Name: Linduction dune réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez l'isolation enzymatique d'hépatocytes primaires de souris pour étudier la réponse inflammatoire hépatique. Cette méthode permet d'analyser l'expression des cytokines CRP et IL6 par ELISA et PCR en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par le NIH (R01HL128714 à CF) et (F31DK10236101 à KS) et l&#39;American Heart Association (CF et AG).

Tous les protocoles des animaux et des procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de Miami Miller School of Medicine. 1. Préparation <ol><li> les médias et le foie de perfusion du foie Préchauffer digérer les médias dans un bain d&#39;eau à 37 ° C. </li><li> Mettre en place une pompe à perfusion (30 mL / min). pré-remplir soigneusement le système de tuyauterie de la pompe avec des milieux de perfusion du foie. Évitez les bulles d&#39;air dans le système et préparer le microscope stéréotaxique. </li><li> des boîtes de culture cellulaire de la couche en utilisant du collagène de type I selon le protocole du fabricant. </li></ol> 2. Liver Recovery <ol><li> Anesthésier la souris donneuse utilisant de l&#39; oxygène / l&#39; inhalation isoflurane (4% d&#39; isoflurane / 2 L / min d&#39;oxygène). <ol><li> Maintenir une anesthésie par l&#39;isoflurane à abaisser 2-2,5% ou par injection de kétamine (100 mg / kg de poids corporel par voie intraperitoneale) et de xylazine (10 mg / kg de poids corporel intraperitoneally). isoflurane continue est préférée car la kétamine abaisse la pression artérielle et peut provoquer une hépatotoxicité. </li></ol></li><li> Placez la souris anesthésiés sur un tampon absorbant. Fixer les extrémités de la souris avec du ruban adhésif. </li><li> Rasage et désinfecter l&#39;abdomen de la souris et effectuer une laparotomie ventrale du pubis à la frontière crânienne du foie en utilisant des ciseaux chirurgicaux avec des bouts pointus / contondants. Inciser la paroi abdominale, des deux côtés, caudale du diaphragme. </li><li> Exposer la veine cave inférieure (VCI) en déplaçant soigneusement l&#39;intestin vers le côté droit. Disséquer soigneusement les tissus adipeux autour de l&#39;IVC en utilisant des tampons de pointe de coton stériles et des pinces à pointe inclinées. </li><li> Inciser le diaphragme et ouvrir la sus-hépatique cavité thoracique par deux incisions latérales à l&#39;aide de ciseaux chirurgicaux fines avec des bouts pointus / tranchants. Ligaturer les IVC thoracique en utilisant la soie chirurgicale (5/0). </li><li> Cathétériser la VCI infrarénale utilisant un cathéter iv blindé, retirer délicatement l&#39;aiguille,raccorder la pompe à perfusion et commencer à perfuser le foie. Si effectué correctement, le foie doit immédiatement commencer à blanchir et houle. </li><li> Transect la veine permettant le drainage approprié du sang et perfusion des médias en utilisant des ciseaux chirurgicaux fines. </li><li> Perfuser le foie avec environ 30 ml de foie milieu de perfusion, puis passer au foie digérer les médias (30 ml). Éteignez la pompe à perfusion et retirer la canule une fois la perfusion est terminée. </li><li> exposer doucement la région centrale du foie et de localiser des tissus de liaison entre les lobes du foie. Prenez les fibres de liaison central et soigneusement disséquer tous les tissus qui retiennent le foie en place et retirez délicatement le foie. </li><li> transférer immédiatement le foie dans un tube conique de 50 ml en polypropylène contenant 15 ml de foie digérer les médias. NOTE: Il n&#39;y a pas de temps en ligne spécifique pour cette étape. Après perfusion du foie reste dans les milieux digérer pour le transport dans une hotte de culture cellulaire stérile. Tous subsequent étapes doivent être exécutées dans un environnement stérile. </li></ol> 3. Isolement et traitement des cellules <ol><li> À l&#39;intérieur d&#39;une hotte de culture cellulaire, le transfert du foie à partir du tube de 50 ml en polypropylène de forme conique contenant un milieu de digestion dans une boîte de culture tissulaire stérile. </li><li> En utilisant des pinces stériles, déchirer délicatement les quatre lobes du foie. Si effectué correctement, le milieu de digestion devrait devenir turbide en raison de l&#39;isolement des hépatocytes du foie. </li><li> En utilisant une pointe de pipette stérile de 25 ml, filtrer le milieu de digestion turbide à travers une cellule de nylon tamis de 70 um dans un nouveau tube conique de 50 ml en polypropylene