Analyse Synaptic Modulation de Drosophila melanogaster Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

L’objectif global de cette procédure expérimentale est de comprendre la dynamique synaptique d’un seul neurone dans différentes conditions d’activation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la plasticité synaptique, telles que la révélation de changements dans la composition moléculaire des synapses lors de la maturation de l’activité du neurone. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet l’analyse semi-automatisée de plusieurs aspects des synapses, notamment leur nombre, leur distribution et le niveau d’enrichissement des composants moléculaires après les synapses.

Pour cette expérience, collectez les mouches dans des flacons normaux dans les six heures suivant l’éclosion. Chargez les flacons de collecte dans un support en acrylique transparent. Dans un petit incubateur réglé à 25 degrés Celsius, positionnez le rack à une distance précise d’un panneau LED où l’exposition à la lumière est en moyenne de 1000 lux.

Ensuite, l’arrière vole pendant un à trois jours en utilisant l’une des conditions suivantes, soit une obscurité constante, 12 heures de lumière suivies de 12 heures d’obscurité, soit une lumière constante. Plus tard, disséquez et colorez les cerveaux à l’aide de techniques standard. Pour monter la cervelle des mouches, chargez une micropipette avec un support de montage et déposez deux gouttes de 2 microlitres au centre d’une lame de microscope à environ 2 cm de distance.

Placez une lamelle sur chaque goutte et l’ouverture entre environ 0,2 mm. Déposez ensuite 15 microlitres de support de montage sur les cales de couverture et dans l’interstice. À l’aide d’un microscope à dissection, déposer le cerveau dans l’espace du micropipet.

Et puis positionnez le cerveau, côté ventral vers le haut. Enfin, fixez une lamelle et scellez-la le long des bords à l’aide d’un vernis à ongles transparent. Les cerveaux peuvent ensuite être imagés à l’aide de techniques standard pour reconstituer des images 3D.

Dans ce cas, la luminescence de la GFP est documentée dans les cellules avec une expression active de Brp à l’aide de la méthode des étoiles. Également dans cet exemple, les axones des photorécepteurs R7 et R8 ont été immunolabellisés avec de l’anticiaoptine, qui a été visualisé à l’aide d’anticorps secondaires marqués RFP. Pour quantifier le nombre, la distribution et le niveau de délocalisation du point GFP Brp, chargez d’abord des images 3D reconstituées du cerveau faites à partir d’empilements d’images.

Les Brp puncta sont affichés en blanc. Maintenant, trouvez la région qui vous intéresse. Dans ce cas, les terminaisons de l’axone R8 sont localisées en suivant l’amincissement des axones positifs à l’anticiaoptine au point d’entrée dans la couche médullaire M3.

À chaque borne axonale R8, identifiez le point GFP Brp à l’aide du module de détection ponctuelle. Sélectionnez Ajouter de nouveaux spots, puis sélectionnez Segment uniquement Région d’intérêt dans les paramètres de l’algorithme. Une fois la région d’analyse définie, définissez le canal source sur Brp GFP, puis définissez le diamètre XY estimé sur 0,35 micron.

Et ensuite, cochez la soustraction de l’arrière-plan dans la détection ponctuelle. Ensuite, sélectionnez la qualité comme type de filtre, et les points sont filtrés automatiquement. Terminez cette étape en cliquant sur Terminer.

Répétez la méthode de détection ponctuelle pour tous les axones R8 de l’ensemble de données. La prochaine région à identifier est le cytoplasme axonal. Tout d’abord, générez des objets de surface avec la fonction surface.

Ensuite, sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces et, sous les paramètres de l’algorithme, activez l’option Segment uniquement Région d’intérêt. Maintenant, sélectionnez manuellement la région qui vous intéresse. Ensuite, définissez les périmètres de calcul.

Pour trouver le canal photorécepteur comme source, sélectionnez l’option lisse. Pour le seuil, sélectionnez l’intensité absolue. Activez l’option de division des objets en contact.

Réglez le diamètre des points de selle sur 0,5 micron et utilisez les paramètres de filtre par défaut pour la qualité et le nombre de voxels. Le filtre est alors appliqué automatiquement. Maintenant, allez modifier et supprimer les morceaux de surface générés en dehors de la région d’intérêt.

