Name: Preparación y Evaluación de 99m Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Aprende a radiomarcar tetrazinas con tecnecio-99m para imagen predirigida mediante química bioortogonal. Este método permite desarrollar nuevos radiofármacos para diagnóstico y terapia.

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Este trabajo está respaldado por subvenciones de investigación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) de Canadá, el Instituto de Ontario para la Investigación del Cáncer (OICR, #P.SI.015.8) y la Sociedad Canadiense del Cáncer (CCS, #703857). Los autores agradecen las contribuciones del Dr. Denis Snider, quien brindó asistencia en la preparación del manuscrito.

Los estudios con animales fueron aprobados por el Consejo de Ética de Experimentación Animal de la Universidad McMaster, de acuerdo con el Consejo Canadiense de Protección de los Animales (CCPA) directrices. 1. El radiomarcado de ligandos Tz-tridentado con 99m Tc PRECAUCIÓN: Los siguientes procedimientos requieren el uso de compuestos radiactivos. El trabajo sólo debe hacerse en un laboratorio autorizado con el cumplimiento de las normas de seguridad y eliminación. reacciones de microondas se deben realizar en un horno de microondas diseñado específicamente para la síntesis química. <ol><li> Síntesis de [99m Tc (CO) 3 (H2O) 3] + 19, 20 <ol><li> En un vial para microondas, combinar 8 mg K 2 [BH 3 CO 2], 15 mg Na 2 CO 3, 20 mg Na 2 B 4 O 7 · 10H 2 O, y 25 mg KOCO [CH (OH)]2 COONa · 4H 2 O. Purgar el vial durante 10 minutos con gas argón. </li><li> Añadir 4 ml de 99m TcO 4 - (~ 1.100 MBq, ~ 30 mCi) en 0,9% de solución salina al vial. </li><li> La reacción se calienta en un microondas durante 3,5 min a 110 ° C después de 10 s de agitación para asegurar la mezcla completa de los reactivos. </li><li> Ajustar el pH de la solución a 3,5 a 4 utilizando ~ 400 l de HCl 1 M. Comprobar el uso de papel de pH. </li></ol></li><li> El radiomarcado de tetrazina ligandos 1-5 <ol><li> Disolver 2 mg de cada ligando (compuestos 1-5) en 250 ml de MeOH 21. </li><li> Añadir 250 l de [99m Tc (CO) 3 (H2O) 3] + (~ 74 MBq, ~ 2 mCi) a cada solución. </li><li> Se calienta la mezcla de reacción usando un horno de microondas durante 20 min a 60 ° C. NOTA: Este paso fue idéntica para los 5 tetrazinas. </li><li> Para los compuestos 2 a 5, se evapora el disolvente y se re-DISSOLve los productos resultantes en 1 ml de 1: 1 v / v DCM: TFA. </li><li> Calentar los productos de reacción disueltos (2-5) a 60 ° C en un microondas durante 6 min (2-4) o 10 min (5). </li><li> Después de enfriar a temperatura ambiente, se evapora el disolvente usando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm) y se disuelve el compuesto se seca en 1: 1 ACN: H 2 O o 1: 1 MeOH: H 2 O, antes de la purificación por HPLC. </li><li> Purificar los compuestos marcados con Tc 99m (1-5), que incluyen la separación del producto etiquetado de ligando no marcado tetrazina, usando HPLC (C18 de fase inversa). Típicamente, usar un gradiente de elución de 30:70 ACN: H 2 O (ambos con 0,1% de TFA) a 40:60 ACN: H 2 O durante 20 min (18 min) y una columna de 4,6 x 100 mm analítica C 18. Usar tanto UV (254 nm) y detección gamma. <ol><li> Tomar una pequeña muestra de cada producto marcado y comparar su tiempo de retención HPLC a la de un co-injeja, no radiactivo, estándar marcado con Re (0,125 mg en 20% de metanol-H 2 O). El estándar Re-marcado se identifica en la traza de HPLC UV, y eluir en el mismo tiempo que el compuesto marcado con Tc 99m en la traza de γ-HPLC. Esta co-inyección de muestra picos a tiempos de retención comparables, lo que confirma la identidad del compuesto 99m Tc-etiquetados. </li></ol></li><li> Se evapora el disolvente de las fracciones de HPLC utilizando un evaporador (36 ° C, 8 mbar, 3 min, 6000 rpm). </li><li> Formular el compuesto purificado a una concentración de 7,4 kBq / l en PBS, que contenía 0,5% de BSA y 0,01% de Tween-80. </li><li> Para garantizar los compuestos marcados son estables, realice un estudio in vitro de la estabilidad en. Incubar el compuesto formulado a 37 ° C durante 1, 4 y 6 h, la inyección de una pequeña cantidad (3,7 MBq) de la mezcla en la HPLC en cada punto de tiempo para evaluar la estabilidad. </li></ol></li></ol> 2. Pre-Estudios dirigidos biodistribución <ol><li&gt; Preparación de los animales <ol><li> Utilizando, ratones Balb / c hembras de 7-9 semanas de edad (n = 3), administrar TCO-BP formulado en solución salina (20 mg / kg) (5 mg / l), a través de la cola de inyección venosa. </li><li> Coloque el ratón en el dispositivo de restricción física, e identificar las venas situadas en las superficies laterales de la