pour éliminer les particules de tissu non digérés et les débris cellulaires. </li><li> Répéter les étapes 3.2 et 3.3 avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Cela aide à l&#39;élimination de tous les hépatocytes résiduels du foie. </li><li> Centrifugeuse à 50 g pendant 2 min à 4 ° C. Aspirer le surnageant contenant les débris cellulaires en excès et en douceur les cellules dans 25 ml 1x froid remettre en suspensionMedium E. Williams </li><li> En utilisant une pointe de pipette stérile 25 ml, filtrer la remise en suspension grâce à un nouveau 70 um cellule de nylon crépine dans un tube de 50 ml polypropylène conique pour obtenir une suspension plus propre. </li><li> Répétez les étapes 3.5 et 3.6 pour trois lavages supplémentaires à l&#39;aide de froid Medium E 1x &#39;Williams pour obtenir une suspension cellulaire plus claire. </li><li> Après l&#39;étape finale de lavage, aspirer le surnageant pour éliminer les débris cellulaires en excès. Re-suspendre les cellules de filtre dans 25 mL chaud Williams &#39;Media E 1x qui contient la décongélation des hépatocytes primaires et des suppléments de placage à travers un nouveau 70 um cellule de nylon crépine dans un tube de 50 ml polypropylène conique. </li><li> Compter les cellules au sein de la ml suspension cellulaire 25 en utilisant un hémocytomètre. En moyenne, attendre 15 - 20 millions de cellules par foie adulte. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant une coloration au bleu trypan. </li><li> cellules de plaques dans les médias E 1x de 2 mL de Williams qui contient la décongélation des hépatocytes primaires et des suppléments de placage sur un collagène enduit CE 6 puitscluster de culture ll (9 x 10 5 cellules par puits). </li><li> Après 4 h, changer de support aux médias E 1x Williams qui contient des suppléments d&#39;entretien d&#39;hépatocytes primaires. </li><li> Après 24 h, le sérum affamer les cellules avec un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) médias 1x pour 6 h. </li><li> Traiter les cellules avec du PBS en tant que véhicule, FGF23 (25 ng / mL), le LPS (100 pg / ml) ou IL-6 (50 ng / ml) dans du milieu exempt de sérum et on incube pendant 24 heures. </li></ol> 4. Isolement de l&#39;ARN <ol><li> Préparer l&#39;ARN en utilisant un kit de colonne spin du commerce, selon les instructions du fabricant. </li></ol> 5. Génération d&#39;ADNc à partir d&#39;ARN isolé par transcription inverse <ol><li> Ajouter 200 ng isolé échantillon d&#39;ARN à un tube PCR. </li><li> Ajouter 14 pi de libre-endonucléase de H 2 O PCR tube à partir de l&#39; étape 5.1. </li><li> Ajouter 4 pi de transcriptase inverse pour tube PCR de l&#39;étape 5.1. </li><li> Re-suspendre le contenu doucement pour faire mélange homogène; centrifuger doucement. </li&gt; <li> Placez le tube PCR contenant le mélange dans un thermocycleur. thermocycleur Run pour la transcription inverse: 1 cycle de 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) puis maintenez à 4 ° C. Le produit final sera l&#39;ADNc désiré. </li></ol> 6. Analyse des cellules par PCR quantitative en temps réel (qPCR) <ol><li> Préparer la plaque de 96 puits. <ol><li> Placez tous les composants de la réaction qPCR sur la glace: 1 ul d&#39;ADNc, .25 pM amorce avant, .25 uM amorce inverse, 5 pi SYBR Green, 3,5 pi PCR de qualité de l&#39;eau pour un volume total de 10 pi. Utilisation de SYBR Green, préparer master mix pour exécuter tous les échantillons en triple exemplaire. </li><li> Une fois que le mélange maître est terminée, vortex pour rendre homogène. Aliquoter 9 pi de qPCR mélange maître dans chaque puits d&#39;une plaque à 96 WLL. Par la suite, ajouter avec précaution 1 pi d&#39;ADNc dans chaque puits. Le volume total de réaction sera de 10 pi. </li><li> Après le chargement est terminé, sceller la plaque de 96 puits avec optiqueun film adhésif et plaque de 96 puits centrifuger brièvement (50 g pendant 1 min). </li></ol></li><li> Échantillons Run dans un instrument PCR en temps réel. Placez étanche plaque à 96 puits en instrument de PCR en temps réel et des échantillons gérés selon les recommandations du fabricant de l&#39; instrument. Des exemples de cycles standard et rapides sont incluses ci - dessous. <ol><li> Pour les paramètres de vélo standard, utilisez ce qui suit: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 120 s, puis 40 cycles de 94 ° C pendant 15 s, 60 ° C pendant 60 s, puis maintenez éventuellement à 4 ° C. </li><li> Pour les paramètres de cyclisme