122/55122fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>峰值 ΔF/F (%)</td>
			<td>上升时间 20%-80% (ms)</td>
			<td>τ (ms)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12,6 ±1,1 (n = 13)</td>
			<td>4.6 ±0.5 (n = 13)</td>
			<td>115.3 ±8.3 (n = 13)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：Ca2+瞬变的平均参数。 数据以均值 ± 标准误表示；n 为不同神经肌肉接头（NMJ）中的测量次数。峰值 ΔF/F 为 ΔF/F 的平均振幅。

本文介绍了一种通过蛙类神经残端将钙敏感性染料加载至神经末梢的方法。同时，我们还提供了一套用于记录和分析外周神经末梢快速钙瞬变的实验方案。

测量突触前神经末梢中突触前钙水平的最可行方法之一是光学记录。该方法基于使用……

大家好，我是德米特里·萨米古林（Dimitry Samigullin），我在俄罗斯科学院卡赞生物化学与生物物理学研究所的突触过程生物物理学实验室工作。在我们实验室，我们研究神经肌肉接头中钙信号传导的多种途径。测量突触钙水平最常用的方法之一是光学记录。本文介绍了通过蛙类神经残端将钙敏感性染料加载至神经末梢的方法，同时提供了检测和分析蛙类神经末梢大规模钙瞬变的实验方案。利用该方法，可研究活性药物在突触活动期间对突触前钙水平的影响。染料加载溶液的制备。荧光素类钙染料俄勒冈绿 BAPTA 以少量粉末形式提供，每份500微克，溶于500微升溶液中。向该粉末中加入14微升含HEPES的溶液。涡旋混匀上样溶液，然后离心以充分混合。用铝箔包裹含有上样溶液的离心管，避免光照。将上样溶液于–20摄氏度冰箱中保存。染料加载程序。从动物体内解剖出皮肤胸肌。将解剖得到的组织固定在银衬底的培养皿中。用精细的不锈钢针固定组织。向培养皿中加入任氏液。使用剃刀刀片从微量移液管的细端切下一小段，长约2毫米。准备一块橡皮泥，用于将充液毛细管固定在培养皿上。通过硅胶管和由移液管制成的接头，将充液毛细管与塑料注射器连接。用塑料移液管吸除培养皿中临时盛放的林格氏液。使用注射器进行干燥处理，以防止填充移液管时吸入溶液。从冷冻箱中取出装载溶液的小瓶，并在避光处室温下解冻。使用精细镊子和剪刀，在无菌显微镜下直视操作，紧邻肌肉处切断神经，保留约两毫米的神经残端。用塑料泥将填充移液管连同导管和注射器固定在培养皿上。将其移至神经分支附近。用灌注移液管轻轻抽吸神经残端。从灌注移液管的钝端移除吸管。用注射器通过填充移液管干燥神经残端。将带有神经残端的填充移液管向上移动。用凡士林将神经残端与外界隔离。再次用注射器将神经残端在填充移液管中干燥。使用带有长移液管尖端的移液器吸取0.5 μL上样溶液。将含有上样溶液的移液管尖端轻轻插入填充移液管中。将混合物直接注入神经残端。用凡士林封住灌注移液管的开口端。向培养皿中加入少量溶液。将制备物置于避光、湿润的环境中，室温孵育5小时。孵育结束后，取出制备物，移除含有上样溶液的灌注毛细管。将制备物放入浴槽中，用任氏液冲洗。将标本连同浴液在8 °C温度下于冰箱中孵育过夜。准备组织以进行显微镜观察。从浴液中取出标本。将组织置于银衬室中固定，并轻轻拉伸。用新鲜的任氏液冲洗组织。取吸吮刺激电极。将刺激-吸吮电极置于记录 chamber 内，使其尖端靠近神经的切断端。将神经吸入电极中。电极的制作方法详见 Khazokoff 的文章，该文章链接位于材料列表中。将制备室固定在显微镜载物台上。放置温度探针。将进液管与制备室中珀尔帖元件的电源线连接。将流出管置于准备室中。开启灌流泵。打开温度控制器单元。将控制器单元的温度设置为达到 20 摄氏度。安装紫外线防护罩。在刺激器上设置延迟持续时间和周期。将一根导线从吸电极连接到刺激器上，然后打开电源。在低倍物镜下，通过开启刺激来观察肌肉收缩情况。