Un capteur basé aptamère pour non chélaté Gadolinium (III)
9 janvier 2017
L’utilisation de molécules polydésoxynucléotidiques (44-mères aptamères) pour détecter l’ion gadolinium(III) non chélaté dans une solution aqueuse est décrite. La présence de l’ion est détectée via une augmentation de l’émission de fluorescence du capteur.
L’objectif global de ce test basé sur la fluorescence est de détecter la présence d’ions gadolinium non chélatés toxiques dans des solutions aqueuses contenant des agents de contraste d’imagerie par résonance magnétique. Cette méthode peut aider à faciliter l’utilisation d’agents de contraste IRM à base de gadolinium en fournissant un moyen d’assurer une parité élevée des agents synthétisés. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est capable de détecter une concentration submicromolaire de gadolinium toxique non chélaté avec une sélectivité relativement élevée par rapport aux autres cations métalliques biologiques.
Pour commencer cette procédure, préparez le tampon d’essai comme indiqué dans le protocole de texte. À l’aide d’hydroxyde de sodium et d’acide chlorhydrique, ajustez le pH à 7,4. Ensuite, filtrez le tampon à travers un filtre stérile jetable avec une membrane PES de 0,2 micron.
Ensuite, transférez 497 microlitres du tampon de dosage dans un nouveau microtube à centrifuger. Ajouter un microlitre de solution mère d’aptamère de gadolinium préparée et deux microlitres de solution mère de QS préparée. Transférez 50 microlitres de cette solution de capteur de gadolinium 2X dans chacun des neuf tubes PCR.
Après cela, placez les tubes dans un thermocycleur. Réglez le thermocycleur pour chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, puis refroidissez lentement les solutions à 25 degrés Celsius pendant 15 minutes. Il est important de ne pas oublier de chauffer les solutions de capteur de gadolinium 2X à 95 degrés, puis de les refroidir lentement à température ambiante avant d’ajouter la solution d’ions gadolinium.
Pour commencer, dissolvez le trichlorure de gadolinium solide dans un tampon de dosage pour créer une solution mère de gadolinium à trois de la concentration souhaitée. En utilisant la dilution en série, préparez six solutions de 100 microlitres de gadolinium comme indiqué dans le protocole de texte. Après cela, dissoudre l’agent de contraste à tester dans le tampon de dosage.
Utilisez la dilution en série pour préparer trois concentrations différentes. Ensuite, retirez les tubes PCR contenant la solution de capteur de gadolinium 2X du thermocycleur. Transférez 50 microlitres de chaque solution de gadolinium dans des tubes PCR séparés.
Pipetez chaque solution de haut en bas plusieurs fois pour mélanger. Ensuite, transférez 50 microlitres de chaque solution d’agent de contraste séparément dans les tubes PCR restants. Mélanger en pipetant plusieurs fois de haut en bas.
Incuber les neuf solutions pendant cinq minutes à température ambiante. Après cela, transférez 45 microlitres de chaque solution dans une plaque de 384 puits en doublets. Ensuite, enregistrez et analysez les données de fluorescence comme indiqué dans le protocole texte.
Dans cette étude, l’ion gadolinium trivalent non chélaté est détecté en solution aqueuse à l’aide d’une méthode basée sur la fluorescence. Le capteur fluorescent est développé en fixant un fluorophore à l’aptamère. Le capteur est ensuite hybridé avec un brin d’extinction, qui est marqué avec une molécule de trempe sombre.
L’ajout de gadolinium trois déplace le brin d’extinction de l’aptamère, provoquant une augmentation de l’émission de fluorescence. Les courbes d’étalonnage sont obtenues à l’aide d’un aptamère de gadolinium de 100 nanomolaires et d’un QS de 200 nanomolaires, et tracées soit en fluorescence brute, soit en changement de pli de fluorescence. Les deux courbes montrent une plage linéaire pour le gadolinium, trois concentrations inférieures à une micromolaire et une saturation du signal à des concentrations supérieures à trois micromolaires.
Deux lots différents d’acide gadotérique sont ensuite analysés pour des concentrations allant de zéro millimolaire à 20 millimolaires. Bien que l’émission de fluorescence de l’échantillon de haute pureté n’augmente pas sensiblement dans cette gamme, un changement significatif est observé dans l’échantillon contenant du gadolinium non chélaté trois à des concentrations aussi faibles que cinq millimolaires. Lors de cette procédure, il est important de s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les puits de la microplaque, car cela modifierait la lecture fluorescente.
En utilisant cette procédure, nous pourrions être en mesure de détecter même de petites quantités d’ions gadolinium calculés dans des solutions contenant des agents de contraste. Ce sera une bonne méthode pour déterminer la pureté des agents. Travailler avec des produits chimiques peut être dangereux et il est important de prendre des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle lors de l’exécution de cette procédure.
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Aperçu
Cette étude présente un dosage basé sur la fluorescence pour la détection d'ions de gadolinium(III) non chélatés toxiques dans les solutions aqueuses. La méthode utilise des molécules de polydésoribonucléotide (aptamère de 44 nucléotides), qui présentent une émission de fluorescence accrue en présence d'ions de gadolinium.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biochimie
- Chimie analytique
Contexte
- Les ions gadolinium(III) sont utilisés comme agents de contraste en imagerie par résonance magnétique.
- Les ions gadolinium non chélatés peuvent être toxiques dans les systèmes biologiques.
- Les dosages par fluorescence offrent une méthode de détection sensible.
