Analyse de la ségrégation chromosomique, de l'acétone d'histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes
11 mai 2017
Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d'ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l'acétylation des histones mondiales et l'expression de l'ARNm.
Les objectifs généraux de cette approche expérimentale sont, d’une part, de caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes de cheval et, d’autre part, de comparer les gamètes d’un même animal qui ont été traités in vitro ou in vivo. Cette approche expérimentale peut aider à répondre à des questions clés sur la biologie des ovocytes et la fertilité chez les espèces monovulatoires. Cela pourrait également améliorer la sécurité des procédures de manipulation des gamètes.
Cette approche a été développée pour surmonter la disponibilité limitée d’échantillons d’ovocytes, en particulier d’espèces monovulatoires. La démonstration des procédures OPU sera assurée par le Professeur Stefan Deleuze de l’Université de Liège, Cécile Douet, la responsable de mon laboratoire, et Fabrice Reigner, le responsable de l’unité équine de l’INRA Centre Val de Loire. Au quotidien, évaluer le diamètre des follicules ovariens dans une cohorte de juments adultes à l’aide d’ultrasons.
Recherchez un grand follicule d’un diamètre supérieur à 33 millimètres. Une fois trouvé, préparez-vous à injecter 1 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine pour induire la maturation de l’ovocyte en un follicule dominant. Ensuite, localisez le sillon jugulaire et tamponnez le site d’injection avec de l’alcool.
Ensuite, pour faire remonter la veine, appliquez une force à deux ou trois centimètres sous le site d’injection. Insérez l’aiguille presque parallèlement au cou, aspirez légèrement pour vous assurer que l’aiguille est dans la veine et injectez l’hormone. Préparez une sonde d’échographie pour l’accès vaginal.
Ensuite, connectez l’aiguille à un système d’aspiration. 35 heures après l’injection d’hCG, configurez l’instrumentation pour l’UPU et endormez la jument. Une bonne analgésie est extrêmement importante pour la sécurité de l’animal et de l’opérateur.
Un animal qui ne ressent pas de douleur ou d’inconfort permettra la manipulation de l’ovaire, ce qui facilitera les ponctions et les rinçages. Une fois la sonde à aiguille insérée, un opérateur doit manipuler l’ovaire pour faire face à la sonde pendant que l’autre opérateur manipule l’aiguille. Localisez le follicule dominant dans l’image échographique.
Ensuite, utilisez l’aiguille pour percer la paroi vaginale et la paroi du follicule dominant. Une fois que l’espace folliculaire est accédé, aspirez le liquide folliculaire. Tournez l’aiguille pour gratter la paroi folliculaire et fixer le complexe cumulus-ovocyte.
Ensuite, versez le liquide dans une grande boîte de Pétri. Et sous un stéréoscope, recherchez le COC. Pendant ce temps, rincez le follicule avec du PBS modifié Dulbecco chaud contenant de l’héparine.
Il peut falloir plusieurs vidages pour collecter le COC. Une fois le COC trouvé, remplacez l’aiguille par une aiguille à double lumière et collectez les COC immatures de tous les follicules d’un diamètre compris entre cinq et 25 millimètres. Ceux-ci seront utilisés pour la maturation in vitro.
Une fois que tous les follicules d’un ovaire sont aspirés, répétez les mêmes procédures pour prélever les COC immatures de l’autre ovaire. Maintenant, choisissez entre les COC. Ne conservez que des COC avec plusieurs couches complètes de cellules de cumulus et un ooplasme brun finement granulé.
Jetez les autres. À la fin de la procédure, injectez à la jument 15 000 unités de benzyl-pénicilline pour prévenir l’infection. Ensuite, logez la jument dans une écurie calme et propre pendant au moins deux heures pendant qu’elle récupère.
Avant le début de l’UPU, réchauffez une bouteille de TCM-199 tamponné à HEPES à 37 degrés Celsius. Ensuite, préparez le milieu IVM. Distribuez 500 microlitres de TCM-199 tamponné au bicarbonate de sodium supplémentaire dans les puits d’une boîte à quatre puits.
Ensuite, incubez le plat à 38,5 degrés Celsius pendant au moins deux heures. Transférez les COC immatures récupérés dans une boîte de 3,5 centimètres remplie de deux millilitres de HEPES TCM-199 réchauffé. Déplacez les COC à travers différentes régions de la parabole pour laver doucement les débris environnants.
Maintenant, transférez les COC dans le milieu IVM et incubez-les pendant 28 heures à 38,5 degrés Celsius. Pour effectuer un comptage chromosomique sur des COC matures, incubez-les dans du monastrol de 100 micromolaires pendant une heure à 38,5 degrés Celsius. Ensuite, éliminez les cellules du cumulus en traitant les COC avec 0,5 % d’hyaluronidase dans le TCM-199 tamponné par HEPES.
Surveillez cette réaction sur une scène chauffée réglée à 38 degrés Celsius. Dans les cinq minutes environ, retirez toutes les cellules. Utilisez un pipetage doux pour éliminer les dernières cellules tenaces.
