L'induction d'une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler avec succès des hépatocytes murins fonctionnels afin d'étudier l'expression et la sécrétion de cytokines inflammatoires telles que la CRP et l'IL6 en réponse à des médiateurs de la réponse hépatique aiguë. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés concernant la fonction hépatocytaire et la contribution des cytokines hépatiques à un environnement inflammatoire prolongé, tel qu'observé dans la maladie rénale chronique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit un outil robuste pour une analyse simple, rapide et reproductible du métabolome hépatique et de l'inflammation, ainsi que de la réponse aux médicaments.

Pour commencer, préchauffez le milieu de perfusion hépatique et le milieu de digestion hépatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Installez une pompe de perfusion comme indiqué ici. Ensuite, utilisez le milieu de perfusion hépatique pour remplir soigneusement à l’avance le système de tubulure de la pompe.

Essayez d'éviter toute bulle d'air dans le système. Préparez le microscope stéréotaxique pour la procédure de perfusion. Ensuite, après avoir anesthésié une souris donneuse conformément au protocole décrit, placez l'animal anesthésié sur un tampon absorbant.

Utilisez du ruban adhésif pour fixer les extrémités de la souris. Ensuite, rasez et désinfectez l'abdomen de la souris. Puis, utilisez des ciseaux chirurgicaux à pointes effilées mais émoussées pour réaliser une laparotomie ventrale, allant du pubis jusqu'à la limite crâniale du foie.

Inciser la paroi abdominale des deux côtés à une position caudale au diaphragme. Exposer la veine cave inférieure ou VCI en déplaçant soigneusement l'intestin vers le côté droit à l'aide de cotons-tiges stériles. À l'aide de ciseaux chirurgicaux fins à pointes très aiguës, pratiquer des incisions latérales à travers le diaphragme sus-hépatique et ouvrir la cavité thoracique.

Ensuite, utilisez du fil de soie chirurgical 5-0 pour ligaturer la VCI thoracique. À l’aide d’un cathéter intraveineux protégé, canulez la VCI infrarénale. Branchez la pompe de perfusion et commencez à perfuser le foie.

Si l'opération est effectuée correctement, le foie doit immédiatement commencer à blanchir et à gonfler. Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux fins, sectionner la veine porte afin de permettre un écoulement adéquat du sang et du milieu de perfusion. Après avoir perfusé le foie avec environ 30 millilitres de milieu de perfusion hépatique, arrêter la pompe de perfusion.

Passer au milieu de digestion hépatique et redémarrer la pompe. Une fois la perfusion terminée, retirer la canule. Exposer doucement la région centrale du foie et localiser le tissu conjonctif reliant les lobes hépatiques.

Saisir les fibres centrales de connexion et disséquer soigneusement tous les tissus maintenant le foie en place. Ensuite, retirer délicatement le foie. Transférer immédiatement l'organe dans un tube conique en polypropylène de 50 millilitres contenant 15 millilitres de milieu de digestion hépatique.

En travaillant sous une hotte de culture cellulaire, transférez le foie du tube conique en polypropylène de 50 millilitres vers une boîte de culture tissulaire stérile. À l’aide de pinces stériles, déchirez délicatement les quatre lobes du foie. Si l’opération est correctement réalisée, le milieu de digestion deviendra trouble en raison de l’isolement des hépatocytes à partir du foie.

À l’aide d’une pipette stérile de 25 millilitres, filtrer le milieu de digestion trouble à travers un tamis cellulaire en nylon de 70 micromètres dans un nouveau tube conique en polypropylène de 50 millilitres afin d’éliminer les particules de tissu non digérées et les débris cellulaires. Centrifuger le filtrat combiné à 50 × g à quatre degrés Celsius pendant deux minutes, puis aspirer le surnageant contenant les débris cellulaires en excès et utiliser 25 millilitres de milieu E de William’s 1X froid pour resuspendre délicatement les cellules. Après avoir répété trois fois la filtration et le lavage des hépatocytes, aspirer le surnageant pour éliminer les débris cellulaires en excès.

Ressuspendre les cellules dans 25 millilitres de milieu E de William 1X chaud contenant des suppléments de décongélation et d'ensemencement pour hépatocytes primaires, puis filtrer la suspension à l’aide d’un nouveau filtre en nylon de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres. Une fois le nombre de cellules déterminé, les ensemencer dans deux millilitres de milieu E de William contenant des suppléments de décongélation et d'ensemencement pour hépatocytes primaires, sur un cluster de culture cellulaire en six puits revêtu de collagène. Après deux changements de milieu afin de mettre finalement les cellules en privation, traiter les cellules avec du PBS comme véhicule, 25 nanogrammes par millilitre de FGF23, 100 microgrammes par millilitre de LPS ou 50 nanogrammes par millilitre d’IL6 dans un milieu sans sérum.

Incuber les cultures pendant 24 heures. Après avoir préparé l'ARN à l'aide d'un kit à colonne de centrifugation selon les instructions du fabricant, ajouter 200 nanogrammes d'ARN isolé dans un tube PCR. Ajouter ensuite 14 microlitres d'eau sans endonucléase et quatre microlitres de transcriptase inverse dans le tube.

Placer le tube PCR dans le thermocycleur et exécuter le programme de transcription inverse suivant pour générer de l'ADNc. Pour réaliser une PCR quantitative, combiner les composants du mélange maître QPCR suivants dans un tube placé sur de la glace. Vortexer le mélange maître.

Ensuite, aliquoter neuf microlitres de la solution dans chaque puits d'une plaque de 96 puits. Ajouter soigneusement un microlitre d'ADNc dans chaque puits, en préparant trois puits pour chaque échantillon. Enfin, analyser les échantillons dans un appareil de PCR en temps réel et interpréter les données conformément au protocole écrit.

Une image représentative obtenue par microscopie optique de cellules primaires isolées et cultivées est présentée ici. L'analyse immunocytochimique montre que les hépatocytes isolés expriment fortement l'albumine ainsi que le récepteur 4 du facteur de croissance des fibroblastes. Dans cette expérience, des hépatocytes primaires isolés ont été traités avec du FGF23, du LPS ou de l'IL6 pendant 24 heures, et les niveaux d'ARNm de la CRP et de l'IL6 ont été analysés par PCR quantitative en temps réel.

LPS, IL6 et FGF23 augmentent de manière significative l'expression de CRP et d'IL6. Comme illustré ici, les surnageants de culture de cellules de hépatocytes primaires isolés ont été analysés par ELISA pour déterminer les concentrations de CRP. Comme le montre l'analyse par QPCR, les traitements par LPS, IL6 et FGF23 augmentent de manière significative les niveaux de CRP dans les surnageants cellulaires par rapport aux cellules traitées au PBS.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en seulement quelques heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de maintenir un environnement stérile. Étant donné que l'on travaille avec des cultures primaires, minimiser le risque de contamination possible est primordial pour obtenir des résultats optimaux.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler avec succès des hépatocytes murins afin d'étudier diverses fonctions hépatocellulaires, telles que l'expression et la sécrétion de cytokines hépatiques.