Name: Méthodes pour lauto-intégration de Megamolecular biopolymères sur le séchage à lair-LC Interface (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Découvrez l'auto-intégration de biopolymères mégamoléculaires à l'interface air-cristal liquide par séchage. Cette méthode permet de visualiser les comportements dynamiques et l'orientation des biopolymères à l'échelle millimétrique.

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1. Instruments <ol><li> Dispositif de Polarisation <ol><li> Pour construire un dispositif de polarisation, une source de lumière avec une lampe à halogène, un guide de lumière, des polariseurs, un étage d&#39;échantillon, un rail optique, la tige se tient, et un appareil photo reflex mono-objectif numérique (voir la figure 1C et les matériaux de la liste pour la polarisation parties du dispositif). </li></ol></li></ol> 2. Préparation de la solution de biopolymère <ol><li> Solutions polysaccharidiques <ol><li> Dissoudre Sacran 7 (0,5 g) dans de l&#39; eau pure (100 ml) , on a agité à ~ 80 ° C pendant plus de 12 h. Au cours de la dissolution, recouvrir le récipient avec une pellicule de plastique pour empêcher l&#39;évaporation. Préparer une solution aqueuse de gomme xanthane de la même manière. </li><li> Refroidir les solutions à ~ 25 ° C pour obtenir 0,5% en poids de solutions aqueuses. </li><li> Centrifuger la solution pour éliminer les impuretés Sacran (48400 xg, 4 ° C, 1 h, 3 times). </li></ol></li><li> solution MT <ol><li> Préparer une solution de tubuline 0,5% en poids (1 ml) dans un tampon de Britton-Robinson (80 mM pipérazine N, N &#39;-bis (2-éthanesulfonique) (PIPES), 1 mM d&#39; éthylène glycol-bis (éther β-aminoéthyl) - N, N, N &#39;N&#39; acide tétraacétique (EGTA), et 5 mM de MgCl2, pH 6,8) sur de la glace 8. </li><li> Utiliser 0,5% en poids de solution de tubuline (50 pi) et la guanosine-5&#39; - [(α, β) -methyleno] triphosphate (GpCpp) (5 pi) pour préparer une solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul). Incuber à 37 ° C pendant 3 h pour obtenir un noyau MT stable. NOTE: Le rôle de GpCpp est de soutenir la formation MT et de supprimer complètement la dépolymérisation de MT à la tubuline. </li><li> Mélanger la solution de tubuline 0,5% en poids (950 ul) et la solution de tubuline contenant GpCpp (50 ul) à ~ 25 ° C pendant 1 jour pour obtenir une solution stable de MT 0,5% en poids. </li></ol></li><li> Solution d&#39;ADN<ol><li> Préparer une solution d&#39;ADN de 0,5% en poids (1 ml) dans une solution tampon Tris-EDTA (Tris 10 mM, pH 8,0, 1 mM EDTA). </li></ol></li><li> Garder les à 25 ° C 0,5% en poids de solutions d&#39;échantillon de biopolymère pour l&#39;expérience de séchage. </li></ol> 3. Les expériences de séchage et d&#39;observation sous la lumière de polarisation croisée <ol><li> Solutions dans une cellule d&#39; un côté ouvert (figure 1A) <ol><li> Couper une feuille de silicium (voir Matériaux List) dans une forme appropriée d&#39;une épaisseur de 1 mm (dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm; la figure 1A). <ol><li> Assembler une cellule ouverte d&#39;un côté constitué d&#39;une entretoise de silicium à dimension intérieure de 15/05 mm, 1 mm, et ~ 20 mm et de deux lames de verre non modifiées (76 mm x 1 mm x 26 mm). Fixer les deux côtés de la cellule avec deux clips à l&#39;avance afin de maintenir la solution d&#39;échantillon de fuir. </li></ol></li><li> Lentement ajouter chacune de la solution de biopolymère à 0,5% en poids (100-300 ul) en utilisant une taille de pores de ~ 1 mm pipettete pointe à chaque cellule à ~ 25 ° C. Éliminer les bulles d&#39;air à partir des cellules en utilisant une aiguille de seringue. </li><li> Placer les cellules dans un four avec une circulation d&#39;air à 60 ° C sous pression atmosphérique pour l&#39;évaporation; la direction d&#39;évaporation est opposée à celle de la gravité. </li></ol></li><li> Observations sous une lumière à polarisation croisée (figure 1B-1C) <ol><li> Fournir de la lumière directement visible par l&#39;intermédiaire d&#39;une lampe halogène de 100 W avec une source de lumière de surface plane sur une grande surface (80 mm x 80 mm). Ajuster les polariseurs à 45 ° et 135 ° à l&#39; aide des supports (Figure 1C). </li><li> Fixer les positions de la source de lumière, des polariseurs, l&#39; étape d&#39;échantillonnage, et la caméra à l&#39; aide d&#39; un rail supports optiques et de tige (figure 1c). Placez la scène de l&#39;échantillon entre les deux polariseurs (la distance entre les polariseurs doit être ~ 5 cm). Placez l&#39;appareil photo ~ 20 cm de la scène de l&#39;échantillon pour permettre mise au point. </li><li> A certains moments, placez les échantillons de l&#39;étape 3.1.3 entre le polarizers sur la scène parallèle au plan XZ et couvrir l&#39;appareil avec un rideau noir; le dispositif proprement dit est représenté sur la figure 1C. </li><li> Photographier les échantillons à travers des polariseurs croisés linéaires en utilisant un appareil photo reflex mono-objectif numérique avec un objectif zoom standard (voir Matériaux List). Contrôlez les réglages de l&#39;appareil, comme la distance focale, en utilisant un logiciel informatique (voir la liste des matériaux). </li></ol></li><li> Analyse spatio-temporelle de l&#39;intensité lumineuse transmise (Figure 1C) <ol><li> Pour évaluer le changement du paramètre d&#39;ordre dans le processus orientationnel de séchage, de recueillir des photos toutes les heures pendant 24 h. </li><li> Mesurer l&#39;intensité de la lumière transmise le long de la ligne centrale dans la direction Z en tant que valeur de gris en utilisant un programme de traitement d&#39;image (par exemple, ImageJ). </li><li> Tracer la courbe de la valeur de gris en fonction de la distance de la face supérieure ouverte. </li></ol></li><li> Les observations microscopiques de moins ligh polarisation croiséet (Figure 1D) <ol><li> Pour vérifier les méthodes, faire des observations microscopiques avec un microscope de polarisation équipé d&#39;une caméra CCD 9. Maintenir une première plaque de retard ordre dans le trajet lumineux. Contrôler les conditions pour les photos à l&#39;aide d&#39;un logiciel PC. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Flemming, H. -C., Wingender, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20676145">The biofilm matrix.</a> Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOsada%2C+Y+%22Hydrogels+of+cytoskeletal+proteins%22">Hydrogels of cytoskeletal proteins</a>. , Springer. (2016).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440, 297-302 (2006).</li>
<li>Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milliscale+self-integration+of+megamolecule+biopolymers+on+a+drying+gas-aqueous+liquid+crystalline+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).</li>
<li>De Gennes, P. G., Prost, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22The+physics+of+liquid+crystals%22">The physics of liquid crystals</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).</li>
<li>De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22Capillarity+and+wetting+phenomena%3A+drops%2C+bubbles%2C+pearls%2C+waves%22">Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma802829x">Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations.</a> Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).</li>
<li>Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/%E2%80%8Btb/c3tb21242d">Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).</li>
<li>Olympus. Support BX51P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/">http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/</a> (2016).</li>
<li>Matsuo, E. S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.455115">Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels.</a> J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).</li>
<li>Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/RA/C5RA18585H">Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules.</a> RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).</li>
<li>Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+diffusion+and+swelling+in+megamolecular+polysaccharide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels.</a> Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Il était parfois difficile pour la caméra de se concentrer sur l&#39;échantillon en raison de l&#39;intensité lumineuse transmise étant trop faible. Dans de tels cas, en plaçant un film de matière plastique transparente étendue sur la scène a aidé à organiser la mise au point. La limitation de la résolution observable dépendait de l&#39;objectif de la caméra, ~ 10 um dans ce cas. La limite observable de l&#39;épaisseur de l&#39;échantillon, Ay, est fonction de l&#39;intensité lumineuse maximale de la lampe, ~ 10 mm dans...

