Name: Analyse Synaptic Modulation de Drosophila melanogaster Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse semi-automatisée des zones actives synaptiques chez Drosophila melanogaster pour étudier la plasticité synaptique après exposition lumineuse prolongée. Cette technique permet de quantifier la distribution spatiale des synapses.

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Nous sommes reconnaissants à T. Stürner pour les corrections utiles, des discussions et des commentaires sur le manuscrit; SL Zipursky pour fournir des stocks de mouches; M Schölling pour effectuer un traitement d&#39;image. Une partie de l&#39;analyse d&#39;image a été réalisée au laboratoire de A. Kakita. Ce travail a été soutenu par la fondation Alexander von Humboldt et bourses JSPS pour la recherche à l&#39;étranger (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Grant-In Aide pour le démarrage (24800024), sur les zones innovantes (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Fondations Toray (TS), le financement de base DZNE (GT) et des installations DZNE Lumière Microscopy (CM).

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole impliquent travaillent exclusivement avec la drosophile et ne sont pas soumis à des lois sur la protection des animaux en Allemagne et au Japon. 1. Exposition à la lumière Conditions <ol><li> Préparer les mouches qui transportent sensless-flippase (sens-flp) et Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-gfp (brp-FSF-gfp) 15 pour la visualisation de Brp-GFP dans les neurones R8 photoréceptrices (R8). La génomique brp de codage de locus dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) a été modifié pour générer cette construction brp-FSF-gfp. Dans les mouches portant ce BAC modifié l&#39;expression de Brp-GFP est sous le contrôle des séquences régulatrices endogènes, mais limitée à photorécepteurs R8 après sensless-flippase élimination médiée de la cassette FRT-STOP-FRT 15. Notez que sens-flp rarement exprime flippase en R7s. </li><li> Gardez les mouches dans un 12 h light / 12 h cycle d&#39; obscurité (LD) à 25 ° C du stade larvaire jusqu&#39;à eclosion (figure 1A). </li><li> Recueillir les mouches 0 - 6 h après l&#39;éclosion et les placer dans un nouveau flacon contenant de la nourriture à la mouche. </li><li> Fixer les flacons dans un râtelier transparent constitué d&#39; une résine acrylique avec trois étapes ( d&#39; une hauteur de 41 cm, une base de 21 cm, une épaisseur de 4 cm et une hauteur de 13 cm pour chaque étape) (figure 1B). </li><li> Réglez la distance entre la crémaillère et un panneau à LED pour fournir l&#39;éclairage avec une intensité moyenne de 1000 lux à l&#39; aide d&#39; un compteur numérique de la lumière (figure 1C). </li><li> Gardez les mouches pour 1 - 3 d dans l&#39; une des conditions suivantes: obscurité constante (DD), 12 h de lumière / 12 h cycle d&#39; obscurité (LD), ou de la lumière constante (LL) à 25 ° C dans un petit incubateur (Figures 1A et 1C). </li></ol> 2. Dissection, immunohistochimie et imagerie <ol><li> Disséquer le cerveau des mouches avec des pinces, les fixer avec 4% formaldehyde et immunocoloration avec l&#39;anticorps primaire contre Chaoptin (01:50) et un second anticorps pour la visualisation des photorécepteurs , en fonction de procédures expérimentales antérieures 25. Brièvement: <ol><li> Préparer 0,1% de Triton X-100 dans du PBS (0,1% PBT). Cette solution est utilisée pour améliorer la pénétration dans les tissus anticorps. </li><li> Anesthetize mouches sur un bloc CO 2, trier le bon génotype et de les transférer à une boîte de Pétri remplie de 0,1% PBT. </li><li> Collez la pince sous la trompe et retirez droite et à gauche les yeux respectivement avec les autres pinces. </li><li> Retirer la trompe et la trachée attachée au cerveau. </li><li> Transférer le cerveau avec la pince dans un tube de 1,5 ml contenant 150 pi de 0,1% PBT à la température ambiante. </li><li> Dans les 10 min de répétition 2.1.3 - 2.1.5 pour obtenir