Name: Analyse de la ségrégation chromosomique, de lacétone dhistone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Découvrez la caractérisation morphologique et biochimique des ovocytes équins par ponction échoguidée. Cette méthode compare les gamètes matures in vivo et in vitro pour améliorer la sécurité des procédures de manipulation.

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Les auteurs souhaitent remercier Fabrice Vincent pour le support avec la microscopie confocale à laser (LSCM) , et Philippe Barrière et Thierry Blard pour l&#39;analyse quotidienne des ultrasons et l&#39;injection de hCG. Ce travail a été soutenu en partie par le projet «Ex Ovo Omnia» de Regione Sardegna and Regione Lombardia (Subvention n ° 26096200 à AML); La bourse &quot;L&#39;Oreal Italie par le Donne et la Scienza 2012&quot; (contrat 2012 à FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agence de recherche et de recherche (REA) &quot;Pro-Ovum&quot; (Subvention n ° 303640 à VL); Et par l&#39;École postdoctorale d&#39;agriculture et de médecine vétérinaire, cofinancée par le Fonds social européen, Programme opérationnel sectoriel pour le développement des ressources humaines 2007-2013 (numéro de contrat POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 à la messagerie instantanée). La collecte ovocyte in vivo a été financée par l&#39;Institut Français du Cheval et de l&#39;Equitation.