cola y limpie con un algodón con alcohol. En aproximadamente 2 cm desde el extremo de la cola, insertar una aguja de calibre 30 con un ángulo pequeño, en paralelo a la vena. Presione lentamente el émbolo para inyectar, retire la aguja y aplicar esponja de gasa limpia en el sitio de la inyección con una ligera presión hasta que el sangrado se detenga. </li><li> A 1 h después de la inyección de TCO-BP, administrar ~ 0,74 MBq (20 Ci) de Tc-99m tetrazina formulados en 100 l de BSA al 0,5%, 0,01% de Tween-80 en PBS, a través de la cola de inyección venosa. </li></ol></li><li> Los estudios de biodistribución <ol><li> En el punto de tiempo deseado (t = 6 h), anestesiar los ratones utilizando 3% de isoflurano y mezcla de gases de oxígeno 2%. Demostrar una dee pizca de retirada en el ratón anestesiado para asegurarse de que están bajo plano quirúrgico de anestesia. </li><li> Recoger la sangre (1 ml) mediante punción cardíaca usando una jeringa pre-tratado con heparina. Coloque el ratón sobre su espalda con la nariz en el cono de la nariz para la anestesia continua y localizar la apófisis xifoides en el animal. <ol><li> Insertar una aguja de 25 G, ligeramente a la izquierda de la línea media del animal en el marco del proceso xifoides, en un ángulo de 20 °. Inserte completamente la aguja y tire lentamente el émbolo hacia atrás para ver la sangre en el cubo de la aguja si se perfora el corazón. Ligeramente reajustar la aguja mientras mantiene el émbolo en caso necesario, para perforar el corazón. extraer lentamente sangre en la jeringa. </li></ol></li><li> La eutanasia a los animales por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia. </li><li> Coloque cada animal en una bolsa de plástico y utilizar un calibrador de dosis (99m Tc configuración) para medir el nivel de actividad todo el cuerpo. </li><li> Recoge los siguientes tejidos y fluidos pre-pesajeed contando tubos: sangre, médula (rodilla y hombro), la vesícula biliar, los riñones, el hígado, el estómago (con su contenido), los intestinos pequeños (con su contenido), intestino grueso y ciego (con su contenido), la tiroides y la tráquea, vejiga urinaria con orina , y la cola. </li><li> Enjuague tejidos apropiados (con exclusión de la sangre, la vesícula biliar y la vejiga urinaria) en PBS para eliminar la sangre y secar antes de colocar los tejidos en tubos de recuento apropiados. </li><li> Coloque cadáver animal en una bolsa de plástico y medir la actividad de todo el cuerpo residual utilizando un calibrador de dosis. </li><li> Pesar cada tubo que contiene una muestra de tejido. Restar el peso inicial del tubo para obtener la masa del tejido. </li><li> Utilice un calibrador de dosis (99m Tc ajuste) para medir la cantidad de actividad en una muestra de ensayo (100 l) en el momento de la inyección para cada ratón. NOTA: Este muestra de ensayo es igual al volumen de inyección, dando así el recuento de actividad en el momento de la inyección. </li><li> En el momento de la medición de tejido, unaliquot 5 l de la muestra de ensayo utilizado anteriormente. Use un contador gamma multi-detector (99m Tc configuración) y contar hasta obtener el recuento por minuto (CPM) para la muestra 5 mL. </li><li> Usa los dos valores obtenidos en 2.2.9 y 2.2.10 para calcular la actividad y la relación CPM utilizando la ecuación 1 para obtener un factor de conversión (CPM Ci -1). (1) <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55188/55188eq1.jpg" /></li><li> Utilice el contador gamma para medir la cantidad de radiactividad en cada muestra de tejido o fluido. </li><li> Usar la ecuación 1 para calcular la cantidad de actividad en cada tejido o fluido en el momento de la medición en relación con la dosis total inyectada. Este valor se normalizó por el peso de órganos y se expresa como porcentaje de dosis inyectada por gramo (es decir,% ID / g) de tejido. </li><li> Siga los pasos 2.1.2 a 2.2.13 para llevar a cabo un experimento de control negativo utilizando las marcado con 99mTc ligandos tetrazina en el Absencina de TCO-BP. ratones Sacrificio (n = 3) a las 0,5, 1, 4 y 6 h después de la inyección y obtener tejido o fluido como se describe anteriormente. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Se preparó una colección de quelatos tridentado tetrazina ligados de distintas polaridades, y se evaluó la utilidad de sus complejos 99m Tc en la reacción con un derivado IEDDA TCO in vivo. Un método eficaz y reproducible 99m Tc fue desarrollado para cinco tetrazina quelatos, donde la concentración de ligando se 10 -3 M. La etapa de marcaje fue seguido por la desprotección de t- butilo (para los compuestos 2-5). La alta concentración de ligando se utili...