autant de cerveaux que possible. </li><li> Ajouter 50 ul de 16% de formaldéhyde dans le tube et mélanger par pipetage. </li><li> Incuber les cerveaux dans un fixateur à la salletempérature pendant 50 min. </li><li> Laver trois fois avec 200 pi de 0,1% PBT avec une micropipette, en accordant une attention à laisser le cerveau dans le tube. </li><li> Après le dernier lavage, retirer le 0,1% PBT et ajouter la solution d&#39;anticorps primaire, préparé comme suit: ajouter 196 ul de 0,3% PBT (0,3% de Triton X-100 dans du PBS) 4 pi d&#39;anti-Chaoptin anticorps (dilution finale 1 : 50) pour la visualisation des photorécepteurs. </li><li> Laisser incuber le cerveau dans la solution d&#39;anticorps primaire à 4 ° CO / N. </li><li> Lavage 3x avec 200 ul de 0,1% de PBT avec une micropipette. </li><li> Après le dernier lavage, retirer le 0,1% PBT et ajouter 200 ul du PBT 0,3% contenant un anticorps secondaire. </li><li> Incuber dans l&#39;obscurité à 4 ° CO / N. </li><li> Laver trois fois avec 200 pi de 0,1% de PBT avec une micropipette. </li></ol></li><li> Pour le montage, placer deux petites gouttes (2 pi chacun) d&#39;un support de montage avec une micropipette au centre d&#39;une lame de microscope à environ 2 cm distance de l&#39;autre. </li><li> Placez deux lamelles, l&#39;une sur chaque goutte et laisser un espace étroit entre les lamelles d&#39;environ 0,2 mm. </li><li> Placer 15 ul d&#39;un milieu de montage sur le dessus de la lamelle couvre-objet et ajouter le cerveau avec une micro-pipette dans le milieu de montage. </li><li> Sous un microscope de dissection, positionner le cerveau avec la face ventrale vers le haut dans l&#39;espace étroit entre les deux lamelles (figure 2). </li><li> Placez une lamelle sur le dessus et sceller les bords de la lamelle à l&#39; aide de vernis à ongles transparent pour fixer l&#39;échantillon (figure 2). </li><li> Obtenir des images du cerveau avec un microscope confocal. Utilisez un objectif 63X à immersion d&#39;huile objectif (1.4 NA) et un zoom numérique 2,6x. Générer plus de 20 sections optiques du second ganglion rachidien optique avec une taille de pas de 0,5 um. </li></ol> 3. Génération des taches, des objets de surface, des points de départ et End-points <ol><li> Pour quantifier le nombre, la distribution et le niveau de Brp-GFP puncta délocalisation, ouvrez la pile obtenue par microscopie confocale dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;images et de reconstituer des images 3D (Figure 3A). Notez que l&#39;étape dans cette étude a été réalisée avec Imaris. </li><li> Identifier les points lacrymaux Brp-GFP par le module de détection de l&#39;angle pour chaque terminal axone R8. <ol><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux Spots&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Segment seulement une région d&#39;intérêt&quot; dans les paramètres de l&#39;algorithme. Sélectionnez un terminal axone R8 dans le bulbe rachidien manuellement. </li><li> Sélectionnez le canal source du signal Brp-GFP. REMARQUE: Les axones photoréceptrices R7 et R8 ont été immunomarquées avec un anti-Chaoptin (figure 3A). Seulement R8, cependant, contient Brp-GFP puncta et pourrait donc être facilement distingué (figure 3A). En outre, le point final de R8 pourrait être identifiée par l&#39;amincissement des axones anti-Chaoptin positifs au point dans la couche rachidien M3 d&#39;entrée. </li><li> Réglez le diamètre XY estimé to 0,35 pm et cocher &quot;soustraction de fond&quot; dans la détection de l&#39;angle. </li><li> Sélectionnez «Qualité» dans le type de filtre et filtrer automatiquement. Puis cliquez sur Terminer. </li><li> Répéter de 3.2.1 3.2.5 T- pour d&#39; autres axones R (figure 3B). </li></ol></li><li> Pour mesurer le niveau de délocalisation de Brp-GFP dans les axones R8, générer des objets de surface avec la fonction &quot;Surface&quot; pour chaque axone (figure 3C). <ol><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouvelles surfaces&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Segment