用低钙高镁的任氏液填充灌流系统，设置灌流速度约为每分钟2毫升。更换物镜至40倍放大倍数。打开Polychrome V，选择发射波长并设置为连续模式照明。打开快门。在40倍物镜下，通过荧光模式照明确认终端已加载。找到神经末梢并对其进行聚焦。图中显示了已加载的神经以及充分加载的运动神经末梢。使用Red-Short Neuro CCD相机进行视频采集。运行 Turbo-SM 软件。选择并更改设置。输入的帧数为 500。输入实验名称。基础配置为每秒 1000 帧。80 乘以 80。选择外部触发。输入触发前时间。负十毫秒。输入重复次数，20。在 Polychrome 软件中，选择外触发照明模式。运行 Clampex 软件。加载刺激程序。该程序可从喀山联邦大学网站的实验室页面下载。在记录之前，在Turbo-SM软件中采集暗场图像。在三目立方体上选择光路切换级别，将100%光路导向相机。运行刺激程序。选择感兴趣区域并检查信号。在神经刺激下，我们记录荧光强度的变化，该变化反映了钙离子进入神经末梢。数据分析。在 Turbo-SM 软件中，选择文件，然后选择平均文件，再选择文件。输入平均文件的名称，并进行平均化处理。将平均文件保存为 fit 文件。选择“另存为 fit 文件”。输入文件名并保存。运行 Image J，然后打开以下工具：分析、工具、ROI 管理器。在 fit 格式中找到已保存的平均文件。将其拖放到 Image J 中。放大窗口以获得更好的视野。在您认为是背景的区域上选择一个矩形兴趣区域。将其添加到 ROI 管理器。在 ROI 管理器中，选择“更多”→“多测量”。加载下平均值。复制数据并导出至 Excel。在 Excel 中使用平均值函数计算用于比率的背景平均值。不关闭 Excel，返回 ImageJ，关闭背景计算窗口且不保存。使用 ROI 管理器删除矩形背景绘图。打开仪器处理中的数学减法功能。输入从 Excel 计算得到的平均阈值，从图像栈中减去背景值。在神经末梢周围选择一个矩形兴趣区域。将其添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器中，选择“更多”、“多测量”、“加载下”、“平均值”。复制并粘贴到 Excel 窗口中。使用 Excel 软件绘制图表。在信号开始前选择一个平坦区域。加载图形，包含从静息状态下的初始荧光值到信号起始阶段的详细信息。然后确定用于平均静息荧光值的数据点数量。对这些数值进行平均，进而计算出静息状态下荧光的平均值。将信号除以静息时的荧光强度，减去1后乘以100%。绘制信号曲线并计算钙瞬变的幅度。荧光信号的时间参数取决于钙离子染料复合物形成正向和/或逆向反应的速度。钙信号上升时间反映了钙离子进入的动力学过程、其在末梢的扩散以及钙离子与染料的相互作用。钙瞬变的衰减速率取决于染料的亲和力、钙缓冲速率及其清除速率。通过分析钙瞬变的幅度，可用于研究不同活性物质对参与神经递质释放的钙内流的影响。该负载技术非常适用于细胞质钙变化的成像。利用荧光指示剂，结合单根神经刺激和节律性突触活动，可通过分析钙瞬变幅度来研究不同物质对参与神经递质释放的钙离子内流的影响。以下是一些需要重点关注的事项。孵育程序包括两个步骤：室温孵育和冰箱孵育。必须严格控制染料在室温下的孵育时间。根据神经残端的长度、染料种类以及室温条件，孵育时间可能有所不同。如果孵育时间过长，术前的终末段及靠近神经残端的近端部分可能会过度染色。由于在冰箱中孵育时间较长，染料可沿神经末梢均匀分布。在切断神经后数分钟内，必须将其放入染料负载溶液中，以使染料进入神经；若间隔时间过长，则会导致负载效果不佳，这可能是由于神经断端已闭合所致。为减少染料的区室化现象，可使用染料的延长形式。防止组织长时间受到荧光照射极为重要，因为这会影响其存活。我们使用可见光通道的微分干涉差（Nomarski）光学系统来寻找神经末梢。在记录过程中，通过光圈限制照明视野。利用神经的快门标记可缩短加载过程的持续时间。在这种情况下，可以使用玻璃微旁路。

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