Organ Culture et Mont entiers immunofluorescence de souris Conduits Wolffian

L’objectif global de cette méthode de culture d’organe et d’immunofluoréscène sur monture entière est de mieux visualiser et comprendre le processus d’enroulement et de développement de l’induction de Wolffian. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement sur les mécanismes impliqués dans le développement de la forme, de la structure et de la fonction des organes. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle imite les systèmes in vivo et fournit des informations plus précises que les études de culture cellulaire qui manquent de facteurs de niche.

Avant midi le 15e jour après la conception, placez une souris enceinte en position couchée sur du papier de soie absorbant et vaporisez la face ventrale de l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. À l’aide d’une pince, soulevez la peau abdominale inférieure de la face ventrale de l’animal et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision latérale s’étendant de l’ouverture urogénitale à la cage thoracique. Saisissez la vessie avec la pince juste au-dessus du col de l’utérus et faites une incision dans l’utérus.

En tenant la vessie, faites une incision dans le ligament large utérin et la jonction tubaire utérine pour détacher l’utérus de l’attache paraténigale. Placez l’utérus dans un tube de 50 millilitres contenant du HBSS glacé et agitez doucement le tissu pour éliminer l’excès de sang. Transférez l’utérus rincé dans une boîte de Pétri contenant du HBSS frais et glacé sur de la glace, et coupez la paroi utérine pour retirer les embryons, en les plaçant dans une nouvelle boîte de Pétri avec du HBSS frais sur de la glace au fur et à mesure de la récolte.

Placez un embryon sur sa face latérale sur un morceau de papier de soie stérile imbibé d’éthanol dans une nouvelle boîte. Et utilisez une lame stérile pour faire une incision diagonale à travers le bas-ventre de l’animal. Fixez l’embryon sur une base d’éponge stérile le long de la colonne vertébrale et déplacez l’embryon sous un stéréomicroscope de dissection.

Coupez soigneusement le long de la ligne médiane ventrale et retirez le foie et les intestins. Le système urogénital devrait maintenant être visible. Faites une incision dans le canal déférent, fermez-le son attache urétrale.

Suivi d’une incision a pensé à la fixation de la partie inférieure du canal wolffien au gubernaculum pour récolter les testicules et les canaux wolffiens. Placer les tissus dans une nouvelle boîte de Pétri avec des HBSS frais sur de la glace au fur et à mesure qu’ils sont recueillis. Pour cultiver les crêtes gonadiques embryonnaires, ajoutez d’abord 300 microlitres de milieu par puits dans une plaque de culture cellulaire de 24 puits.

Ensuite, ajoutez une petite goutte de HBSS stérile dans une nouvelle boîte de Pétri et placez une membrane de gravure en polycarbonate de 0,8 micromètre sur la goutte avec la surface brillante face à la HBSS. Placez toujours la membrane sur le dessus de la goutte de HBSS pour garder le tissu hydraté avec le côté rugueux de la membrane vers le haut. À l’aide d’une pince propre, placez deux crêtes génitales sur le côté rugueux de la membrane sans que les tissus ne se touchent.

Et utilisez une lingette stérile pour enlever l’excès de HBSS. Pendant que vous transférez les crêtes génitales sur la membrane, prélevez l’échantillon entre les deux bras de la pince, en prenant soin d’éliminer tout excès de HBSS de la membrane après le transfert pour éviter la croissance kystique des canaux wolffiens. Ensuite, placez la membrane dans un puits de la plaque à 24 puits pour cultiver les tissus de l’interface du milieu de l’oreille à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, avec un changement total de milieu chaque jour pendant trois jours.

Au quatrième jour de culture, les conduits wolffiens déroulés se seront transformés en tubes très alambiqués. Pour fixer les tissus pour l’immunofluorescence de l’ensemble de la monture, transférez les membranes avec les gonades cultivées et les canaux de Wolff dans de nouvelles boîtes de Pétri contenant du PBS glacé. Les membranes flotteront sur le PBS.

Utilisez l’embout de la pince pour enfoncer les membranes. Et transférez les tissus gonadiques cultivés dans 4 % de paraformaldéhyde. Après la fixation, rincez les échantillons avec trois lavages de 10 minutes dans du PBS plus Triton X avec un balancement doux à température ambiante.

Ensuite, déshydratez les tissus dans une série d’éthanol gradué pendant 10 minutes pour chaque immersion à quatre degrés Celsius et 30 rotations par minute. Pour passer les échantillons d’une immersion à l’autre, laissez les tissus se déposer pendant les deux dernières minutes de la déshydratation. Ensuite, retirez autant d’alcool que possible sans toucher les mouchoirs, et ajoutez la concentration suivante d’éthanol plus élevée.

Après la dernière déshydratation, réhydratez les tissus dans une série d’éthanol inversé comme nous venons de le démontrer. Ensuite, lavez les mouchoirs dans du PBS plus Triton X quatre fois pendant 20 minutes à température ambiante. Et 30 rotations par minute pour chaque lavage.

Bloquez les tissus pendant une heure à température ambiante à l’aide d’un tampon de transfert, suivi d’une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius et de 30 rotations par minute dans l’anticorps primaire d’intérêt. Le lendemain, lavez les mouchoirs quatre fois dans du PBS plus du lait écrémé en poudre chez les préadolescents pendant 30 minutes à température ambiante et 30 rotations par minute pour chaque lavage. Après le dernier lavage, étiquetez les mouchoirs avec l’anticorps secondaire approprié pendant une heure à température ambiante, avec un balancement lent et à l’abri de la lumière.

Ensuite, lavez les mouchoirs trois fois dans du PBS plus pour préadolescents seulement. Et analyser les échantillons par microscopie immunofluoréscène. Au cours du développement, le conduit wolffien subit des modifications importantes, dans lesquelles un tube simple et droit est transformé en un conduit très complexe et enroulé.

Pour disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans la morphogenèse du canal de Wolffi, le milieu de culture peut être complété par des inhibiteurs et des activateurs qui ciblent différentes voies de signalisation. Par exemple, ce canal wolffien est resté déroulé après trois jours de culture en présence d’un inhibiteur spécifique de signalisation. Une voie apparemment impliquée dans l’enroulement.

L’immunocoloration de l’ensemble des canaux de Wolffan révèle l’expression de la cytokératine-8, la présence de cellules proliférantes PH3 positives et de tissus de culture de trois jours, ainsi que l’expression de la bêta-caténine dans des tissus entiers nouvellement isolés du jour 18,5 après la conception. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ cinq à dix minutes par embryon si elle est effectuée correctement. En suivant cette procédure, des agents pharmacologiques ou des hormones peuvent être testés sur les organes de culture pour répondre à des questions supplémentaires sur l’effet direct de ces agents sur des tissus gonadiques spécifiques.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne pas saisir les crêtes génitales directement avec la pince. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du développement pour explorer les mécanismes impliqués dans les anomalies congénitales et les anomalies du développement du système reproducteur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de cultiver des crêtes gentiles et d’effectuer une immunofluorescence complète.

N’oubliez pas que travailler avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux et qu’un équipement de protection individuelle doit toujours être porté lors de la manipulation de ce matériau.