Analyse Synaptic Modulation de

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de comprendre la dynamique synaptique dans un neurone unique soumis à différentes conditions d'activation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la plasticité synaptique, notamment en révélant les modifications de la composition moléculaire des synapses lors de la maturation de l'activité du neurone. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre l'analyse semi-automatisée de plusieurs aspects des synapses, notamment leur nombre, leur distribution et le degré d'enrichissement en composants moléculaires après la formation des synapses.

Pour cette expérience, collectez les mouches dans des vials normaux dans les six heures suivant l’émergence. Placez les vials de collecte dans un support en acrylique transparent. Dans un petit incubateur réglé à 25 degrés celsius, positionnez le support à une distance précise d’un panneau LED afin que l’exposition à la lumière soit en moyenne de 1000 lux.

Ensuite, élevez les mouches pendant un à trois jours en utilisant l'une des conditions suivantes : obscurité constante, 12 heures de lumière suivies de 12 heures d'obscurité, ou lumière constante. Par la suite, disséquez et colorez les cerveaux en utilisant des techniques standard. Pour monter les cerveaux de mouche, chargez une micropipette avec du milieu de montage et déposez deux gouttes de 2 µL au centre d'une lame de microscope, espacées d'environ 2 cm.

Placez une lame couvre-objet sur chaque goutte, en laissant un espace d’environ 0,2 mm. Ensuite, déposez 15 microlitres de milieu de montage sur les lames couvre-objets et dans l’espace. Sous un microscope stéréoscopique, déposez le cerveau dans l’espace à l’aide d’une micropipette.

Ensuite, positionnez les cerveaux avec la face ventrale vers le haut. Enfin, fixez une lame couvre-objet et scellez-la sur les bords à l’aide de vernis incolore. Les cerveaux peuvent alors être observés à l’aide de techniques standard pour reconstituer des images en 3D.

Dans ce cas, la luminescence de la GFP est documentée dans les cellules présentant une expression active de Brp en utilisant la méthode star. Dans cet exemple, les axones des photorécepteurs R7 et R8 ont également été immunomarqués à l’aide d’anticiaoptine, visualisés à l’aide d’anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome RFP. Pour quantifier le nombre, la distribution et le degré de délocalisation des points fluorescents de Brp-GFP, chargez d’abord les images 3D reconstituées du cerveau obtenues à partir de séries d’images.

Les points Brp sont affichés en blanc. Recherchez maintenant la région d'intérêt. Dans ce cas, les terminaisons des axones R8 sont localisées en suivant l'amincissement des axones positifs pour l'anticiaoptine au point d'entrée dans la couche médullaire M3.

À chaque terminaison axonale de R8, identifier les punctae Brp GFP à l'aide du module de détection de points. Sélectionner « Ajouter de nouveaux points », puis choisir « Segmenter uniquement la région d'intérêt » dans les paramètres de l'algorithme. Une fois la région d'analyse définie, régler le canal source sur Brp GFP, puis fixer le diamètre estimé XY à 0,35 micron.

Ensuite, cochez la soustraction du fond dans la détection des taches. Sélectionnez ensuite la qualité comme type de filtre, et les points sont filtrés automatiquement. Terminez cette étape en cliquant sur « Terminer ».

Répétez la méthode de détection des points pour tous les axones R8 dans le jeu de données. La prochaine région à identifier est le cytoplasme de l'axone. Commencez par générer des objets de surface à l'aide de la fonction de surface.

Ensuite, sélectionnez « ajouter de nouvelles surfaces » et, dans les paramètres de l'algorithme, activez l'option de segmentation de la région d'intérêt uniquement. Sélectionnez maintenant manuellement la région d'intérêt. Définissez ensuite les périmètres de calcul.

Pour trouver le canal des photorécepteurs comme source, sélectionnez l'option lissage. Pour le seuil, choisissez l'intensité absolue. Activez l'option de séparation des objets en contact.

Réglez le diamètre des points de siège à 0,5 micromètre et utilisez les paramètres par défaut du filtre pour la qualité et le nombre de voxels. Le filtre est ensuite appliqué automatiquement. Accédez maintenant à l'édition et supprimez les fragments de surface générés à l'extérieur de la région d'intérêt.

Dans ce cas, les autres axones. Après avoir répété la détection de la région axonale pour tous les axones R8 dans le jeu de données, toutes les ponctuations Brp et les axones R8 sont identifiées comme un ensemble d'objets ponctuels. Et les régions cytoplasmiques correspondantes sont identifiées comme des objets surfaciques.