99m Tc sigue siendo el radioisótopo más utilizado en medicina nuclear de diagnóstico, con más de 50 millones de procedimientos de imágenes realizadas por año en todo el mundo 1, 2, 3. La mayoría de los agentes de Tc 99m usados clínicamente son de tipo perfusión radiofármacos. Hay un número limitado de compuestos dirigidos activamente en la que 99m Tc se dirige para unir un marcador biológico específico a través de la ligación a un constructo de reconocimiento. La creación de 99m dirigida radiofármacos Tc es a menudo dificultada por la influencia de 99m complejos de Tc-ligando en la capacidad de la molécula de direccionamiento de obligar a la biomarcador de interés, o los isótopos de vida media no es lo suficientemente largo para su uso con biomoléculas de mayor peso molecular tales como anticuerpos. Este último requiere típicamente varios días antes de las imágenes se adquieren a fin de que la biomolécula para borrar de no diana tiss<html> UES. Pre-focalización ofrece un enfoque alternativo para superar estos desafíos. Pre-orientación combinada con la química bioorthogonal ha demostrado ser una forma eficaz para desarrollar nuevas sondas de imagen molecular tanto para fluorescencia y radio-formación de imágenes 4, 5, 6, 7, 8. La reacción de la demanda de electrones inversa Diels-Alder (IEDDA) entre 1,2,4,5-tetrazina (Tz) y derivados -cyclooctene trans (TCO), tal como se muestra en la Figura 1, ha demostrado ser particularmente eficaz 6. La reacción IEDDA con estos componentes puede exhibir cinética rápida en PBS (2 k ≈ 6.000 M -1 s -1) y una alta selectividad, por lo que es ideal para in vivo de orientación previa aplicaciones 9, 10. e_content &quot;&gt; El enfoque más común utilizado implica la administración de un vector de orientación TCO-derivado y después de un período de retardo suficiente, se administra una tetrazina radiomarcado. tetrazinas radiomarcados basado en 11 C, 18 F, 64 Cu, 89 Zr, y 111 En haber sido reportado 11, 12, 13, 14, 15. por el contrario, sólo hay un informe de un marcado con 99mTc Tz, que se preparó usando un ligando de tipo HYNIC requerir el uso de co-ligandos para prevenir la unión a proteínas y la degradación in vivo 16. Como alternativa, se presenta aquí la síntesis de 99m Tc (I) marcado tetrazinas usando una familia de ligandos que forman complejos estables con un tridentados [99m Tc (CO) 3] + núcleo. Figura 1: La reacción entre IEDDA bioorthogonal tetrazina y -cyclooctene trans. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55188/55188fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> La familia de ligandos preparadas contienen quelatos tridentados que varían en la polaridad y la naturaleza del grupo de enlace entre la región de unión de metal y el Tz (Figura 2). El objetivo fue identificar una Tc-99m tetrazina constructo que podría localizar y reaccionar con los sitios marcados con TCO en vivo y rápidamente claro cuando no estén unidas de manera efectiva, a fin de producir alta objetivo a no objetivo proporciones. Para probar los ligandos, se utilizó un TCO-derivado de un bisfosfonato (TCO-BP) 17. Hemos demostrado previamente que el TCO-BP se localiza en áreas de metabolismo óseo activo y puede reaccionar contetrazinas radiomarcados en vivo 18. Es un reactivo conveniente para probar nuevos tetrazinas, ya que se puede preparar en un solo paso y los experimentos se puede realizar en los ratones normales, donde la localización se produce principalmente en las articulaciones (rodillas y hombros).