En se concentrant sur les structures rigides, en forme de tige de biopolymères, matériaux souples dynamiques ont été utilisées pour diverses applications, y compris les matrices de biofilm de polysaccharide 1, « gels actifs » composés de protéines du cytosquelette 2 et « ADN origami » des formes souhaitées 3. Pour clarifier les propriétés structurelles, de nombreuses stratégies ont été explorées, telles que microscopie électronique à transmission, microscopie électronique à balayage, microscopie à force atomique et la microscopie à fluorescence confocale. Cependant, ces méthodes sont principalement effectuées dans un état statique ou séché, il est difficile d&#39;expliquer les comportements dynamiques dans les échelles macroscopiques, comme on le voit dans les systèmes vivants réels. Récemment, nous avons observé avec succès le comportement dynamique de biopolymères sur l&#39;interface air-LC aqueuse à travers une lumière polarisée 4. Au cours de la visualisation de la structure orientée pendant le séchage du biopolymèresolution, les changements temporels indiqués auto-intégration de biopolymères sur l&#39;interface air-LC instable. Ici, nous décrivons un protocole pour le séchage des solutions LC biopolymères à l&#39;interface air-LC en utilisant des instruments polarisés. Par opposition à d&#39; autres analyses de la phase à cristaux liquides qui ne tient pas compte de séchage 5, 6, la dynamique LC au cours du processus de séchage ont été étudiés ici en évaluant le paramètre d&#39;ordre d&#39; orientation dans la vue latérale de la phase fluide dans une cellule ouverte d&#39; un côté . La combinaison de l&#39;évaporation de la cellule et l&#39;utilisation d&#39;instruments à polarisation autorisées pour la surveillance macroscopique avec une direction d&#39;évaporation contrôlée. De plus, il est possible de valider les dossiers de séchage en mettant l&#39; accent sur les structures cristallines des microdomaines adsorbées, qui ont été affectées par le poids moléculaire, la concentration, etc. Pour démontrer l&#39;efficacité de la méthode, le pro de séchagecessus de biopolymères de base avec des formes de tiges rigides, telles que des polysaccharides, des microtubules (MT), et de l&#39;ADN, ont été étudiés. Nous avons choisi ces biopolymères parce qu&#39;ils sont des exemples typiques de macromolécules hiérarchiques avec des poids megamolecular, et leurs interactions intermoléculaires leur permettent de former des états LC.