Maintenant, procédez en définissant manuellement l'orientation et l'espace de chaque axone. Ceci est important pour la quantification ultérieure de la densité de Brp GFP le long de chaque neurone dans le neuropile de la médullo. Pour ce faire, définissez d'abord leurs points de départ et leurs points d'arrivée.

Sélectionnez « ajouter de nouveaux points de mesure », puis sélectionnez « modifier » suivi de « sélectionner la surface de l'objet » pour travailler avec la surface supérieure des objets. Pour définir les points de départ, placez des points de mesure sur tous les objets de surface des axones R dans la couche M1. Placez ces points selon un ordre systématique et reproductible.

Ensuite, définissez les points terminaux. Sélectionnez ajouter de nouveaux points de mesure, modifier, puis surface de l'objet à nouveau. Ensuite, en répétant le même ordre systématique, placez les points de mesure sur la partie inférieure des axones R dans la couche M3.

Pour quantifier l'intensité du fond Brp, analyser les régions cytoplasmiques de deux axones R7. Sélectionner « Ajouter de nouvelles surfaces » et définir manuellement la région d'un axone R7 comme cela a été fait pour les axones R8. Utiliser des paramètres identiques, sauf ne pas activer l'option « activer la séparation des objets en contact ».

Laissez ceci désactivé. Ensuite, ajoutez un objet de points factices à l'intérieur d'une région axonale R7 définie. Sélectionnez « Ajouter de nouveaux points », puis choisissez de ne pas créer automatiquement et modifiez manuellement.

Ensuite, sélectionnez le centre de l'objet et cliquez sur l'objet de surface pour placer l'objet de points factices à l'intérieur de l'axone R7. Répétez maintenant les étapes de détection de surface et de détection de points pour un second axone R7. Puis définissez les points terminaux initial et final des axones R7 comme cela a été fait pour les axones R8.

Pour cette analyse, veillez à avoir installé le logiciel approprié. Ouvrez le jeu de données contenant les données de points, les données de surfaces et deux objets de points de mesure, chacun contenant le même nombre de points de mesure. Examinez les données.

Les deux objets de points de mesure doivent avoir le même nombre de points de mesure pour que les calculs fonctionnent. Une fois que les taches, les régions des axones, ainsi que les points de départ et d'arrivée ont été définis, lancez le module complémentaire. Vérifiez d'abord les métadonnées, en particulier la taille des voxels.

Ouvrir les propriétés de l'image à partir de l'éditeur, puis vérifier les 3 dimensions du voxel et des microns sous les coordonnées dans la géométrie. Ensuite, sélectionner un canal pour l'analyse d'intensité. Dans ce cas, le canal montrant Brp GFP est sélectionné.

Ensuite, définissez le nom du fichier pour les résultats. Puis, définissez le nombre d'intervalles comme étant 10 et réglez la longueur de l'axone à 100 %. Définissez ensuite les régions des ponctuations en réglant le rayon du spot à 0,35 micromètre et la région cytoplasmique environnante à 50 micromètres. Enfin, exécutez la commande de détection des synapses, puis analysez statistiquement les résultats.

Après avoir suivi les protocoles décrits, les points fluorescents de Brp GFP ont été analysés dans les synapses R8 de mouches exposées à l'obscurité constante, à la lumière constante ou à un cycle lumineux normal. Le nombre de points de Brp était significativement réduit dans les photorécepteurs R8 des mouches maintenues en lumière constante. La distribution des points a été calculée à l'aide d'un greffon personnalisé.

Les synapses R8 étaient réparties tout au long du cylindre axonal, de la couche M1 à la couche M3, mais leur densité était plus élevée aux niveaux des couches M1 et M3. De même, les niveaux de déslocalisation des points fluorescents ont été calculés. Ils sont restés inchangés dans toutes les conditions, cependant les niveaux de déslocalisation de Brp GFP différaient de ceux d'autres capteurs, comme Brp-short-cherry qui devient clairement diffus en lumière constante.

Il est possible qu'il y ait un traitement inapproprié du fragment court de Brp après sa dissociation de la zone active. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser les propriétés plas­tiques synaptiques dans un seul neurone. Ces propriétés plas­tiques comprennent le nombre de synapses, leur distribution et l'étiquetage de l'enrichissement d'un composant moléculaire spécifique au niveau des synapses.