<table><tbody><tr><td>Gas argón</td><td>Alphagaz</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>EMD Millipore</td><td>106395</td><td>---</td></tr><tr><td>Na2B4O7&#183; 10H2O</td><td>Anachemia</td><td>S9640</td><td>---</td></tr><tr><td>KNaC4H4O6&#183; 4H2O</td><td>Anachemia</td><td>217255</td><td>---</td></tr><tr><td>Technelite 99mTc Generador</td> de <td>imágenes médicas Lantheus</td><td>---</td><td>Fuente de 99mTcO4-</td></tr><tr><td>0.9% Solución salina</td><td>Imágenes médicas de Lantheus</td><td>---</td><td>Para eluir</td></tr><tr><td>el generador 1 M HCl</td><td>Lab Chem</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Caledon</td><td></td><td>------</td></tr><tr><td>ACN</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>HPLC grado</td></tr><tr><td>Millipore H2O</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Barnstead Nanopure</td><td>---</td></tr><tr><td>DCM</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>TFA</td><td>Caledon</td><td>---</td><td>---</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>pH 7.4 1x</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>---</td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8047</td><td>---</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>CDMV</td><td></td><td>108737 Proveedor: Fresenius Kabi Animal Health</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Waters</td><td>1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (artículo # 15590)</td><td>---</td></tr><tr><td>Columna de HPLC para análisis y purificación de compuestos 2-4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4435-E0</td><td>Gemini&reg; 5 &micro; m C18 110&nbsp; &Aring;, Columna LC 250 x 4,6 mm</td></tr><tr><td>Columna HPLC para análisis y purificación de compuestos 1 y 5</td><td>Aguas&nbsp;</td><td>186003115</td><td>Columna XBridge BEH C18, 130 &Aring;, 5 &micro; m, reactor de microondas de 4,6 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Iniciador 8</td><td>---</td></tr><tr><td>Biotage V10 Evaporador</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>Serial # V1041</td><td>---</td></tr><tr><td>Calibrador de dosis</td><td>Capintec, Inc.&nbsp;</td><td>CRC-25R</td><td>---</td></tr><tr><td>Contador Gamma</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wizard 1470 Contador Gamma Automático</td><td>---</td></tr><tr><td>Báscula de habitación para animales&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>XP105 Delta Range</td><td>---</td></tr><tr><td>Viales para microondas&nbsp;</td><td>Biotage&nbsp;</td><td>355629</td><td>0.5-2 mL&nbsp;</td></tr></tbody></table>

preparación y evaluación de<sup&gt; 99m</sup&gt; tc-etiquetados tridentado los quelatos de orientación previa usando bioorthogonal química