seulement une région d&#39;intérêt&quot; dans les paramètres de l&#39;algorithme. Ensuite, sélectionnez une R8 terminaisons axonales dans le medulla manuellement. </li><li> Sélectionnez le canal source des photorécepteurs. </li><li> Cochez &quot;Lisser&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Intensité absolue&quot; dans le seuil. </li><li> Cochez la case &quot;Activer&quot;. &quot;Points de semences Diamètre&quot; est de 0,5 um. </li><li> Sélectionner le type de filtre &quot;Qualité&quot; et &quot;Nombre de voxels&quot;, puis filtrer automatiquement. </li><li> Allez sur &quot;Edit&quot; et supprimer les morceaux de surfaces générées sur d&#39;autres axones non intéressants. </li><li> Répéter de 3.3.1 - 3.3.8 pour d&#39; autres axones R (Figure 3C). Remarque Certains objets de surface ont été interrompues en raison de la minceur et le faible signal dans les photorécepteurs à couche M2, mais ils étaient encore considérés comme un objet unique du début à des points d&#39;extrémité. </li></ol></li><li> Pour identifier la distribution de Brp-GFP puncta le long de chaque neurone dans le neuropile rachidien, définir le début du point et point final avec la fonction de point de mesure (Figure 3D). <ol><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux points de mesure&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;Modifier&quot; et sélectionnez &quot;Surface d&#39;objet&quot; à couper avec le haut de la surface des objets. </li><li> Mettez les points de mesure sur des objets de surface des axones R dans la couche M1 dans l&#39;ordre. Ceux - ci sont maintenant définies comme start-points (Figure 3D). </li><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux points de mesure&quot;.Ensuite, sélectionnez &quot;Modifier&quot; et sélectionnez &quot;Surface d&#39;objet&quot; à couper avec le fond des objets de surface. </li><li> Placer des points de mesure sur le fond des objets de surface des axones R dans la couche de M3 dans l&#39;ordre. Ceux - ci sont maintenant définies comme points d&#39; extrémité (Figure 3D). </li></ol></li><li> Pour soustraire le signal de fond du canal de GFP, générer des objets de surface, des taches, des start-points et points d&#39; extrémité pour deux axones R dans M6 couche (Figure 3E). <ol><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouvelles surfaces&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Segment seulement une région d&#39;intérêt&quot; dans les paramètres de l&#39;algorithme. Ensuite, sélectionnez un terminal axone R7 entre M5 et M6 couche manuellement. </li><li> Sélectionnez le canal source du photorécepteur. </li><li> Cochez &quot;Lisser&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Intensité absolue&quot; dans le seuil. </li><li> Sélectionner le type de filtre &quot;Qualité&quot; et &quot;Nombre de voxels&quot;, puis filtrer automatiquement. </li><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux Spots&quot;;. </li><li> Sélectionnez &quot;Ignorer la création automatique, modifier manuellement&quot;. </li><li> Sélectionnez &quot;Center of Object&quot; et ajouter une tache dans la zone intérieure de l&#39;objet de surface générée à partir de 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Répéter de 3.5.1 - 3.5.9 pour un autre terminal axone R7. </li><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux points de mesure&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;Modifier&quot; et mettre des points de mesure au-dessus des deux objets de surface de la pointe de la terminaison axonale R7 dans la couche M6. Ceux-ci sont maintenant définies comme start-points. </li><li> Sélectionnez &quot;Ajouter de nouveaux points de mesure&quot;. Ensuite, sélectionnez &quot;Modifier&quot; et mettre des points de mesure sur le fond des deux objets de surface de la pointe de la terminaison axonale R7 dans la couche M6. Ceux - ci sont maintenant définies comme points d&#39; extrémité (Figure 3E). </li></ol></li></ol> 4. Calcul