Ensuite, retirez la zone pellucide à l’aide de 0,2 % de pronase dans le TCM-199 tamponné HEPES. Surveillez également cette réaction sur une scène chauffée. Cela devrait prendre environ cinq minutes à compléter.
Ensuite, fixez les ovocytes dans du paraformaldéhyde à 4 % dans DPBS pendant 15 minutes à 38,5 degrés Celsius, suivis de 45 minutes supplémentaires de fixation à quatre degrés Celsius. Après la fixation, laver les ovocytes en les transférant séquentiellement entre trois puits d’alcool polyvinylique à 0,1 % dans du DPBS. Utilisez environ un demi-millilitre de solution par puits.
Ensuite, transférez les ovocytes dans un puits rempli de 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS, et laissez-les incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Pour bloquer les signaux non spécifiques, baignez les cellules dans le DPBS avec 1 % de BSA et 10 % de sérum d’âne normal. Incuber les cellules pendant au moins 30 minutes à température ambiante.
Après 30 minutes, appliquez l’anticorps primaire, puis incubez les cellules à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, lavez les ovocytes et appliquez l’anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante, à l’abri de l’exposition à la lumière. Après l’application du secondaire, lavez à nouveau les ovocytes.
Ensuite, avant le montage, fixez des bandes de ruban adhésif double face aux glissières pour servir de supports de lamelles. Maintenant, montez les ovocytes trois à quatre par lame dans une goutte de milieu de montage anti-décoloration non durcissant complétée par 20 micromolaires de YO-PRO-1. Laissez les ovocytes se déposer pendant environ 10 minutes, puis appliquez les lamelles.
Sur les 32 COC prélevés par OPU à partir des follicules dominants, 28 étaient en métaphase II.En utilisant la maturation in vitro, 37 des 44 COC collectés à partir de follicules non dominants ont été matures en métaphase II.Les chromosomes des deux groupes ont ensuite été comparés. Les ovocytes matures in vitro étaient souvent atteints d’aneuploïdie, principalement d’hyperploïdie. Cela n’a pas été observé dans les ovocytes matures in vivo.
Ensuite, la longueur de l’axe d’un pôle à l’autre et le diamètre de l’axe à son maximum ont tous deux été mesurés. Les ovocytes matures in vitro étaient significativement plus longs et plus larges que les ovocytes matures in vivo. Dans les mêmes échantillons, le niveau global d’acétylation de H4K16 a été mesuré.
Les résultats ont été conformes aux attentes. L’acétylation de H4K16 était significativement plus faible dans les ovocytes matures in vitro que dans les ovocytes matures in vivo. Une équipe bien entraînée peut traiter cinq juments en une matinée d’OPU avec un taux de récupération de 80 % pour l’ovocyte préovulatoire et de 50 à 60 % de récupération des ovocytes immatures.
Pendant l’OPU, surveillez toujours l’état et le bien-être de l’animal, et soyez prêt à fournir des soins vétérinaires adéquats si nécessaire. L’approche expérimentale peut également être appliquée aux ovocytes d’autres espèces et est particulièrement applicable lorsque la disponibilité des échantillons est un problème, comme chez l’homme. Sur la base de nos résultats, des études doivent être entreprises pour mieux comprendre les conditions de culture nécessaires à une bonne ségrégation des chromosomes et aux changements épigénétiques.
L’objectif global est d’améliorer l’efficacité de la maturation in vitro pour la médecine vétérinaire et le traitement de la fertilité humaine.
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Aperçu
Cet article présente une approche expérimentale permettant de caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes équins. Il décrit la collecte d'ovocytes équins immatures et matures par prélèvement d'ovocytes sous guidage échographique (OPU) et examine la ségrégation chromosomique, la morphologie du fuseau, l'acétylation globale des histones et l'expression des ARNm.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie de l'ovocyte
- Fertilité chez les espèces monovulantes
- Procédures de manipulation des gamètes
Contexte
- La compréhension des caractéristiques de l'ovocyte est cruciale pour la recherche sur la fertilité.
- Les espèces monovulatoires ont une disponibilité limitée d'ovocytes.
- La PUV guidée par échographie peut améliorer la collecte d'échantillons.
- Une analyse comparative des gamètes traités in vitro et in vivo est essentielle.
Objectif de l'étude
- Caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes équins.
- Comparer les gamètes provenant du même animal traités dans des environnements différents.
- Améliorer la sécurité des procédures de manipulation des gamètes.
Méthodes utilisées
- Prélèvement d'ovocytes sous guidage échographique (OPU) pour la collecte d'ovocytes.
- Évaluation du diamètre des follicules ovariens chez les juments adultes.
- Étude de la ségrégation chromosomique et de la morphologie du fuseau.
- Analyse de l'acétylation globale des histones et de l'expression des ARNm.
Résultats principaux
- Collecte réussie d'ovocytes équins immatures et matures.
- Apercus sur la ségrégation chromosomique et la morphologie du fuseau.
- Données sur les niveaux globaux d'acétylation des histones.
- Les profils d'expression des ARNm pertinents ont été établis.
Conclusions
- L'étude fournit un cadre pour la caractérisation des ovocytes chez le cheval.