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

La pre-focalización combinada con la química bioortogonal está emergiendo como una forma efectiva de crear nuevos radiofármacos. De los métodos disponibles, la cicloadición de Diels-Alder (IEDDA) de demanda inversa de electrones entre tetrazinas radiomarcadas y transcicloocteno (TCO) unida a una biomolécula ha demostrado ser un enfoque bioortogonal altamente efectivo para obtener imágenes de objetivos biológicos específicos. A pesar de que el tecnecio-99m sigue siendo el isótopo más utilizado en la medicina nuclear diagnóstica, hay una escasez de métodos para preparar tetrazinas marcadas con 99mTc. En este trabajo se presenta la preparación de una familia de derivados tridentados-quelados-tetrazina y sus complejos Tc(I). Estos compuestos, hasta ahora desconocidos, se marcaron radiológicamente con 99 mde Tc utilizando un método asistido por microondas con un rendimiento radioquímico del 31% al 83%. Los productos son estables en solución salina y PBS y reaccionan rápidamente con los derivados del TCO in vitro. Sus capacidades de pre-focalización in vivo se demostraron utilizando un derivado de TCO-bifosfonato (TCO-BP) que se localiza en regiones de metabolismo óseo activo o lesión. En estudios murinos, las 99mTc-tetrazinas mostraron altas concentraciones de actividad en las articulaciones de las rodillas y los hombros, lo que no se observó cuando se realizaron experimentos en ausencia de TCO-BP. La absorción general en órganos no diana y la farmacocinética variaron mucho dependiendo de la naturaleza del enlazador y la polaridad del quelato.

Los ligandos se sintetizaron utilizando diferentes enlazadores y quelantes a través de una simple estrategia de aminación reductora (Figura 2), seguido de acoplamiento del producto a un tetrazina disponible en el mercado 22, 23. El radiomarcado se realizó utilizando el mismo método para todos los compuestos y era altamente reproducible. El proceso se ha optimizado variando el pH, la cantidad de ligando, tiempo de...

Aquí, describimos un protocolo para el radiomarcaje y las pruebas in vivo de derivados tridentados de quelato-tetrazina de Tc(I) 99mpara la química bioortogonal y de pre-targeting.

Preparación y Evaluación de<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc-etiquetados tridentado Los quelatos de orientación previa Usando Bioorthogonal Química

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...