du nombre de points, la distribution de la fréquence de spot et le niveau d&#39;enrichissement de Brp-GFP avec une image personnalisée du logiciel d&#39;analyse de données <ol><li> Copiez le fichier&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; et le dossier &quot;fonctions&quot; dans le dossier MATLAB Imaris XT. A noter que le calcul de cette étude a été réalisée avec un plug-in personnalisé mis en oeuvre dans Matlab. Téléchargez le plugin sur le site Web ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Ouvrez un ensemble de données à n points, n surfaces et 2 mesure des objets ponctuels, contenant chacun des points de mesure n (préparés 3,1 à 3,4). Le premier objet de point de mesure définit les positions de départ pour tous les axones. Le deuxième objet de point de mesure définit la position de fin de tous les axones. Les deux objets de points de mesure ont besoin d&#39;avoir le même nombre de points de mesure (qui est le nombre d&#39;axones). </li><li> Exécuter le traitement d&#39;image &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis détection de synapse Vs 6. </li><li> Vérifiez les métadonnées et modifier la taille des pixels dans le logiciel d&#39;analyse d&#39;image dans le cas où il est inexact. </li><li> Sélectionnez le canal pour la perfORMANCE de l&#39;analyse de l&#39;intensité des taches régions et les régions cytoplasmiques (le canal avec Brp-GFP). </li><li> Définir le nom du fichier pour exporter les résultats. </li><li> Définir le nombre de bacs et de la longueur des axones en pour cent. Entrez le nombre de bacs que &quot;10&quot; et la gamme de bacs que &quot;100%&quot; (figures 4A et 4B). </li><li> Définir les régions des taches et les autres régions cytoplasmiques pour l&#39;analyse de la délocalisation Brp-GFP. Entrez taches rayon que &quot;0,35 um&quot; et la largeur de la zone comme &quot;50 um&quot; entourant. Le rayon des spots définit la région pour le signal puncta GFP (0,35 um de diamètre, centrée sur un punctum). La largeur de la zone environnante définit la région pour le signal de la GFP dans la région cytoplasmique (50 um de diamètre, centré sur le point lacrymal, mais dont seulement R8 et excluant toutes les zones ponctuelles dans le cytoplasme) (figures 4A et 4C). </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que tous les masques de neurones sont traitéset exportés sous forme de fichiers PDF (figures 4B et 4C) et une table de csv pour une analyse ultérieure dans un tableur. Le tableau csv comprend le nombre de taches, l&#39;intensité moyenne du signal dans la «zone cytoplasmique» et l&#39;intensité maximale du signal dans le «spot» dans chaque bac pour tous les axones R8. </li><li> Ouvrez un ensemble de données préparé à 3,5 pour la soustraction du signal d&#39;arrière-plan. </li><li> Effectuer le traitement d&#39;image comme décrit 4,3 à 4,9. </li><li> Calculer la moyenne du nombre total et la répartition de la puncta Brp-GFP dans une feuille de calcul (figures 4D et 4E). </li><li> Calculer la moyenne de la délocalisation des signaux Brp-GFP dans une feuille de calcul par le rapport entre l&#39;intensité moyenne dans la «zone cytoplasmique» divisée par l&#39;intensité maximale dans le &quot;spot&quot; soustraite par l&#39;intensité moyenne du signal d&#39;arrière - plan (figure 4F) . </li></ol>

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<li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732(2013).</li>
<li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons montré comment préparer les conditions de lumière pour exposer les mouches à une intensité lumineuse égale. Nous avons quantifié non seulement le nombre d&#39;un marqueur puncta synaptique, mais pourrait aussi spatialement résoudre la densité des synapses le long des axones et de mesurer le niveau de la protéine marqueur dans les zones cytoplasmiques de délocalisation. Ces trois évaluations nous permettent d&#39;évaluer les détails de la dynamique synaptiques au niveau du neurone unique dans...