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de soins et d&#39;utilisations des animaux CEEA Val de Loire numéro 19 et ont été réalisées conformément aux Principes directeurs pour la prise en charge et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 1. Collection d&#39;ovocytes et maturation in vitro <ol><li> Prise d&#39;ovule <ol><li> Évaluation quotidienne par échographie du diamètre des follicules ovariens dans une cohorte de juments adultes. À l&#39;émergence d&#39;un follicule ≥33 mm (follicule dominant), injecter la jument avec 1 500 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG) dans la partie supérieure de la veine jugulaire (iv). <ol><li> Avant d&#39;effectuer l&#39;injection, tamponnez la zone avec de l&#39;alcool, localisez le sillon de la joule et placez le pouce 2-3 cm sous le site d&#39;injection pour amener la veine à augmenter. Insérez l&#39;aiguille presque parallèlement au cou et aspirer pour s&#39;assurer que l&#39;aiguille est dans la veine (le sang entrera dans la seringue). À ce stade, injectez-vous; HCG va induire le mL&#39;actualisation de l&#39;ovocyte dans le follicule dominant. </li></ol></li><li> 35 h après l&#39;injection de hCG, calient la jument avec de la detomidine (15 μg / kg, iv), du tartrate de butorphanol (10 μg / kg, iv) et du bromure de butylscopolamine (0,2-0,3 mg / kg, 15 mL / mare, iv). </li><li> Connectez l&#39;aiguille à la sonde à ultrasons. Insérez la sonde ultrasonore par voie vaginale et maintenez l&#39;ovarien transréctéralement pour faire face à la sonde ultrasonore. Demandez à un opérateur de manœuvrer l&#39;aiguille et l&#39;autre pour maintenir l&#39;ovaire en place, avec le follicule face à la sonde à ultrasons . Début de l&#39;ovaire avec le follicule dominant. </li><li> Percer la paroi vaginale et la paroi du follicule dominant avec l&#39;aiguille (les sondes à ultrasons pour OPU sont équipées d&#39;un canal pour l&#39;aiguille connectée à un système d&#39;aspiration); Theneedle sera visible dans l&#39;image échographique. </li><li> Aspirer le fluide folliculaire dans un tube conique de 50 ml connecté au système d&#39;aspiration. Verser le contenu de la coniqueTube dans une grande boîte de Petri et recherche le complexe cumulus-ovocytes (COC) en utilisant un stéréomicroscope. </li><li> Étant donné que le COC n&#39;est pas toujours récupéré avec le liquide folliculaire, rincer le follicule avec la solution saline tamponnée au phosphate modifiée par Dulbecco (DPBS) contenant 5 UI / mL d&#39;héparinat à 37 ° C. Examiner le DPBS pour la présence de COC, comme décrit précédemment pour le fluide folliculaire à l&#39;étape 1.1.5. Rincer plusieurs fois jusqu&#39;à ce que le COC soit récupéré. </li><li> Une fois que le COC du follicule dominant est récupéré, percer et rincer les follicules ≥ 5 et ≤ 25 mm, comme décrit pour le follicule dominant dans les étapes 1.1.3-1.1.4; Les follicules ≥ 5 et ≤25 n&#39;expriment pas l&#39;hormone lutéinisante / le récepteur de la choriogonadotropine (LHCGR) et, par conséquent, leurs ovocytes ne deviennent pas mûr en réponse à l&#39;hCG et seront recueillis au stade GV (immature). Ne conservez que les COC avec plusieurs couches complètes de cellules cumulus et un ooplasme brun, finement granulé. Jeter les autres. </li><li> À la fin de l&#39;OPU, enJecte la jument avec la pénicilline benzylique 15 000 UI / animal pour prévenir l&#39;infection. </li><li> Maison la jument dans une étable calme et propre pendant au moins 2 h. Vérifiez les signes de sensibilisation en déterminant la position des oreilles, la réaction aux stimuli ( par exemple, le bruit) et la démarche avant