Legionella pneumophila membrane externe Vésicules: Isolement et analyse de leur potentiel pro-inflammatoire sur Macrophages

L’objectif global de cette étude est de purifier les vésicules de la membrane externe ou OMV de Legionella pneumophila de manière standardisée et d’analyser leur influence sur la réplication bactérienne dans les macrophages humains et murins. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les vésicules de la membrane externe. Par exemple, la procédure normalisée de préparation des OMV peut aider à étudier leur impact sur l’interaction hôte-pathogène.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournira un protocole standardisé pour étudier l’impact des OMV de Legionella pneumophila sur les macrophages humains ou murins, ce qui améliorera notre compréhension de la pathogénicité de Legionella pneumophila. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons réfléchi au potentiel pro-inflammatoire possible des OMV et à la façon dont cela pourrait influencer le cours de l’infection, car les OMV sont libérés par les légionelles à la fois à l’intérieur de la cellule hôte et extracellulairement. La procédure sera démontrée par Kerstin Hoffmann, une technicienne de mon laboratoire et Analina Young, une chercheuse postdoctorale.

Pour commencer, tout en travaillant dans des conditions stériles, étalez la souche B de L. pneumophila sur des plaques de gélose BCYE et incubez à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Utilisez L. pneumophila à partir d’une plaque de pré-culture pour inoculer 10 millilitres de milieu YEB à une OD600 de 0,3 et incuber les bactéries à 37 degrés Celsius sur un agitateur rotatif pendant six heures. Vérifiez la pureté de la culture liquide en étalant 100 microlitres de suspension sur une plaque de gélose au sang.

Incuber la plaque de gélose au sang pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ajouter la culture liquide restante à 90 millilitres de milieu YEB frais et incuber la culture sur un agitateur rotatif jusqu’à ce qu’elle atteigne une OD600 de 3,0 à 3,5. Centrifugez la culture liquide à 4 000 g pendant 20 minutes pour granuler les bactéries.

Transférez ensuite le surnageant dans des tubes à centrifuger frais. Jetez les granulés bactériens et centrifugez à nouveau les échantillons avant de répéter l’étape de centrifugation. Ensuite, filtrez et stérilisez deux fois le surnageant restant.

Transférez ensuite le surnageant exempt de bactéries dans des tubes d’ultracentrifugation et faites tourner les échantillons à 100 000 g à quatre degrés Celsius pendant trois heures. Décanter le surnageant et le jeter. Utilisez ensuite du PBS stérile pour remettre en suspension les granulés OMV et les mettre en commun.

Répétez l’étape d’ultracentrifugation pour éliminer les protéines contaminantes et le LPS libre. Maintenant, jetez le surnageant et séchez le tube de l’ultracentrifugeuse avec un coton-tige stérile. Remettre en suspension la pastille OMV avec 500 microlitres de PBS stérile.

Ensuite, appliquez 20 microlitres chacun sur des plaques de gélose au sang et de gélose BCYE pour exclure la contamination bactérienne de la vésicule préparée. Incuber la plaque de gélose au sang pendant la nuit et la plaque de gélose BCYE pendant trois jours. Utiliser le dosage BCYE selon les instructions du fabricant pour quantifier la quantité de protéines pour la préparation OMV obtenue.

Après avoir différencié les cellules THP-1 en macrophages selon le protocole de texte, utilisez 500 microlitres de milieu frais pour remplacer le milieu de différenciation et incubez les cellules pendant 24 heures supplémentaires à 37 degrés Celsius. Pour traiter le THP-1 ou les cellules murines BMDM avec des OMV, décongelez les OMV préalablement préparés et ajoutez la quantité appropriée aux cellules. Incuber les macrophages avec des OMV à 37 degrés Celsius pendant au moins 20 heures pour infecter les cellules THP-1 prétraitées ou non traitées avec la souche B de la souche de L. pneumophila de type sauvage ou les cellules BMDM murines avec un mutant dépourvu de flagelle de cette souche sans changer le milieu des cellules.

Ajouter des bactéries à un moment d’inertie de 0,5, ce qui équivaut à un fois 10 à la cinquième L. pneumophila par puits. Incuber les cultures pendant 24 et 48 heures respectivement. Pour lyser les cellules, ajoutez de la saponine à une concentration finale de 0,1 % et incubez les cellules pendant cinq minutes.

Ensuite, remettez en suspension les macrophages lysés par pipetage et transférez la suspension dans un récipient de réaction. Utilisez du PBS stérile pour préparer des dilutions en série de la suspension de L. pneumophila. Ensuite, striez 50 microlitres des dilutions requises sur des plaques de gélose BCYE et incubez les plaques pendant trois jours.

Comptez visuellement les colonies formées à l’œil nu et effectuez les calculs selon le protocole de texte. Dans cette expérience, examinant le potentiel pro-inflammatoire des OMV de L. pneumophila, les cellules THP-1 différenciées par PMA répondent par une augmentation dépendante du temps et de la dose de la sécrétion d’IL-8 et d’IL-6. Ici, l’influence de différents récepteurs de type Toll sur la reconnaissance de l’OMV de L. pneumophila a été analysée chez des BMDM murins avec des antécédents génétiques différents à l’aide d’un test ELISA CXCL-1.

Les BMDM murines de souris de type sauvage ont sécrété CXCL-1 après stimulation OMV, tandis que les BMDM murines de TLR2/4 double knockout ont sécrété significativement moins. Pour étudier l’impact des OMV de L. pneumophila sur la réplication bactérienne dans les macrophages THP-1, des cellules ont été pré-incubées avec des OMV pendant 20 heures, puis infectées par L. pneumophila. La pré-stimulation des macrophages dérivés de THP-1 réduit d’abord la dose de réplication bactérienne de manière dépendante après 24 heures d’infection, tandis qu’elle conduit à un doublement du nombre d’UFC à un moment ultérieur.

Comme le montre cette expérience, la pré-stimulation des BMDM murins avec des OMV entraîne une multiplication par dix du nombre d’UFC dans la BMDM murine d’animaux de type sauvage, tandis que l’inactivation de TLR2 et les macrophages TRIF/MyD88 ne montrent pas cette augmentation de la réplication de L. pneumophila après la pré-incubation de l’OMV. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de travailler dans des conditions stériles et de vérifier la contamination bactérienne des OMV purifiés. Sinon, l’analyse en aval ne donne pas de résultats concluants.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’analyse de suivi des nanoparticules peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que quel mutant de Legionella produit plus ou moins d’OMV ou d’étudier l’impact de différentes conditions de stress sur la sécrétion d’OMV. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la recherche sur les OMV pour explorer l’impact des OMV sur les interactions hôte-pathogène in vitro puis in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de purifier les OMV et de commencer à analyser leur effet sur l’infection ultérieure des macrophages.

Ce protocole peut ensuite être appliqué à différentes bactéries à Gram négatif et à leur cellule hôte respective après adaptation des temps d’incubation et de croissance. N’oubliez pas que le travail avec Legionella pneumophila peut être extrêmement infectieux pour les humains, c’est pourquoi le travail doit toujours être effectué sous un banc stérile lors de la manipulation de Legionella et de l’exécution de cette procédure.