<html> La modulation de la fonction synaptique contribue à la remarquable capacité du système nerveux pour répondre précisément ou adapter à l&#39;évolution des stimuli environnementaux. Réglage de la libération des vésicules présynaptique probabilité est un moyen de contrôler la force synaptique 1. La libération des vésicules synaptiques a lieu à la zone active (AZ), une région spécialisée de la membrane présynaptique 2. AZ est caractérisée par une cassette de protéines spécifiques 3, 4. La plupart des protéines qui contribuent à AZ assemblage sont hautement conservés dans les nématodes, les insectes et les mammifères 5. Des études récentes suggèrent que le niveau de l&#39; activité neuronale régule la composition moléculaire de l&#39;AZ, qui à son tour contribue à la régulation de la sortie fonctionnelle à la fois in vitro et in vivo 6, 7,&gt; 8. Nous avons déjà constaté que AZS photoréceptrices subissent un remodelage moléculaire chez la drosophile après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle 9. Dans cette condition, nous avons observé que le nombre de Bruchpilot (Brp) -positif AZS a été réduit dans les axones photoréceptrices. Les protéines Brp / CAST / famille ELKS sont des blocs de construction fondamentaux de AZS dans vertébrées et invertébrées synapses 10. Chez les mutants de Drosophila BRP, a évoqué la libération des vésicules est supprimée 11, 12. Les 17 résidus C-terminaux acides aminés de Brp sont essentiels pour le regroupement des vésicules synaptiques au Drosophile Jonction neuromusculaire (NMJ) 13, 14. Ces études ont démontré le rôle central de cette molécule dans l&#39;organisation et la fonction AZ. Avec un outil génétique récemment mis au point, Synaptic Tagging avec Recombinaison (StAR), Brppeut être observée in vivo dans des types cellulaires spécifiques, à des niveaux d&#39;expression endogènes et à une résolution de 15 synapses unique. Cet outil rend possible d&#39;évaluer la dynamique endogène de synapses quantitativement dans le système nerveux central complexe. Il y a eu plusieurs études, y compris quantifications synaptiques à partir des données obtenues à partir de la microscopie confocale. modifications synaptiques ont été évalués en mesurant la longueur, la zone, le volume, la densité et le comptage du nombre basé sur des applications logicielles sophistiquées. Par exemple, le ImageJ freeware fournit une méthode de quantification pour la zone synaptique totale et des mesures de densité synaptiques au Drosophile NMJ 16. Le nombre de sites de colocalisation des marqueurs pré et post - synaptiques ont été quantifiées à l&#39; aide du plug - in &quot;punctas Analyzer&quot; disponible sur la plate - forme de logiciel ImageJ 17. Alternativement, un multi-pairprogramme basé adigm environnement de calcul numérique, Synapse détecteur (SYND), peut automatiquement tracer dendrites des neurones marqués avec un marqueur fluorescent, puis quantifie les niveaux de protéines synaptiques en fonction de la distance du corps de cellule 18. Le logiciel Synaptic punctas Analysis (SynPAnal), a été conçu pour l&#39;analyse rapide des images 2D de neurones acquises par microscopie confocale ou fluorescent. La fonction principale de ce logiciel est la quantification automatique et rapide de la densité et de l&#39; intensité de la protéine 19 lacrymaux. Récemment, un algorithme automatique basé sur l&#39; apprentissage de détection de synapse a été généré pour la quantification du nombre synaptique en 3D 20, en profitant du logiciel d&#39; analyse 3D Visualization assistée (Vaa3D) 21. logiciel d&#39;analyse d&#39;image commerciale sont également des outils puissants pour quantifications synaptiques. Par exemple, la fluorescence,les récepteurs des neurotransmetteurs marqué ou un composant AZ présynaptique ont été quantifiés en trois dimensions avec une résolution individuelle synapses dans C. elegans 22 ou le système olfactif de drosophile 23, 24, permettant à des centaines de synapses à caractériser rapidement dans un seul échantillon. Ici, nous présentons une méthode par un logiciel d&#39;analyse d&#39;image personnalisée plug-in mis en œuvre dans un environnement de calcul numérique multi-paradigme qui permet d&#39;analyser semi-automatiquement plusieurs aspects de AZS, y compris leur nombre, la répartition et le niveau d&#39;enrichissement de composants moléculaires l&#39;AZ. Ainsi, cette analyse complexe nous a permis d&#39;évaluer la dynamique des composantes synaptiques dans les terminaisons axonales dans différentes conditions environnementales. Nous avons étudié l&#39;effet de l&#39;exposition à la lumière sur les synapses de sortie des photorécepteurs de mouches adultes. La procédure est réalisée en trois étapes: 1)préparation pour exposition à la lumière, 2) la dissection, l&#39;immunohistochimie et l&#39;imagerie confocale, et 3) l&#39;analyse d&#39;image.