Dans ce cas, les autres axones. Après avoir répété la détection de la région axonale pour tous les axones R8 de l’ensemble de données, tous les axones Brp puncta et R8 sont identifiés comme un ensemble d’objets ponctuels. Et les régions cytoplasmiques correspondantes sont identifiées comme des objets de surface.

Maintenant, procédez en définissant manuellement l’orientation et l’espace de chaque axone. Ceci est important pour la quantification ultérieure de la densité de Brp GFP le long de chaque neurone de la moelle neuropile. Pour ce faire, définissez d’abord leurs points de départ et d’arrivée.

Sélectionnez Ajouter de nouveaux points de mesure, puis Modifier, puis Sélectionner la surface de l’objet à utiliser en haut des objets de surface. Pour définir les points de départ, placez des points de mesure sur tous les objets de surface des axones R dans la couche M1. Placez ces points dans un ordre systématiquement reproductible.

Ensuite, définissez les points finaux. Sélectionnez Ajouter de nouveaux points de mesure, modifier et refaire la surface de l’objet. Puis, en répétant le même ordre systématique, placez des points de mesure au bas des axones R en couche M3.

Pour quantifier l’intensité de fond de Brp, analysez les régions cytoplasmiques de deux axones R7. Sélectionnez Ajouter de nouvelles surfaces et définissez manuellement la région d’un axone R7 comme cela a été fait pour les axones R8. Utilisez des paramètres identiques, sauf que vous n’activez pas l’option Activer la division des objets touchés.

Laissez cela de côté. Ensuite, ajoutez un objet taches factices à l’intérieur d’une région axonale R7 définie. Sélectionnez Ajouter de nouveaux emplacements, puis Ignorer la création automatique et les modifier manuellement.

Ensuite, sélectionnez le centre de l’objet et cliquez sur l’objet de surface pour placer l’objet factice à l’intérieur de l’axone R7. Maintenant, répétez les étapes de détection de surface et de spot pour un deuxième axone R7. Et puis définissez les points terminaux de début et de fin des axones R7 comme fait avec les axones R8.

Pour cette analyse, assurez-vous d’avoir installé le bon logiciel. Ouvrez le jeu de données contenant les données ponctuelles, les données de surface et deux objets de point de mesure, contenant chacun le même nombre de points de mesure. Inspectez les données.

Les deux objets de point de mesure doivent avoir le même nombre de points de mesure pour que les calculs fonctionnent. Une fois que les points, les régions axonales et les points de départ et d’arrivée ont été définis, démarrez le plugin. Tout d’abord, vérifiez les métadonnées, en particulier la taille du voxel.

Ouvrez les propriétés de l’image à partir de l’édition, puis vérifiez les 3 dimensions du voxel et des microns sous les coordonnées dans la géométrie. Ensuite, sélectionnez un canal pour l’analyse d’intensité. Dans ce cas, le canal affichant Brp GFP est sélectionné.

Définissez ensuite le nom de fichier pour les résultats. Ensuite, définissez le nombre de bacs à 10 et réglez la longueur de l’axone à 100 %Ensuite, définissez les régions du point en fixant le rayon du spot à 0,35 micron et la région cytoplasmique environnante à 50 microns. Enfin, exécutez la commande de détection de synapse, puis analysez statistiquement la sortie.

Selon les protocoles décrits, les points de GFP Brp ont été analysés dans les synapses R8 de mouches exposées à une obscurité constante, à une lumière constante ou à un cycle lumière/obscurité normal. Le nombre de Brp puncta a été significativement réduit dans les photorécepteurs R8 des mouches maintenues en lumière constante. La distribution du puncta a été calculée à l’aide d’un plugin personnalisé.

Les synapses R8 étaient réparties tout le long de la diaphyse axonale de la couche M1 à la couche M3, mais leur densité était plus élevée aux couches M1 et M3. De même, les niveaux de délocalisation du puncta ont été calculés. Ils sont restés inchangés dans toutes les conditions, mais les niveaux de délocalisation de Brp GFP différaient de ceux d’autres rapporteurs, comme Brp-short-cherry qui devient clairement désamorcé sous une lumière constante.

Il est possible qu’il y ait eu un traitement inapproprié du fragment court Brp après le démontage de l’AZ. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’analyser les propriétés plastiques synaptiques dans un seul neurone. Ces propriétés plastiques comprennent le nombre de synapses, leur distribution et l’étiquette d’enrichissement d’un composant moléculaire spécifique après les synapses.