<table><tbody><tr><td>sacran</td><td>Green Science Materials Inc., Japon</td><td></td><td>De Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 & times ; 107 g mol-1</td></tr><tr><td>gum xanthane</td><td>Taiyo Kagaku Co., Japon</td><td>Neosoft XC</td><td>De Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 &times ; 106 g mol-1</td></tr><tr><td>tubuline</td><td>Cytoskeleton, Inc., États-Unis</td><td>T240</td><td>Du cerveau porcin.</td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience, Allemagne</td><td>NU405L</td><td></td></tr><tr><td>pipérazine-N,N&prime ; -bis(2-éthanesulfonique)</td><td>Sigma-Aldrichi, Co. LLC.</td><td>P6757-500G</td><td>TUYAUX</td></tr><tr><td>éthylène glycol-bis(&beta ;-aminoéthyl éther)-N,N',N'-acide tétraacétique</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>342-01314</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-15055</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>162-21813</td><td>granule</td></tr><tr><td>d’ADN</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>D1626</td><td>D’après les testicules de saumon. Mw = 1,3 & times ; 106 Da (~2 000 pb)</td></tr><tr><td>Solution tampon Tris-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>T9285-100ML</td><td>10 mM Tris, pH 8,0, avec 1 mM</td></tr><tr><td>de verre à lame</td> EDTA <td>Matsunami Glass Ind., Ltd., Japon</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>feuille de caoutchouc de silicium</td><td>Asone Co.</td><td>6-611-32</td><td>Epaisseur : centrifugeuse de 1 mm</td></tr><tr><td></td><td>Beckman-Coulter, Inc.,</td><td>États-Unis Avanti J-25</td><td>équipée d’une source lumineuse à rotor JA-20</td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japon</td> Guide de lumière <td>LS-LHA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japon</td><td>GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)</td>Lampe halogène <td>80 mm & times ; 80 mm</td></tr><tr><td></td><td>Ushio Inc., Japon</td><td>JCR 15V150WBN</td><td></td></tr><tr><td>titulaire</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td>Étage d’échantillonnage <td>KMH-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Porte-échantillon TARW-25503L</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Tige SHA-25RO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>ROU-12-40</td><td></td></tr><tr><td>porte-tenons</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Support de poteaux RS-6-40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Support de poteaux RS-12-60</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Porte-poteaux RS-12-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Transporteur RS-12-130</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Support d’appareil photo CAA-25LS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co.,Ltd.</td><td>CMH-2</td><td></td></tr><tr><td>rail optique moyen</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>OBA-500SH</td><td></td></tr><tr><td>Lenstube</td><td>Tomytech, Tube d’objectif BORG</td><td>BK</td><td>80&phi ;, L25 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td>tube d’objectif</td><td>Tomytech, tube d’objectif BORG</td><td>BK</td><td>80&phi ;, L50 mm&nbsp ;</td></tr><tr><td></td><td>multibande Tomytech, BORG</td><td></td><td>80&phi ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque en V</td><td>Tomytech, BORG</td><td>Plaque en V 60S</td><td></td></tr><tr><td>porte-plaque</td><td>Viexen, Co., Ltd.</td><td>porte-plaque SX</td><td></td></tr><tr><td>EOS Kiss X7i&nbsp ;</td><td>Canon Inc., Japon</td><td>8594B001</td><td>avec un objectif zoom standard,&nbsp ; Logiciel photographique EFP 18-55 mm</td></tr><tr><td></td><td>Canon Inc., Japon</td><td>EOS Utility</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Microsoft</td> Microscope polarisant <td>de surface</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Plaque de retard de premier ordre</td><td>Olympus</td><td>U-TP530</td><td>&lambda ; = 530 nm</td></tr><tr><td>Appareil photo CCD</td><td>Olympus</td><td>DP80</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel photographique</td><td>Olympus</td><td>cellSens Standard</td><td></td></tr><tr><td>Programme de traitement d’images basé sur Java</td><td>des National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes pour l&#39;auto-intégration de megamolecular biopolymères sur le séchage à l&#39;air-lc interface