de retourner la jument à la compagnie d&#39;autres animaux. </li></ol></li><li> Mûrissement in vitro <ol><li> Le TCM199 tamponné par HEPES chaud (20 mM Hepes) complété par 1 790 UI / L d&#39;héparine, 0,4% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA), de pénicilline et de streptomycine à 37 ° C. Préparez ce support à l&#39;avance. Filtrer et stériliser à 4 ° C jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Préparer le milieu IVM en complétant le TCM199 tamponné au NaHC03 (25 mM de NaHC03) avec 50 ng / mL de facteur de croissance épidermique (EGF) et 20% de sérum de veau 7 . Utilisez le TCM199 tamponné avec du NaHCO 3 dans les 3 semaines suivant l&#39;ouverture d&#39;une nouvelle bouteille. Préparez l&#39;EGF à l&#39;avance en tant que stocks 100x, congéluez-le à -20 ° C, Et l&#39;utiliser dans les 6 mois. Dispenser 500 μL dans les puits d&#39;un plat à 4 puits et incuber dans de l&#39;air humidifié avec 5% de CO 2 à 38,5 ° C pendant au moins 2 h. </li><li> Après la récupération des COC des follicules ≥ 5 et ≤25 mm, les mettre dans une boîte de Petri (3,5 cm de diamètre) remplie de 2 mL de HEPES-TCM199. Déplacez les COC dans différentes zones du plat afin de laver les débris cellulaires. </li><li> Transférer les COC au milieu IVM et incuber pendant 28 h dans de l&#39;air humidifié avec 5% de CO 2 à 38,5 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Immunofluorescence et analyse d&#39;image <ol><li> Nombre de chromosomes <ol><li> Après la collecte du follicule dominant ou à la fin de l&#39;IVM, incuber les COC avec 100 μM de monastrol pendant 1 h dans de l&#39;air humidifié avec 5% de CO 2 à 38,5 ° C. Préparez monastrol à l&#39;avance en tant que 100x stocks et rangez-le à -20 ° C pour un maximum de 1 an. </li><li> Supprimer les cellules cumulusEn les traitant avec 0,5% d&#39;hyaluronidase ou par pipettage doux; Élimine la zone pelucheuse en la traitant avec une pronase de 0,2%. Préparer la hyaluronidase et pronase à l&#39;avance en 10x et stocker à -20 ° C pendant 1 an. </li><li> Fixer les ovocytes dans du paraformaldéhyde à 4% dans du DPBS pendant 15 minutes à 38,5 ° C, puis encore 45 minutes à 4 ° C. MISE EN GARDE! Portez un équipement de protection individuelle lors de la manipulation du paraformaldéhyde et éliminez les matériaux contaminés conformément aux directives d&#39;élimination des déchets dangereux. </li><li> Laver les ovocytes en transférant séquentiellement dans 3 puits remplis de 500 μl de DPBS additionnés de 0,1% d&#39;alcool polyvinylique (PVA). Perméabiliser dans 0,3% de Triton X-100 pendant 10 min à température ambiante (RT). </li><li> Bloquer la liaison non spécifique par incubation dans du DPBS supplémenté avec 1% d&#39;albumine de sérum bovin (DPBS-1% BSA) et 10% de sérum d&#39;âne normal pendant au moins 30 minutes à la RT. Les échantillons peuvent être conservés en solution de blocage à 4 ° C pendant 3 à 4 jours. </li><li> Pour la coloration primaire, incuber les ovocytes chez le lapin anti-Aurora B phospho-Thr232 dans du DPBS additionné de 1% de BSA (dilution 1:50) à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Lavez les ovocytes comme décrit à l&#39;étape 2.1.4. Incuber les ovocytes dans une solution d&#39;IgG anti-lapin conjuguée à l&#39;isothiocyanate de tétra-méthylrhodamine (TRITC) (1: 100 dans DPBS-1% BSA) pendant 1 h à la RT dans l&#39;obscurité. </li><li> Lavez les ovocytes comme décrit à l&#39;étape 2.1.4, puis placez 3-4 ovocytes dans une goutte de support de non-durcissement, anti-décoloré, complété par 20 μM de YOPRO1 sur une glissière en verre. Répétez la procédure jusqu&#39;à ce que tous les ovocytes soient