El objetivo general de este procedimiento es producir tetrazinas marcadas con tecnecio-99m para imágenes con pre-enfoque, utilizando química bioortogonal con biomoléculas modificadas con cicloocteno trans como vectores de direccionamiento. Este método proporciona una plataforma importante y novedosa para el desarrollo de nuevos radiofármacos. Mediante el pre-enfoque, los complejos de tecnecio descritos aquí pueden utilizarse para obtener imágenes de una amplia variedad de órganos, tejidos y biomarcadores.Esta técnica es ventajosa porque proporciona un método paso a paso robusto para producir tetrazinas marcadas radiactivamente con tecnecio-99m, el isótopo médico más utilizado en medicina diagnóstica. Esta técnica puede utilizarse con diferentes vectores de direccionamiento, incluyendo moléculas pequeñas y anticuerpos. También puede emplearse en radioinmunoterapia mediante el intercambio del tecnecio por isótopos emisores de partículas beta del renio.La parte de los procedimientos con animales será demostrada por Nancy Janzen, técnica en biología de nuestro laboratorio. Para iniciar el procedimiento de radiomarcado, en un vial de microondas, combine ocho miligramos de boranocarbonato de potasio, 15 miligramos de carbonato de sodio, 20 miligramos de tetraborato de sodio decahidratado y 25 miligramos de tartrato de potasio y sodio tetrahidratado. Purifique el vial con gas argón durante 10 minutos.Luego, agregue cuatro mililitros de pertecnetato de tecnecio-99m en solución salina al 0,9 % con una actividad de 1.110 megabecquerel al vial. Cargue la mezcla de reacción en un reactor de microondas y agite durante 10 segundos. A continuación, caliente la mezcla a 110 grados Celsius durante 3,5 minutos para obtener el catión triaqua tricarbonilo de tecnecio-99m.Añada aproximadamente 400 microlitros de ácido clorhídrico uno molar para ajustar el pH de la solución a entre 3,5 y 4. A continuación, para cada ligando de tetrazina, disuelva dos miligramos de ligando en 250 microlitros de metanol. Añada 250 microlitros del complejo de tecnecio-99m con una actividad de 74 megabecquerelios a cada solución de ligando.Caliente la mezcla en un reactor de microondas a 60 grados Celsius durante 20 minutos. Para los ligandos de tetrazina con grupos protectores t-butilo, transfiera la solución desde un vial de microondas a un vial de centelleo de 20 mililitros, y luego evapore el disolvente y redisuelva cada complejo en un mililitro de una solución uno a uno por volumen de diclorometano y ácido trifluoroacético. A continuación, transfiera la solución a un vial de microondas y caliente esos complejos en un reactor de microondas a 60 grados Celsius durante seis a 10 minutos para desproteger los ligandos.Enfríe los complejos a temperatura ambiente y luego evapore el solvente. Redisuelva los residuos en 500 microlitros de una solución acuosa uno a uno de acetonitrilo o metanol y agua antes de proceder a la purificación por HPLC. Utilice HPLC de fase reversa C18 para purificar cada complejo de tetrazina marcado con radioisótopos mediante un gradiente de elución de 30 a 70, y luego de 40 a 60 de acetonitrilo en agua durante 20 minutos, con ácido trifluoroacético al 0,1 % presente en el eluyente durante todo el proceso.Recolecte el producto purificado cuando aparezca eluyendo en el trazado gamma. Luego, inyecte conjuntamente cada complejo marcado con una solución de 0,125 miligramos del complejo de radio-tetrazina correspondiente en 20% metanol en agua. Compare los tiempos de retención del pico del complejo de renio en el trazado UV y del pico del complejo de tecnecio en el trazado gamma para verificar la identidad del pico gamma.Elimine el disolvente de cada complejo de tecnecio-tetrazina purificado. Formule cada complejo a una concentración de 7,4 kilobecquereles por microlitro en solución salina tamponada con fosfato que contenga 0,5 % de albúmina sérica bovina y 0,01 % de polisorbato 80. Para cada sujeto murino, aspire 100 microlitros de una solución de cinco microgramos por microlitro del derivado TCOPB en solución salina para preparar una dosis de 20 miligramos por kilogramo.Conecte una aguja de calibre 30 a la jeringa de dosificación. Coloque el ratón en un dispositivo de restricción física. Identifique las venas en la superficie lateral de la cola aproximadamente a dos centímetros del extremo de la cola, y limpie el área con un hisopo de alcohol.Introduzca la aguja de la jeringa en un ángulo poco profundo y paralelo a la vena. Inyecte lentamente el derivado de TCOBP. Retire la aguja y aplique una gasa limpia con ligera presión sobre el sitio de inyección hasta que deje de sangrar.Una hora después de la inyección del derivado de TCOBP, administre una dosis de 100 microlitros del complejo de tetrazina con tecnecio-99m deseado con una actividad de aproximadamente 0,74 megabecquerel mediante inyección en la vena