<table><tbody><tr><td>Vial</td><td>Hightech, Japon</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Rack transparent personnalisé en résine acrylique&nbsp ;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japon</td><td></td><td>une hauteur de 41 cm, une base de 21 cm, une épaisseur de 4 cm et une hauteur de 13 cm pour chaque pas</td></tr><tr><td>Incubateur cool</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japon</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>Panneau LED</td><td>MISUMI, Japon</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Pomètre numérique</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Coussin anti-mouche</td><td>Tokken, Japon</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri (35 x 10 millimètres)</td><td>Greiner Bio-One International, Allemagne</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>comprimé Takara, Japon</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japon</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Tube de 1,5 mL</td><td>Sarstedt, Allemagne</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde 16 %</td> <td>NEM, Japon</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-chaoptine</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-conjugué anti-souris</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montage Medium</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Lame de microscope (76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelle (18 x 18 mm, 0,17 mm)</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes industriels</td><td>Olympus, Japon</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Éclairage</td><td>Olympus, Japon</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>microscopie confocale</td><td>Zeiss, Allemagne</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Suisse</td><td></td><td>Version 7.6.4 ou supérieure</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel pour Mac&nbsp ;</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analyse synaptic modulation de<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Le système nerveux a la remarquable capacité d&#39;adaptation et de répondre à différents stimuli. Cet ajustement neuronal est largement atteint grâce à la plasticité au niveau synaptique. La zone active (AZ) est la région à la membrane présynaptique qui médie la libération des neurotransmetteurs et est composé d&#39;une collection dense de protéines d&#39;échafaudage. AZS de Drosophila melanogaster (drosophile) photorécepteurs subir un remodelage moléculaire après une exposition prolongée à la lumière ambiante naturelle. Ainsi, le niveau de l&#39;activité neuronale peut réorganiser la composition moléculaire de l&#39;AZ et de contribuer à la régulation de la sortie fonctionnelle. A partir de l&#39;exposition à la lumière de préparation mis en place pour l&#39;immunohistochimie, ce protocole détaille comment quantifier le nombre, la répartition spatiale, et le niveau de délocalisation des molécules synaptiques à AZS dans les photorécepteurs de drosophile. En utilisant l&#39;analyse d&#39;image software, des grappes de l&#39;AZ composant GFP fusionné Bruchpilot ont été identifiés pour chaque photorécepteur R8 (R8) terminaison axonale. taches Bruchpilot détectées sont automatiquement affectées à axones R8 individuels. Pour calculer la distribution de fréquence ponctuelle le long de l&#39;axone, nous avons implémenté un plugin personnalisé. de point de départ de chaque axone et point final ont été définis manuellement et la position de chaque tache Bruchpilot a été projeté sur la ligne de liaison entre le début et la fin du point. Outre le nombre de grappes Bruchpilot, nous avons également quantifié le niveau de délocalisation de Bruchpilot-GFP dans les clusters. Ces mesures reflètent en détail la dynamique synaptiques résolus spatialement dans un seul neurone dans différentes conditions environnementales aux stimuli.

L&#39;œil composé de la drosophile comprend ~ 780 ommatidia, contenant chacun huit types de photorécepteurs (R1-8). R7 et R8 projet leurs axones à la deuxième ganglion optique, le bulbe rachidien, où ils forment des synapses dans les couches M6 et M3, respectivement 26. Pour étudier l&#39;effet de l&#39; exposition prolongée à la lumière de la composition moléculaire de photorécepteurs zones actives R8, nous avons profité de la méthode STaR <sup class="xr...

Ici , nous montrons comment quantifier le nombre et la répartition spatiale des zones actives synaptiques dans Drosophila melanogaster photorécepteurs, mis en évidence avec un marqueur moléculaire codé génétiquement, et leur modulation après une exposition prolongée à la lumière.