montés (3-4 ovocytes par lame). </li><li> Laisser reposer les ovocytes pendant environ 10 min dans le support de montage, puis les couvrir avec une lamelle. Pour éviter d&#39;écraser les ovocytes, appliquez deux bandes de ruban adhésif double face avant de poser la lamelle sur la glissière en verre. REMARQUE: Cette précaution garantira également que tous les échantillons sont également comprimés entre le verreDe et la lamelle couvre-chef. Les glissières en verre peuvent être congelées à -20 ° C et imagées pendant les 2-3 jours suivants. </li><li> Image des échantillons sur un microscope à balayage laser confocal avec un objectif 60X en utilisant les canaux rouge (centromère) et vert (chromosomes) 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Numérisez les échantillons couvrant l&#39;ensemble de la plaque métaphasique sur l&#39;axe des z, avec des étapes toutes les 0,35 μm. Enregistrez les images numérisées de chaque plan. </li><li> Comptez les centromères dans les sections confocales en série à l&#39;aide de la fonction de comptage cellulaire du logiciel NIH ImageJ (disponible à: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). REMARQUE: Évitez un nombre répété de centromères qui apparaissent sur les sections adjacentes en identifiant les centromères qui apparaissent, restent et disparaissent dans des sections séquentielles avec un code numérique. </li><li> Répétez la co chromosomiqueDébutant à l&#39;étape 2.1.11 avec un opérateur indépendant. NOTE: Classer les ovocytes comme euploïde (32 chromosomes), hyperploïdes (&gt; 32) ou hypoploïdes (&lt;32). </li></ol></li><li> La morphologie de la broche et l&#39;acétylation des histones <ol><li> Après la collecte du follicule dominant ou à la fin de l&#39;IVM, éliminer les cellules cumulus par traitement dans 0,5% d&#39;hyaluronidase ou par pipettage doux, comme décrit à l&#39;étape 2.1.2. </li><li> Laver les ovocytes dans le DPBS-PVA, comme à la étape 2.1.4, et les réparer dans du paraformaldéhyde à 2,5% pendant 20 minutes à 38 ° C. Lavage extensif, comme décrit dans la étape 2.1.4, et perméabiliser dans 0,1% de Triton X-100 pendant 5 min à la RT. REMARQUE: Portez un équipement de protection individuelle lors de la manipulation du paraformaldéhyde et éliminez les matériaux contaminés conformément aux directives d&#39;élimination des déchets dangereux. </li><li> Bloquer la liaison non spécifique par incubation dans du DPBS supplémenté avec 2% d&#39;albumine de sérum bovin (DPBS - 2% BSA), 0,05% de saponine et 10% de sérum d&#39;âne normal pourR 2 h à la RT. REMARQUE: Les échantillons peuvent être conservés dans une solution de blocage à 4 ° C pendant 3 à 4 jours. </li><li> Pour la coloration primaire, incuber les ovocytes dans l&#39;anti-alpha-tubuline de souris (1: 150) et le lapin anti-acH4K16 (1: 250) dans du DPBS-2% de BSA avec 0,05% de saponine à 4 ° C pendant une nuit. </li><li> Lavez les ovocytes à l&#39;étape 2.1.4. Incuber les ovocytes dans une solution d&#39;IgG anti-souris anti-souris (1: 500) et d&#39;IgG conjuguée à un colorant fluorescent vert (1: 500) et IgG anti-lapin conjuguée à TRITC (1: 100) dans de la BSA à DPBS-2% avec 0,05% de saponine pendant 1 h à RT dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les ovocytes comme à la étape 2.1.4, puis placer 3-4 ovocytes dans une goutte du milieu de montage non durcissant, anti-fade supplémenté avec 1 μg / mL 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) Sur une glissière en verre. </li><li> Monter les ovocytes sur les lames de verre comme décrit à l&#39;étape 2.1.8. </li><li> Image des échantillons sur un microscope à balayage laser confocal