de la cola. Utilice un calibrador de dosis para medir la actividad de una muestra de prueba de 100 microlitros del complejo de tecnecio en el momento de la inyección. Guarde la muestra de prueba para mediciones posteriores.Sedue al ratón con una mezcla de gases de isoflurano al 3% y oxígeno al 2% seis horas después de la inyección. Coloque al ratón boca arriba con su nariz en el cono nasal para mantener la anestesia, y localice el proceso xifoides. Conecte una aguja de calibre 25 a una jeringa previamente tratada con heparina.Introduzca la aguja en un ángulo de 20 grados debajo del proceso xifoides, ligeramente a la izquierda de la línea media. Una vez que la aguja esté completamente insertada, retire lentamente el émbolo para verificar la presencia de sangre en el cono de la aguja, lo que confirma una punción cardíaca exitosa. Ajuste la aguja según sea necesario.Una vez que se haya perforado el corazón, extraiga lentamente un mililitro de sangre en la jeringa. Transfiera la muestra de sangre a un tubo de conteo previamente pesado. Eutanalice al ratón mediante dislocación cervical mientras está bajo anestesia.Coloque el animal sacrificado en una bolsa de plástico y mida la actividad corporal total con un calibrador de dosis. A continuación, recoja los huesos de la rodilla y el hombro, la vesícula biliar, los riñones, el hígado, la tiroides y la tráquea, y la cola. Junto con su contenido, recoja el estómago, los intestinos delgados, los intestinos gruesos y el ciego, y la vejiga urinaria.Lave la sangre de todos los tejidos recolectados, excepto de la vesícula biliar y la vejiga urinaria, con solución salina tamponada con fosfatos. Seque los tejidos con papel absorbente y coloque cada tejido en un tubo de conteo previamente pesado. Mida la actividad residual del cadáver.Pese cada muestra de tejido y calcule la masa del tejido por separado. Utilice un contador gamma con múltiples detectores para medir la actividad de una alícuota de cinco microlitros de la muestra de prueba del complejo de tecnecio. Con el valor obtenido en cuentas por minuto y la actividad medida en el momento de la inyección, calcule un factor de conversión.Mida la actividad de cada muestra de tejido y fluido con el detector de rayos gamma. Convierta los valores a microcurios y normalice cada valor según el peso del órgano para determinar el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido. Repita este proceso con ratones adicionales sin la inyección del derivado de TCOPB como una serie de control negativo.Utilizando este método, cinco complejos de tetrazina que diferían en sus combinaciones de enlazador y líder clave fueron marcados con tecnecio-99m. Se utilizó un derivado de TCOPB, que se localiza en regiones con alto recambio de calcio en el hueso, para pre-dirigir las articulaciones del hombro y la rodilla de ratones. Se calcularon las relaciones del porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido de hueso respecto a sangre para cada compuesto de tetrazina.Los cinco compuestos eliminaron rápidamente la sangre y se dirigieron al hueso, lo que indica que la reacción de acoplamiento bioortogonal selectiva entre los compuestos de tetrazina y el derivado de TCOBP había ocurrido in vivo. El compuesto tres mostró la mejor combinación de dirigimiento y eliminación desde la sangre. Los experimentos de control negativo indicaron que los complejos de tetrazina marcados con radioisótopos no se localizaron significativamente en el hueso en ausencia del derivado de TCOBP.Por ejemplo, cuando no se administró el derivado de TCOBP, el compuesto dos presentó altos niveles en la vesícula biliar y en los intestinos, pero muy bajos en el hueso. Se observó una gran variación en la localización tisular en ratones que recibieron el derivado de TCOBP entre los cinco compuestos evaluados. Por ejemplo, se detectó muy poco del compuesto tres en el intestino grueso, hígado o orina y vejiga en comparación con otros complejos, mientras que se observó una cantidad mucho mayor del compuesto tres en el hueso.Una vez dominada, la técnica de marcado descrita aquí puede realizarse de principio a fin en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar esta técnica, es importante asegurarse de que todos los reactivos se pesen con precisión y de que las sales se purguen con argón antes de añadirlas a la solución de tecnecio. También es fundamental ajustar el pH de la solución de tecnecio a entre 3,5 y 4 antes de la adición del ligando de tetrazina.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión sobre cómo preparar y purificar tetrazinas marcadas con tecnecio y cómo se pueden utilizar para crear nuevos radiofármacos mediante química bioortogonal y preenfoque. No olvide tomar las precauciones adecuadas al trabajar con radiactividad, como comprender el tipo de radiación emitida y cómo proteger y manipular mejor las muestras.