- Les résultats pourraient améliorer la compréhension de la fertilité chez les espèces monovulatoires.
- Les techniques de PUV peuvent améliorer la sécurité de la manipulation des gamètes.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La caractérisation de la biologie de l'ovocyte chez les espèces monovulatoires répond à un goulot d'étranglement critique dans la recherche et le développement en reproduction, où la disponibilité limitée des échantillons entrave les études mécanistiques. Cette approche permet une analyse comparative des effets de la maturation in vitro par rapport à la maturation in vivo sur l'intégrité chromosomique et la régulation épigénétique, fournissant des indications prédictives pour l'optimisation des conditions de culture. Ces données contribuent à réduire les risques associés aux technologies de reproduction assistée en identifiant les aneuploïdies et les anomalies du fuseau induites par la culture avant leur translation clinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les mécanismes de fidélité méiotique en quantifiant l'incidence de l'aneuploïdie comme indicateur fonctionnel de la compétence en matière de ségrégation chromosomique.
- Valeur scientifique : Le profilage de l'acétylation des histones (H4K16) relie l'état épigénétique à la morphologie du fuseau, soutenant la validation ciblée des voies HDAC/HAT lors de la maturation de l'ovocyte.
- Valeur opérationnelle : Fournit un cadre cytologique standardisé pour évaluer les paramètres de qualité des ovocytes, applicable à différentes espèces présentant un accès limité aux ovocytes.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Les mesures morphométriques quantitatives des chromosomes et du fuseau établissent des critères objectifs et reproductibles pour évaluer les conditions de culture de maturation.
- Valeur opérationnelle : Les protocoles d'immunomarquage de la tubuline et des histones acétylées permettent de créer des tests transférables pour le criblage à haut contenu de modificateurs épigénétiques.
- Valeur scientifique : L'analyse de la stabilité des ARNm par qPCR en conditions de silence transcriptionnel contribue à l'identification de cibles régulatrices post-transcriptionnelles.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : La comparaison directe d'ovocytes matures in vitro et in vivo provenant du même animal permet d'isoler les effets spécifiques à la culture, renforçant ainsi la pertinence translationnelle des modèles précliniques.
- Valeur opérationnelle : Établit des dimensions de référence du fuseau et des seuils d'acétylation pour définir les états physiologiques de maturation chez les espèces soumises à une contrainte monovulatoire.
- Valeur scientifique : Les jeux de données sur les modifications des histones soutiennent la découverte de biomarqueurs pour la prédiction de la compétence ovocytaire dans les procédés de reproduction assistée.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans la phase de biologie de la découverte, où les connaissances mécanistiques sur la qualité des gamètes orientent la validation des cibles en amont et le développement des tests en aval pour les thérapeutiques de la reproduction.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur la dysrégulation épigénétique induite par la culture et son impact sur la fidélité de la ségrégation chromosomique.
- Écrantage : Fournit des mesures quantitatives normalisées (nombre de chromosomes, morphométrie du fuseau, niveaux d'acétylation) pour évaluer les effets de composés ou de conditions sur la maturation de l'ovocyte.
- Analytique : Génère des paramètres mesurables (taux d'aneuploïdie, intensité de H4K16, dimensions du fuseau) permettant des comparaisons statistiques entre groupes expérimentaux.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats in vitro à des références in vivo, réduisant ainsi le risque d'extrapolation spécifique à l'espèce lors du développement de modèles précliniques de fertilité.
- Réutilisation en milieu professionnel : Les protocoles de PUV et de fixation créent une plateforme réutilisable de caractérisation des ovocytes, applicable à d'autres espèces monovulantes confrontées à une pénurie d'échantillons.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la sécurité du protocole de maturation grâce à la liaison directe entre les conditions de culture et les paramètres d'intégrité épigénétique et chromosomique.
- Valeur opérationnelle : Des protocoles normalisés de collecte et de traitement des ovocytes améliorent la reproductibilité entre laboratoires et espèces.
- Valeur stratégique : La détection précoce des anomalies méiotiques induites par la culture réduit le risque d'échec en phase avancée du développement des technologies de reproduction assistée.
- Impact sur le portefeuille : Une hiérarchisation fondée sur les données des formulations de milieux de maturation, selon des seuils de normalité du fuseau et d'aneuploïdie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Une expertise dans la manipulation des ovocytes, la micromanipulation et la microscopie à fluorescence est requise pour une analyse précise des chromosomes et du fuseau.
- La microscopie confocale à balayage laser et les systèmes de plateau chauffant sont essentiels pour la fixation et l’imagerie résolues dans le temps des structures méiotiques.
- La standardisation interlaboratoires de la validation des anticorps (tubuline, H4K16ac) et des protocoles de montage garantit des résultats quantitatifs comparables.
- L’adaptation à différentes espèces nécessite une optimisation des seuils de taille des follicules pour la PUV et des doses hormonales en fonction de la physiologie de la reproduction.
- Les limites incluent un faible rendement d’ovocytes par séance et l’impossibilité d’évaluer l’activité transcriptionnelle en raison du silence global pendant la maturation, ce qui déplace l’attention vers la régulation post-transcriptionnelle.