avec un objectif 60x en utilisant les canaux rouge (acH4K16), vert (alpha-tubuline) et bleu (ADN). REMARQUE: conservez les réglages laser pour les canaux rouge et bleu pendant toute l&#39;acquisition de tous les échantillons. Numérisez les échantillons couvrant toute la broche méiotique et la plaque métaphasique sur l&#39;axe z, avec des étapes toutes les 0,35 μm. Enregistrez les images numérisées (plans simples et image 3D projetée). </li><li> Mesurez la longueur de la broche de pôle à pignon et le diamètre de la broche à la largeur maximale de l&#39;image projetée à l&#39;aide de la fonction de mesure du logiciel NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Répétez chaque fois 3 fois et calculez la moyenne. </li><li> Quantifier la fluorescence relative d&#39;acH4K16 en utilisant la fonction de densité intégrée du logiciel NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Normalisez-le pour la densité intégrée de la coloration DAPI. </li></ol></li></ol> 3. Analyse de l&#39;expression de l&#39;ARNm <ol><li> Une fois que les COC ont été récupérés à partir des follicules de 5 à 25 mm, collecter la cellule granulosa sLa suspension usée qui est restée dans la boîte de Petri et la lave deux fois en DPBS froid en centrifugant à 10 600 xg pendant 2 min. Geler instantanément dans l&#39;azote liquide. Conservez les échantillons à -80 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois; Les cellules serviront pour la courbe standard. </li><li> Supprimez soigneusement toutes les cellules cumulus, comme décrit à l&#39;étape 2.1.2, à partir d&#39;ovocytes mûrs (MV) immatures (GV), mûrs in vitro et in vivo . </li><li> Lavez les ovocytes, comme décrit dans 2.1.4, dans DPBS-PVA, collectez-les individuellement dans des volumes de 1 μL et pose 2 μL de RNALater sur le dessus. Gel instantané à l&#39;azote liquide. Conservez les échantillons à -80 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Ajouter 2 pg d&#39;ARN de Luciferase à chaque échantillon comme piquante . Collez les ovocytes 2 x 2 et extrayez l&#39;ARN total en utilisant un kit à base de filtre à membrane de silice approprié pour récupérer l&#39;ARN à partir de petits échantillons. </li><li> Inverser la transcription de l&#39;ARN dans 10 μL avec 0,25 μg d&#39;hexamères aléatoires et la transcriptase inverse du virus de la leucémie Moloney de souris pendant 1 h à 37 ° C<html> 176; C. Conservez les échantillons à -20 ° C pendant jusqu&#39;à 6 mois. </li><li> Diluer l&#39;ADNc des cellules de granulosa dans de l&#39;eau sans ARNase à 50 ng / μL. Diluer en série cette solution 1:10 pour obtenir des solutions de 5 ng / μL, 0,5 ng / μL, 0,05 ng / μL et 0,005 ng / μL. </li><li> Assembler les réactions par triplé dans un volume total de 20 μL par réaction en utilisant un ADNc équivalent à 0,05 oocytes comme substrat, soit 5 μL des dilutions en série de l&#39;ADNc de la cellule granulosa, 10 μL de supermix vert SYBR et 0,3 μM de chaque amorce spécifique ( Tableau 1 ). </li><li> Exécuter la réaction dans un thermocycleur en utilisant un protocole en 3 étapes: 95 ° C pendant 30 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 20 s, répétés 40 fois. Enfin, acquérir la courbe de fusion, à partir de 60 ° C, et augmenter la température de 0,5 ° C toutes les 20 s jusqu&#39;à 95 ° C. </li><li> Évaluer la quantité de départ (SQ) de l&#39;ARNm spécifique dans les échantillons d&#39;ovocytes en utilisant la courbe standardF &quot;&gt; 15 calculé sur la base de l&#39;échantillon de cellules de granulosa. Exprimez les données en tant que rapport entre le SQ du gène d&#39;intérêt et le SQ des gènes de ménage. </li></ol>