Analyse Synaptic Modulation de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Photorécepteurs après exposition à la lumière prolongée

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

L'objectif général de cette procédure expérimentale est de comprendre la dynamique synaptique dans un neurone unique soumis à différentes conditions d'activation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la plasticité synaptique, notamment en révélant les modifications de la composition moléculaire des synapses lors de la maturation de l'activité du neurone. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à permettre l'analyse semi-automatisée de plusieurs aspects des synapses, notamment leur nombre, leur distribution et le degré d'enrichissement en composants moléculaires après la formation des synapses.Pour cette expérience, collectez les mouches dans des vials normaux dans les six heures suivant l’émergence. Placez les vials de collecte dans un support en acrylique transparent. Dans un petit incubateur réglé à 25 degrés celsius, positionnez le support à une distance précise d’un panneau LED afin que l’exposition à la lumière soit en moyenne de 1000 lux.Ensuite, élevez les mouches pendant un à trois jours en utilisant l'une des conditions suivantes : obscurité constante, 12 heures de lumière suivies de 12 heures d'obscurité, ou lumière constante. Par la suite, disséquez et colorez les cerveaux en utilisant des techniques standard. Pour monter les cerveaux de mouche, chargez une micropipette avec du milieu de montage et déposez deux gouttes de 2 µL au centre d'une lame de microscope, espacées d'environ 2 cm.Placez une lame couvre-objet sur chaque goutte, en laissant un espace d’environ 0,2 mm. Ensuite, déposez 15 microlitres de milieu de montage sur les lames couvre-objets et dans l’espace. Sous un microscope stéréoscopique, déposez le cerveau dans l’espace à l’aide d’une micropipette.Ensuite, positionnez les cerveaux avec la face ventrale vers le haut. Enfin, fixez une lame couvre-objet et scellez-la sur les bords à l’aide de vernis incolore. Les cerveaux peuvent alors être observés à l’aide de techniques standard pour reconstituer des images en 3D.Dans ce cas, la luminescence de la GFP est documentée dans les cellules présentant une expression active de Brp en utilisant la méthode star. Dans cet exemple, les axones des photorécepteurs R7 et R8 ont également été immunomarqués à l’aide d’anticiaoptine, visualisés à l’aide d’anticorps secondaires marqués avec un fluorochrome RFP. Pour quantifier le nombre, la distribution et le degré de délocalisation des points fluorescents de Brp-GFP, chargez d’abord les images 3D reconstituées du cerveau obtenues à partir de séries d’images.Les points Brp sont affichés en blanc. Recherchez maintenant la région d'intérêt. Dans ce cas, les terminaisons des axones R8 sont localisées en suivant l'amincissement des axones positifs pour l'anticiaoptine au point d'entrée dans la couche médullaire M3.À chaque terminaison axonale de R8, identifier les punctae Brp GFP à l'aide du module de détection de points. Sélectionner « Ajouter de nouveaux points », puis choisir « Segmenter uniquement la région d'intérêt » dans les paramètres de l'algorithme. Une fois la région d'analyse définie, régler le canal source sur Brp GFP, puis fixer le diamètre estimé XY à 0,35 micron.Ensuite, cochez la soustraction du fond dans la détection des taches. Sélectionnez ensuite la qualité comme type de filtre, et les points sont filtrés automatiquement. Terminez cette étape en cliquant sur « Terminer ».Répétez la méthode de détection des points pour tous les axones R8 dans le jeu de données. La prochaine région à identifier est le cytoplasme de l'axone. Commencez par générer des objets de surface à l'aide de la fonction de surface.Ensuite, sélectionnez « ajouter de nouvelles surfaces » et, dans les paramètres de l'algorithme, activez l'option de segmentation de la région d'intérêt uniquement. Sélectionnez maintenant manuellement la région d'intérêt. Définissez ensuite les périmètres de calcul.Pour trouver le canal des photorécepteurs comme source, sélectionnez l'option lissage. Pour le seuil, choisissez l'intensité absolue. Activez l'option de séparation des objets en contact.Réglez le diamètre des points de siège à 0,5 micromètre et utilisez les paramètres par défaut du filtre pour la qualité et le nombre de voxels. Le filtre est ensuite appliqué automatiquement. Accédez maintenant à l'édition et supprimez les fragments de surface générés à l'extérieur de la région d'intérêt.Dans ce cas, les autres axones. Après avoir répété la détection de la région axonale pour tous les axones R8 dans le jeu de données, toutes les