- Une forte sélectivité est essentielle pour distinguer le gadolinium des autres cations métalliques.
Objectif de l'étude
- Développer un dosage fiable pour la détection des ions gadolinium non chélatés.
- Garantir la sécurité des agents de contraste pour l'IRM à base de gadolinium.
- Parvenir à une détection à des concentrations submicromolaires.
Méthodes utilisées
- Préparation d'un tampon de dosage avec ajustement du pH à 7,4.
- Filtration du tampon à travers un filtre stérile.
- Utilisation d'aptamères polydésoribonucléotidiques pour la détection.
- Mesure des variations d'émission de fluorescence en présence d'ions gadolinium.
Résultats principaux
- Le test détecte avec succès les ions gadolinium à de faibles concentrations.
- Une sélectivité élevée par rapport à d'autres cations métalliques biologiques a été obtenue.
- Émission de fluorescence a augmenté significativement en présence du gadolinium.
- La méthode peut améliorer la sécurité de l'utilisation des agents de contraste en IRM.
Conclusions
- Cet essai basé sur la fluorescence est efficace pour surveiller les concentrations d'ions gadolinium.
- Il offre un moyen de garantir la qualité des agents à base de gadolinium.
- Des applications futures pourraient inclure une surveillance plus large dans les domaines environnemental et biologique.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La détection des ions gadolinium(III) non complexés est essentielle pour assurer la sécurité et la qualité des agents de contraste à base de gadolinium utilisés en imagerie par résonance magnétique (IRM) dans le diagnostic clinique. Ce capteur de fluorescence fondé sur un aptamère permet la détection de Gd³⁺ toxique à des concentrations submicromolaires dans un tampon aqueux, facilitant ainsi le développement précoce de tests pour l'évaluation de la pureté des agents de contraste. La méthode fournit un signal de lecture sélectif et reproductible, qui contribue à l'atténuation des risques mécanistiques lors de l'identification des candidats prometteurs et du criblage préclinique des formulations.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmacie
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse de la stabilité des chélates de gadolinium et de l'efficacité de la liaison des ligands dans le développement d'agents de contraste.
- Valeur opérationnelle : Permet la validation fonctionnelle de la chimie de chélation en détectant les produits de dissociation.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère des mesures quantitatives de fluorescence pour évaluer la pureté de l'agent de contraste à travers des dilutions sérielles.
- Valeur opérationnelle : Compatible avec les formats de microplaque de 384 puits, permettant le criblage à haut débit de lots d'agents de contraste.
- Valeur opérationnelle : Démontre une sélectivité vis-à-vis des ions physiologiques (Na⁺, K⁺, Ca²⁺), réduisant ainsi les faux positifs dans des matrices complexes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Fournit un système pertinent pour la maladie permettant de surveiller la libération de gadolinium dans des conditions biologiques simulées.
- Valeur opérationnelle : Soutient les décisions d'optimisation pondérées en fonction des risques en quantifiant le Gd³⁺ non complexé résiduel lors du criblage des formulations.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du criblage précoce d'agents de contraste à l'évaluation préclinique de la sécurité, où la détection d'ions métalliques résiduels oriente l'optimisation de la formulation ainsi que les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses concernant la stabilité des chélates et l'intensité des interactions ligand-ion dans des environnements aqueux.
- Écrantage : Assure la préparation et la reproductibilité des tests pour la comparaison inter-lots de la pureté des agents de contraste.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de variables dépendantes (changement relatif de fluorescence) permettant de comparer les concentrations de Gd³⁺ entre échantillons.
- Recherche translationnelle : S'inscrit dans la continuité préclinique en simulant les conditions biologiques dans lesquelles une dissociation du gadolinium pourrait survenir.
- Réutilisation en entreprise : Constitue une capacité analytique réutilisable pour le contrôle qualité dans la fabrication des agents de contraste et les tests de stabilité.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive quant à la sécurité des agents de contraste en détectant le Gd³⁺ toxique à des niveaux nanomolaires.
- Valeur opérationnelle : Offre une standardisation et une reproductibilité grâce à des mesures de fluorescence contrôlées par tampon et stabilisées en pH.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'acceptation ou de rejet en identifiant les lots présentant du gadolinium résiduel non chélaté avant leur libération préclinique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation fondée sur les risques des candidats agents de contraste selon leur efficacité de chélation et leur rétention d'ions métalliques.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Requiert une expertise dans la manipulation des acides nucléiques, l'hybridation d'aptamères et la détection de fluorescence.
- Dépend d'un équipement de cyclage thermique pour le recuit du brin d'aptamère extincteur et de lecteurs de plaques microtitration pour la quantification de la fluorescence.
- Nécessite une standardisation interéquipes des protocoles de préparation des tampons, de réglage du pH et de filtration.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'extension à d'autres lanthanides en raison d'une réactivité croisée partielle avec Eu³⁺ et Tb³⁺.
- Limité par l'absence de spécificité absolue pour Gd³⁺ par rapport aux autres lanthanides trivalents, nécessitant une confirmation orthogonale dans les échantillons complexes.
Foire aux questions sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
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Title
4:33
Conclusion
0:36
Preparation of Aptamer Stock Solutions and 2x Gd-sensor Solution
1:52
Constructing the Fluorescence Calibration Curve and Detecting the Presence of Unchelated Gd3+ in a Solution of Gd Contrast Agent
3:15
Results: Changes in the Fluorescence Emission of the Aptamer-based Sensor in the Presence of Gadolinium(III)