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<li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).</li>
<li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation%2C+fertilization%2C+and+early+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li>
<li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li>
<li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Même si la MIV a été réalisée chez les chevaux depuis plus de 20 ans 16 , nous ne savons pas encore si l&#39;ovocyte peut être l&#39;origine de l&#39;aneuploïdie embryonnaire, comme cela a été proposé pour l&#39;homme 17 . La raison en est probablement que la préparation de spreads d&#39;ovocytes pour le comptage des chromosomes entraîne une perte d&#39;échantillon considérable. Dans cet esprit, une enquête sur les méthodes utilisées pour enquêter sur les erreurs dans la s...

Une vaste gamme de techniques de reproduction assistée a été développée pour traiter l&#39;infertilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. L&#39;une des procédures les plus courantes dans les milieux cliniques est la récupération des ovocytes de la métaphase II (MII) des follicules ovariens par aspiration transvaginale guidée par ultrasons, prélèvement d&#39;ovule (OPU) 1 . Ces ovocytes sont ensuite fécondés in vitro (FIV), l&#39;embryon (s) résultant (s) implanté (e) dans un utérus receveur. Les ovocytes de stade MII (matures) sont récupérés suite à l&#39;administration de gonadotrophines exogènes. Cependant, ce traitement est associé, chez certains patients, au développement du syndrome d&#39;hyperstimulation ovarienne (OHSS) 2 . Prenant avantage de la capacité intrinsèque des ovocytes immatures (stade GV) pleinement développé à reprendre spontanément la méiose une fois isolée de leurs follicules, il est possible d&#39;obtenir des ovocytes matures sans administrationLa gonadotrophine 3 . Cette procédure s&#39;appelle la maturation in vitro des ovocytes (IVM) et représente une approche moins axée sur les médicaments, moins coûteuse et plus respectueuse du patient de la technologie de la reproduction assistée. Cependant, le succès du développement embryonnaire avec des ovocytes mûres in vitro est généralement inférieur à celui des ovocytes matures in vivo 4 , 5 . Une explication possible est que les ovocytes matures in vitro sont plus affectés par des erreurs dans la ségrégation chromosomique et l&#39;aneuploïdie qui en résulte entrave le développement embryonnaire normal 6 . La compréhension de la base moléculaire de la mauvaise séparation chromosomique pendant l&#39;IVM révèlerait finalement le plein potentiel de cette technique. Dans cette optique, l&#39;approche expérimentale utilisée pour étudier les caractéristiques morphologiques et biochimiques des ovocytes à matrice in vitro , par rapport à la matur in vivoLes ovocytes sont ici décrits 7 , 8 . Plus précisément, les procédures pour l&#39;OPU des ovocytes immatures et mûres et l&#39;IVM des ovocytes immatures sont illustrées à l&#39;aide de chevaux adulte et naturellement cyclables en tant que modèle expérimental. Ensuite, l&#39;immunofluorescence et l&#39;analyse d&#39;image sont utilisées pour étudier la ségrégation chromosomique, la morphologie de la broche et le modèle global d&#39;acétylation des histones sur ces gamètes. Enfin, un protocole de transcription inverse et de PCR quantitative est décrit pour l&#39;analyse de l&#39;expression de l&#39;ARNm. Par rapport aux modèles animaux de rongeurs, les chevaux ne permettent pas la manipulation génétique, sont moins faciles à manipuler et nécessitent un entretien coûteux. Cependant, ce modèle prend un intérêt considérable pour l&#39;étude de la maturation des ovocytes 9 , 10 en raison de la similarité avec la physiologie ovarienne humaine 11 , 12 &lt;/ Sup&gt;. En outre, le développement de protocoles fiables de IVM-IVF dans le cheval a un intérêt économique substantiel, car il permettrait d&#39;augmenter le nombre de poulains issus de juments de haute valeur génétique. L&#39;une des limites de l&#39;exécution d&#39;expériences sur les ovocytes, en particulier chez les espèces monovulatrices, est la disponibilité d&#39;échantillon restreinte. Cette limite a été surmontée ici en ajustant une approche, précédemment développée chez la souris, aux ovocytes de chevaux 13 , 14 afin de mener le comptage des chromosomes qui minimise la perte d&#39;échantillon (voir la discussion pour une comparaison avec d&#39;autres techniques disponibles). En outre, un protocole de coloration à triple fluorescence a été optimisé pour effectuer des analyses multiples sur le même échantillon, et des analyses de q-PCR ont été réalisées uniquement sur des pools de 2 ovocytes. Dans l&#39;ensemble, la présente étude décrit une approche expérimentale visant à améliorer morphologiquement et biochimiquementRaccordez l&#39;ovocyte du cheval, un type de cellule qui est extrêmement difficile à étudier en raison de la faible disponibilité de l&#39;échantillon. Cependant, il peut étendre notre connaissance de la biologie de la reproduction et de la stérilité des espèces monovulatrices.

