Une procédure exhaustive pour évaluer la

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le comportement in vivo des nanomédicaments anticancéreux aux niveaux systémique, tissulaire, cellulaire unique et subcellulaire chez des souris porteuses de tumeurs et immunocompétentes. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine des nanomédicaments anticancéreux : comment les nanomédicaments s'accumulent-ils de manière quantitative dans différents tissus d'animaux vivants au fil du temps ?

L'avantage principal de cette technique est que cette approche de double marquage permet la caractérisation in vivo de nanomédicaments du niveau macroscopique au niveau microscopique. Nous choisissons les liposomes comme exemple pour démontrer notre procédure, car les liposomes sont actuellement utilisés en clinique et constituent également une plateforme courante pour les nanomédicaments expérimentaux. Pour commencer la procédure, dissolvez 20 milligrammes d'un mélange lipidique, contenant 0,1 % en mole d'un colorant fluorescent cationique lipophile et deux millilitres de chloroforme.

Ensuite, séchez les lipides à l'aide d'un évaporateur rotatif. Ajoutez 20 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate aux lipides séchés. Soniquez le mélange sur glace avec un sonicateur à sonde de 3,8 millimètres à 30 watts pendant 30 minutes, en maintenant la température du mélange entre 4 et 20 degrés Celsius tout au long du processus.

Centrifuger la suspension résultante de nanoparticules liposomales à 4 000 G pendant 10 minutes. Éliminer le culot et laver les liposomes avec du PBS, en utilisant un filtre centrifuge à seuil de poids moléculaire de 100 kilodaltons à 4 000 G. Transférer les liposomes concentrés depuis la chambre supérieure vers un nouveau tube de centrifugation. Les liposomes peuvent être conservés dans du PBS au réfrigérateur pendant une semaine au maximum.

Réaliser la diffusion dynamique de la lumière sur un mélange de 50 microlitres de la suspension de liposomes purifiée et de 950 microlitres de PBS. Mesurer les tailles des particules et déterminer la distribution de taille. Pour commencer la procédure de radiomarquage, transférer dans un tube de 1,5 millilitre le volume requis de liposomes purifiés et de PBS afin d'obtenir deux milligrammes de lipides.

Ajouter un microcurie de zirconium-89 oxalate pour un volume final de 100 microlitres et un pH compris entre 6,9 et 7,1. Agiter le mélange à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, éliminer le zirconium-89 libre par filtration centrifuge à l’aide d’un filtre de 100 kilodaltons à 4 000 G. Laver le rétentionnat trois fois avec du PBS stérile à 4 000 G. Puis, diluer le rétentionnat à environ trois microcuries par microlitre pour l’injection.

Utilisez une HPLC par exclusion stérique couplée à un détecteur de radiation pour déterminer la pureté radiochimique des liposomes radiomarqués. Si la pureté radiochimique est inférieure à 95 %, reformulez la dose. Utilisez la diffusion dynamique de la lumière pour confirmer que la taille des particules et les valeurs de distribution sont similaires à celles des liposomes non radiomarqués.

Pour commencer la procédure d'imagerie, injectez environ 300 microcurie de liposomes radiomarqués dans la veine de la queue d'une souris porteuse de mélanome maintenue en place. Deux minutes après l'injection, utilisez une seringue à insuline de calibre 28 pour prélever 10 à 20 microlitres de sang dans la veine de la queue de la souris. Transférez l'échantillon de sang dans un tube de comptage préalablement pesé.

Prélevez un échantillon de sang, pesez-le et mesurez l'activité à l'aide d'un compteur gamma. Calculez la concentration d'activité radioactive en pourcentage de la dose injectée par gramme. Quinze minutes après l'injection, prélèvez et mesurez un autre échantillon de sang de la même manière.

Ensuite, anesthésiez la souris par administration de 2 % d'isoflurane et d'oxygène via un embout nasal. Prélève et mesure un troisième échantillon sanguin une heure après l'injection. Puis, laissez la souris se remettre dans une cage de récupération jusqu'à ce que la mobilité normale soit rétablie.

Prélevez des échantillons supplémentaires quatre, huit, 24 et 48 heures après l'injection. Laissez la souris se rétablir complètement entre les injections. Hébergez la souris dans une pièce désignée pour les animaux auxquels des matières radioactives ont été administrées.

À 24 ou 48 heures après l'injection de liposomes, anesthésiez la souris avec 2 % d'isoflurane et de l'oxygène. Placez la souris sur le ventre sur la plateforme d'un scanner microPET-CT pour petits animaux. Poursuivez l'administration de 2 % d'isoflurane et d'oxygène au moyen d'un embout nasal.

Appliquer une pommade ophtalmique vétérinaire sur les yeux de la souris pour éviter qu'ils ne s'assèchent. Ensuite, introduire le plateau du scanner dans l'appareil. Réaliser un examen PET statique de tout le corps d'une durée de 15 minutes, avec au moins 50 millions d'événements coïncidents, une énergie comprise entre 250 et 700 kiloélectronvolts et une fenêtre temporelle de coïncidence de six nanosecondes.

Ensuite, effectuez un scan CT de cinq minutes avec 120 pas de rotation sur 220 degrés, avec environ 145 millisecondes par image. Une fois le scan terminé, sacrifiez immédiatement la souris par asphyxie au dioxyde de carbone. Confirmez le décès en pinçant la patte de l'animal, puis pratiquez une dislocation cervicale.

Perfuser les tissus avec du PBS pour éliminer le sang, puis prélever les échantillons de tissus pertinents. Peser les tissus collectés et mesurer leur activité. Calculer l'accumulation de liposomes radiomarqués dans le tissu en pourcentage de la dose injectée par gramme.

Conserver le tissu tumoral dans du PBS froid. Réaliser une cytométrie en flux ex vivo et une imagerie d'immunofluorescence sur le tissu tumoral prélevé afin de mesurer l'accumulation par rapport aux populations cellulaires. L'imagerie TEP/TDM chez des souris porteuses de tumeurs injectées avec des nanoparticules marquées au zirconium-89 a révélé une accumulation significative des nanoparticules dans le tissu tumoral 24 heures après l'injection.

La demi-vie sanguine des nanoparticules s'est révélée d'environ 10 heures. Les mesures de biodistribution ex vivo à 24 heures post-injection étaient concordantes avec les mesures in vivo par TEP/TDM. L'accumulation des nanoparticules a ensuite été étudiée au niveau monocellulaire à l'aide de techniques d'immunomarquage.

La cytométrie en flux a indiqué que les nanoparticules s'accumulaient préférentiellement dans les macrophages assistés par la tumeur. L'imagerie en immunofluorescence d'échantillons tumoraux a également montré un ciblage spécifique des cellules endothéliales par les nanoparticules. Cette technique peut aider les chercheurs à identifier des nanomédicaments prometteurs pour une traduction clinique.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est effectuée correctement. Lors du marquage isotopique de nanomédicaments, il est essentiel d'appliquer des normes élevées de contrôle qualité. Après cette procédure, d'autres nanomédicaments, tels que des nanoémulsions, des nanoparticules polymériques, des micelles, des anticorps et des fragments d'anticorps, peuvent être marqués afin de mesurer leur performance in vivo chez des souris porteuses de tumeurs.