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Les organismes vivants qui utilisent de l&#39;eau sont toujours sujettes à sécher dans l&#39;environnement. Leurs activités sont caractérisées par des structures macro-micro et à base de biopolymères, comme on le voit dans le cas de l&#39;eau en mouvement dans les faisceaux vasculaires et de l&#39;eau dans l&#39;hydratation des couches de la peau. Dans cette étude, nous avons développé un procédé pour évaluer l&#39;effet des solutions à cristaux liquides aqueux (LC) composées de biopolymères sur le séchage. Comme LC biopolymères ont un poids megamolecular, nous avons choisi d&#39;étudier les polysaccharides, les protéines du cytosquelette, et l&#39;ADN. L&#39;observation des solutions de biopolymère au cours du séchage sous lumière polarisée révèle auto-intégration milliscale à partir de l&#39;interface air-LC instable. La dynamique des solutions aqueuses de biopolymères LC peuvent être contrôlées par évaporation de l&#39;eau à partir d&#39;une cellule d&#39;un côté ouvert. En analysant les images prises en utilisant une lumière à polarisation croisée, il est possible de reconnaître les changements spatio-temporels dans le paramètre d&#39;ordre d&#39; orientation. Ceméthode peut être utile pour la caractérisation non seulement des matériaux artificiels dans divers domaines, mais aussi les tissus vivants naturels. Nous croyons qu&#39;il fournira une méthode d&#39;évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.

<html> Utilisation du dispositif tel que représenté sur la figure 1, l&#39;auto-intégration de microdomaines à macrodomain sur une interface air-LC séchage a été évaluée (Figure 2A). Comme la première démonstration de l&#39;expérience de séchage, deux types de polysaccharides megamolecular, Sacran (M w = 1,9 x 10 7 g mol -1) et la gomme de xanthane (4,7 x 10 6 g mol -1), ont été comparés. La ...

Procédé pour l&#39;auto-intégration de séchage induite par des biopolymères megamolecular sur l&#39;interface air-liquide cristallin est fournie ici. Cette méthodologie sera utile non seulement pour comprendre les potentiels macroscopiques de biopolymères, mais aussi comme une méthode d&#39;évaluation des matériaux souples dans les domaines biomédical et environnemental.

Méthodes pour l&#39;auto-intégration de Megamolecular biopolymères sur le séchage à l&#39;air-LC Interface

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

L'objectif général de cette expérience est d'évaluer l'effet de l'interface entre l'air de séchage et le cristal liquide, ou interface air-CL, sur l'orientation de biopolymères macromoléculaires tels que les polysaccharides, les microtubules et l'ADN, observés à travers leurs comportements dynamiques à l'échelle du millimètre. Ce protocole peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des structures dispersives, notamment concernant l'auto-organisation des biopolymères dans un environnement de séchage, tel qu'il s'est produit lorsque les organismes vivants ont colonisé les terres il y a environ 500 millions d'années. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité d'obtenir des vues latérales de l'échantillon durant le processus de séchage, sans que celui-ci n'ait lieu sur un plan horizontal.Pour commencer cette procédure, ajoutez 0,5 gramme de sacran à 100 millilitres d'eau. Couvrez le récipient avec un film plastique et mélangez la solution à environ 80 degrés Celsius pendant plus de 12 heures. Après avoir laissé refroidir les solutions de sacran et de gomme xanthane, centrifugez la solution de sacran pour éliminer les impuretés.Préparez maintenan

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