<table><tbody><tr><td>sonde à ultrasons</td><td>Aloka</td><td>UST-5820-7,5</td><td></td></tr><tr><td>gonadotrophine chorionique humaine</td><td>centravet</td><td>CHO004</td><td>1 500 unité/animal IV</td></tr><tr><td>détomidine</td><td>centravet</td><td>MED010</td><td>9 - 15 &micro ; g/kg IV</td></tr><tr><td>butylscopolamine bromure</td><td>centravet</td><td>EST001</td><td>0,2 mg/kg IV</td></tr><tr><td>stéréomicroscope</td><td>NIKON</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>butorphanol</td><td>centravet</td><td>DOL003</td><td>10&micro ; g/kg IV</td></tr><tr><td>benzyl-pénicilline</td><td>centravet</td><td>DEP203 IM</td><td>15 000 UI/animal</td></tr><tr><td>TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769 10X1L</td><td>poudre pour tampon à l’hepes TCM199</td></tr><tr><td>Hepes sel de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784-100G</td><td></td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>héparine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3-buffered TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154-500ML</td><td>liquide pour IVM facteur</td></tr> de <tr><td>croissance épidermique</td> moyen <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>sérum de veau nouveau-né</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-well dishes</td><td>NUNCLON</td><td></td> 144444 <td></td></tr><tr><td>incubateur</td><td>Heraeus</td><td>BB6060</td><td></td></tr><tr><td>monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td></td></tr><tr><td>hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>alcool polyvinylique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>sérum d’âne normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>lapin anti-Aurora B phospho-Thr232</td><td>BioLegend</td><td>636102</td><td></td></tr><tr><td>âne conjugué TRITC anti-lapin IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Vecta-Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YOPRO1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal à balayage laser</td><td>LSM 780 Microscope</td> confocal à balayage laser <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>rsb.info. nih.gov/ij/download.html</td><td>ressource</td><td></td>gratuite</tr><tr><td>souris anti-alpha-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8203</td><td></td></tr><tr><td>lapin anti-acH4K16</td><td>Upstate Biotechnologie</td><td>07-329</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-souris IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>DAPI</td></tr><tr><td></td><td>centrifuge Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Luciferase RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>PicoPure Kit d’isolement de l’ARN</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>hexamères aléatoires</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>souris Moloney leucémie virus transcriptase inverse</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>SYBR green supermix</td><td>BioRad</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>amorces spécifiques</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>des amorces spécifiques ont été conçues à l’aide du logiciel Primer3Plus (ressource gratuite)</td></tr><tr><td>thermocycleur</td><td>BioRad</td><td>MyiQ</td><td></td></tr><tr><td>souris monoclonale anti-CENPA</td><td>Abcam</td><td>ab13939</td><td></td></tr> souris <tr><td>monoclonale anti-Aurora B</td><td>Abcam</td><td>ab3609</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse de la ségrégation chromosomique, de l&#39;acétone d&#39;histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Le domaine de la procréation assistée a été développé pour traiter la stérilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. Dans le cheval, la reproduction assistée permet également la production d&#39;embryons de haut niveau sans interrompre leur carrière sportive et contribue à une augmentation du nombre de poulains chez les juments de haute valeur génétique. Le présent manuscrit décrit les procédures utilisées pour la collecte d&#39;ovocytes immatures et matures à partir d&#39;ovaires à cheval utilisant un prélèvement d&#39;ovule (OPU). Ces ovocytes ont ensuite été utilisés pour étudier l&#39;incidence de l&#39;aneuploïdie en adaptant un protocole préalablement développé chez la souris. Plus précisément, les chromosomes et les centromères des ovocytes de la métaphase II (MII) ont été marqués par fluorescence et comptés sur des plans focaux séquentiels après un balayage par microscope laser confocal. Cette analyse a révélé une incidence plus élevée dans le taux d&#39;aneuploïdie lorsque des ovocytes immatures ont été recueillis à partir des follicules et ont été mûris in vitro par rapport àIn vivo. L&#39;immunocoloration pour la tubuline et la forme acétylée d&#39;histone quatre à des résidus spécifiques de lysine a également révélé des différences dans la morphologie de la broche méiotique et dans le schéma global de l&#39;acétylation des histones. Enfin, l&#39;expression d&#39;ARNm codant pour les histone désacétylases (HDAC) et les acétyl-transferases (HAT) a été étudiée par transcription inverse et PCR quantitative (q-PCR). Aucune différence dans l&#39;expression relative des transcrits n&#39;a été observée entre les ovocytes matures in vitro et in vivo . En accord avec un silence général de l&#39;activité de transcription pendant la maturation des ovocytes, l&#39;analyse de la quantité de transcription totale ne peut révéler la stabilité ou la dégradation de l&#39;ARNm. Par conséquent, ces résultats indiquent que d&#39;autres réglementations translationnelles et post-traductionnelles pourraient être affectées. Dans l&#39;ensemble, la présente étude décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement l&#39;ovocyte du cheval, un ceLl est extrêmement difficile à étudier en raison de la faible disponibilité des échantillons. Cependant, il peut élargir nos connaissances sur la biologie de la reproduction et la stérilité dans les espèces monovulatrices.