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Investigación

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Química

Este vídeo describe la técnica de radioinmunoterapia predirigida o PRIT, en la que se administran inmunoconjugados seguidos de radioligandos para el tratamiento de tumores. Esta radioinmunoterapia reduce las dosis de radiación a los tejidos sanos y utiliza radionúclidos con vidas medias muy bajas incompatibles con los vectores basados en anticuerpos.

Radioinmunoterapia predirigida: un método para la administración dirigida de radionúclidos terapéuticos a los tumores

Para demostrar la imagen molecular del cáncer de MR con un pequeño péptido agente de contraste de MRI específica a las proteínas plasmáticas coagulados en estroma tumoral en un modelo de cáncer de próstata de ratón dirigido.

MR Imagen Molecular del cáncer de próstata con un agente de contraste dirigidos Pequeño Molecular CLT1 Péptido

Se presenta un método para la rápida inmovilización reversible de moléculas pequeñas y las asambleas de nanopartículas funcionalizadas de resonancia de plasmones superficiales (SPR) los estudios, utilizando secuencial en el chip de captura química cicloadición bioorthogonal y anticuerpo-antígeno.

Microfluidic Reacción en el chip de captura-cicloadición para inmovilizar reversiblemente pequeñas moléculas o estructuras de múltiples componentes para aplicaciones de biosensores

La cicloadición de Diels-Alder de demanda de electrones inversos bioortogonales se ha aprovechado para crear una estrategia de imagen PET predirigida eficaz y modular para el cáncer. En este protocolo, los pasos de esta metodología se describen en el contexto de un sistema modelo que emplea el anticuerpo dirigido al cáncer colorrectal huA33 y un radioligando marcado con 64Cu.

El aprovechamiento de la demanda Bioorthogonal Inverse Electron Diels-Alder Cicloadición para Pretargeted TEP

Debido a su vida media radiactiva de varios días y a sus propiedades favorables de desintegración, el radiometal emisor de positrones 89Zr es extremadamente adecuado para su uso en radiofármacos basados en anticuerpos para la obtención de imágenes PET. En este protocolo se describirá la bioconjugación, radiosíntesis y aplicación preclínica de 89anticuerpos marcados con Zr.

El bioconjugación y Radiosíntesis de<sup&gt; 89</sup&gt; Los anticuerpos marcados con Zr-DFO

Se describe un procedimiento detallado para la síntesis de una azida marcado con I125 y el radiomarcado de dibenzocyclooctyne (DBCO) -grupo-conjugados, las nanopartículas de oro de 13 nm de tamaño utilizando una reacción clic libre de cobre.

Un protocolo optimizado para el radiomarcaje eficaz de nanopartículas de oro mediante el uso de una<sup&gt; 125</sup&gt; Azida grupo prostético marcado con I

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em&gt; En Vivo</em&gt; Tráfico de células mediante PET / CT

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte- cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.

Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa

En este protocolo, se describe la síntesis de las vainas, un reactivo phenyoxadiazolyl metil sulfona-basado para el acoplamiento selectivo sitio de cargos a los tioles de biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Además, se describen la síntesis y caracterización de un quelante bifuncional de rodamiento de las vainas y su conjugación a un anticuerpo de modelo.

Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

Se presenta aquí un protocolo para radiomarcar células con un radioisótopo de tomografía por emisión de positrones (PET), 89 Zr (t1/2 78,4 h), utilizando un sintetizón de radiomarcaje listo para usar, [89 Zr]Zr-p-isotiocianatobencil-deferoxamina ([89Zr]Zr-DBN). El radiomarcaje de células con [89Zr]Zr-DBN permite el seguimiento no invasivo y la obtención de imágenes de las células radiomarcadas administradas en el cuerpo con PET hasta 7 días después de la administración.

Tomografía por emisión de positrones Imágenes del tráfico celular: un método de radiomarcaje celular

Aprende a radiomarcar tetrazinas con tecnecio-99m para imagen predirigida mediante química bioortogonal. Este método permite desarrollar nuevos radiofármacos para diagnóstico y terapia.

Preparación y Evaluación de

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