ponctuations Brp et les axones R8 sont identifiées comme un ensemble d'objets ponctuels. Et les régions cytoplasmiques correspondantes sont identifiées comme des objets surfaciques.Maintenant, procédez en définissant manuellement l'orientation et l'espace de chaque axone. Ceci est important pour la quantification ultérieure de la densité de Brp GFP le long de chaque neurone dans le neuropile de la médullo. Pour ce faire, définissez d'abord leurs points de départ et leurs points d'arrivée.Sélectionnez « ajouter de nouveaux points de mesure », puis sélectionnez « modifier » suivi de « sélectionner la surface de l'objet » pour travailler avec la surface supérieure des objets. Pour définir les points de départ, placez des points de mesure sur tous les objets de surface des axones R dans la couche M1. Placez ces points selon un ordre systématique et reproductible.Ensuite, définissez les points terminaux. Sélectionnez ajouter de nouveaux points de mesure, modifier, puis surface de l'objet à nouveau. Ensuite, en répétant le même ordre systématique, placez les points de mesure sur la partie inférieure des axones R dans la couche M3.Pour quantifier l'intensité du fond Brp, analyser les régions cytoplasmiques de deux axones R7. Sélectionner « Ajouter de nouvelles surfaces » et définir manuellement la région d'un axone R7 comme cela a été fait pour les axones R8. Utiliser des paramètres identiques, sauf ne pas activer l'option « activer la séparation des objets en contact ».Laissez ceci désactivé. Ensuite, ajoutez un objet de points factices à l'intérieur d'une région axonale R7 définie. Sélectionnez « Ajouter de nouveaux points », puis choisissez de ne pas créer automatiquement et modifiez manuellement.Ensuite, sélectionnez le centre de l'objet et cliquez sur l'objet de surface pour placer l'objet de points factices à l'intérieur de l'axone R7. Répétez maintenant les étapes de détection de surface et de détection de points pour un second axone R7. Puis définissez les points terminaux initial et final des axones R7 comme cela a été fait pour les axones R8.Pour cette analyse, veillez à avoir installé le logiciel approprié. Ouvrez le jeu de données contenant les données de points, les données de surfaces et deux objets de points de mesure, chacun contenant le même nombre de points de mesure. Examinez les données.Les deux objets de points de mesure doivent avoir le même nombre de points de mesure pour que les calculs fonctionnent. Une fois que les taches, les régions des axones, ainsi que les points de départ et d'arrivée ont été définis, lancez le module complémentaire. Vérifiez d'abord les métadonnées, en particulier la taille des voxels.Ouvrir les propriétés de l'image à partir de l'éditeur, puis vérifier les 3 dimensions du voxel et des microns sous les coordonnées dans la géométrie. Ensuite, sélectionner un canal pour l'analyse d'intensité. Dans ce cas, le canal montrant Brp GFP est sélectionné.Ensuite, définissez le nom du fichier pour les résultats. Puis, définissez le nombre d'intervalles comme étant 10 et réglez la longueur de l'axone à 100 %. Définissez ensuite les régions des ponctuations en réglant le rayon du spot à 0,35 micromètre et la région cytoplasmique environnante à 50 micromètres. Enfin, exécutez la commande de détection des synapses, puis analysez statistiquement les résultats.Après avoir suivi les protocoles décrits, les points fluorescents de Brp GFP ont été analysés dans les synapses R8 de mouches exposées à l'obscurité constante, à la lumière constante ou à un cycle lumineux normal. Le nombre de points de Brp était significativement réduit dans les photorécepteurs R8 des mouches maintenues en lumière constante. La distribution des points a été calculée à l'aide d'un greffon personnalisé.Les synapses R8 étaient réparties tout au long du cylindre axonal, de la couche M1 à la couche M3, mais leur densité était plus élevée aux niveaux des couches M1 et M3. De même, les niveaux de déslocalisation des points fluorescents ont été calculés. Ils sont restés inchangés dans toutes les conditions, cependant les niveaux de déslocalisation de Brp GFP différaient de ceux d'autres capteurs, comme Brp-short-cherry qui devient clairement diffus en lumière constante.Il est possible qu'il y ait un traitement inapproprié du fragment court de Brp après sa dissociation de la zone active. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'analyser les propriétés plas­tiques synaptiques dans un seul neurone. Ces propriétés plas­tiques comprennent le nombre de synapses, leur distribution et l'étiquetage de l'enrichissement d'un composant moléculaire spécifique au niveau des synapses.

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