Les résultats originaux de ces expériences ont été décrits en profondeur précédemment 7 et sont présentés ici comme un exemple de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant les protocoles décrits. Taux de maturation Sur les 32 COC récupérés par OPU à partir des follicules dominants, 28 (88%) étaient au stade MII. Quatorze des 58 COC collect...

Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d&#39;ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l&#39;acétylation des histones mondiales et l&#39;expression de l&#39;ARNm.

Analyse de la ségrégation chromosomique, de l&#39;acétone d&#39;histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Les objectifs généraux de cette approche expérimentale sont, premièrement, de caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes équins et, deuxièmement, de comparer les gamètes provenant du même animal qui ont été traités in vitro ou in vivo. Cette approche expérimentale peut aider à répondre à des questions clés en biologie des ovocytes et en fertilité chez les espèces monovulatoires. Elle pourrait également améliorer la sécurité des procédures de manipulation des gamètes.Cette approche a été développée afin de pallier la disponibilité limitée d'ovocytes, notamment chez les espèces monovulatoires. La démonstration des procédures de PUV sera assurée par le professeur Stefan Deleuze de l'Université de Liège, Cecile Douet, la responsable de mon laboratoire, et Fabrice Reigner, le responsable de l'unité équine du centre INRA Val de Loire. Évaluez quotidiennement le diamètre des follicules ovariens d'un groupe de juments adultes à l'aide d'une échographie.Rechercher un follicule de grande taille ayant un diamètre supérieur à 33 millimètres. Une fois localisé, préparer l'injection de 1 500 unités de gonadotrophine chorionique humaine afin d'induire la maturation de l'ovocyt

analysis-chromosome-segregation-histone-acetylation-spindle

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Nous présentons ici un protocole pour la caractérisation des ovocytes de souris antraux basés sur une organisation nucléolaire.

Isolement et caractérisation de souris Antral ovocytes Basé sur Nucleolar Organisation chromatine

L’ovogenèse chez les mammifères est connu pour être source d’erreurs, notamment en raison de missegregation de chromosome. Ce manuscrit décrit des méthodes de préparation de la chromatine se propager de la prophase de la souris, métaphase I et II-mise en scène des ovocytes. Ces techniques fondamentales permettent l’étude des protéines liées à la chromatine et la morphologie des chromosomes tout au long de l’ovogenèse chez les mammifères.

La chromatine propager des préparations pour l’analyse de Progression d’ovocyte de souris de la Prophase à la métaphase II

Ce manuscrit présente une méthode détaillée pour la génération X-sondes de bras de chromosome et performants fluorescence in situ hybridation (poisson) pour examiner l’état de sœur cohésion des chromatides sœurs en prométaphase et métaphase que j’ai arrêté  Drosophile ovocytes. Ce protocole est convenable pour déterminer si la cohésion bras méiotique est intacte ou perturbé dans différents génotypes.

À l’aide de hybridation In Situ par Fluorescence (FISH) pour surveiller l’état des bras cohésion en prométaphase et métaphase j’ai Drosophila ovocytes

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Nous fournissons un aperçu du protocole clinique pour l'évaluation non-invasive de la maturité humaine d'oeuf utilisant la microscopie polarisée de lumière.

Évaluation de la maturité des œufs humains et son application clinique

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

L’erreur dans la ségrégation chromosomique est une caractéristique commune dans les ovocytes. Par conséquent, l’étude du point de contrôle de l’assemblage de la broche donne des indices importants sur les mécanismes nécessaires pour produire des œufs sains. Le présent protocole décrit trois essais complémentaires pour évaluer l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris.

Évaluation de l’intégrité du point de contrôle de l’assemblage de la broche dans les ovocytes de souris

Les erreurs méiotiques dans les synapses et la recombinaison sont courantes chez les ovocytes de mammifères. Une analyse rigoureuse des protéines impliquées dans ces processus est essentielle pour comprendre comment et pourquoi l’ovogenèse tourne souvent mal. Les techniques présentées ici permettent un suivi complet de la recombinaison et des synapses pour évaluer la qualité des ovocytes chez la souris.

Préparation de la propagation des chromosomes méiotiques à partir d’ovocytes de souris pour l’évaluation de la synapse et de la recombinaison

Découvrez la caractérisation morphologique et biochimique des ovocytes équins par ponction échoguidée. Cette méthode compare les gamètes matures in vivo et in vitro pour améliorer la sécurité des procédures de manipulation.

Analyse de la ségrégation chromosomique, de l'acétone d'histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes

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