rapide: utiliser les éléments suivants: dénaturation initiale à 94 ° C pendant 30 s, puis 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s, 58 ° C pendant 15 s, puis 72 ° C pendant 10 s. </li></ol></li><li> Reportez-vous au manuel de l&#39;instrument pour des conseils sur la façon d&#39;analyser les données. </li></ol> 7. Analyse des cellules surnageants par ELISA Remarque: Toutes les étapes sont effectuées selon le protocole du fabricant. </p&gt; <ol><li> La préparation des échantillons <ol><li> Distribuer 398 ul de diluant dans des tubes séparés. Introduire à la pipette 2 ml de l&#39;échantillon de surnageant de cellules dans le tube de diluant 398 pi. Cela fournira un pli de dilution de 200. </li><li> Répétez l&#39;étape 7.1.1 pour chaque échantillon à tester. </li></ol></li><li> Procédure <ol><li> Pipeter 100 pi de 200 fois échantillon dilué et un standard dans les puits d&#39;une plaque de 96 puits. </li><li> Incuber la plaque à 96 puits à 25 ° C pendant 45 min sur un agitateur de microplaque à 150 tours par minute. </li><li> Laver les puits 5 fois avec une solution de tampon de lavage 1x. Une fois que le dernier lavage est terminé, enlever toute solution de lavage résiduelle avec du papier absorbant. </li><li> Ajouter 500 ul de réactif conjugué HRP dans chaque puits. </li><li> Répétez les étapes 7.2.2 - 7.2.3. </li><li> Pipeter 100 ul de tétraméthylbenzidine (TMB) réactif dans chaque puits de plaque de 96 puits. </li><li> Mélanger délicatement la plaque à 96 puits à 25 ° C pendant 20 min sur une microplaqueagitateur à 150 tours par minute. Arrêter la réaction en ajoutant directement 100 ul de solution d&#39;arrêt à chaque puits et mélanger doucement. Une fois la solution d&#39;arrêt est ajouté la couleur doit virer au jaune. Cela informe que la solution d&#39;arrêt a été correctement mélangé. </li><li> En utilisant un lecteur de microplaques, déterminer la densité optique à 450 nm dans les 5 premières minutes. </li></ol></li><li> Calcul des résultats <ol><li> Calculer une table de valeurs d&#39;absorbance moyenne (A 450) pour chaque échantillon et chaque norme. </li><li> Assembler une courbe standard en traçant la A 450 moyenne de chaque norme par rapport à sa concentration standard en ng / mL sur un graphique linéaire. Permettre à l&#39;axe des x pour représenter la concentration et l&#39;axe des ordonnées pour représenter A 450 valeurs. </li><li> L&#39; utilisation de la moyenne A 450 de l&#39;échantillon dilué, déterminer la concentration de la protéine désirée en ng / ml à partir de la courbe standard. </li><li> Multiplier la concentration de l&#39;échantillon par la dilution faitr. Ceci permettra la détermination de la concentration réelle de la protéine souhaitée dans l&#39;échantillon de surnageant cellulaire. </li><li> Tracer la table construite à partir d&#39;échantillons dans un graphique linéaire. Si OD 450 se situent en dehors de la courbe standard, les échantillons doivent être dilués de manière appropriée et re-testés. </li><li> Normaliser résultats 500.000 cellules. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs ne sont pas de conflit d&#39;intérêts à déclarer.

Isoler hépatocytes primaires de souris est un outil rapide, peu coûteux et fiable pour étudier les réponses inflammatoires ex vivo. Si effectué correctement, les résultats peuvent être facilement générés et reproduits en temps opportun et rentable. Les points suivants doivent être évalués avec soin afin d&#39;assurer une isolation efficace. L&#39;incision chirurgicale et de la canulation de la VCI doivent être effectuées sous anesthésie générale et non pas après l&#39;euthanasie. Un...

L&#39; insuffisance rénale chronique (CKD) peut être définie comme un état d&#39;inflammation aiguë et chronique 1. Chez les patients atteints de néphropathie chronique, les niveaux de l&#39;hormone de croissance des fibroblastes facteur phosphaturique 23 (FGF23) sériques augmentent progressivement afin de maintenir l&#39; homéostasie du phosphate sérique 2. Niveaux de FGF23 sérique accrus sont indépendamment associés à la morbidité et la mortalité cardiovasculaire chez les patients qui commencent un traitement d&#39;hémodialyse 3, 4. En outre, plusieurs études cliniques ont montré une forte corrélation entre les niveaux de FGF23 élevés et des niveaux de protéine C-réactive (CRP), l&#39; interleukine-6 (IL-6) et facteur de nécrose tumorale α (TNF) 5, 6 sérum. En outre, dans une étude expérimentale, nous avons récemment démontré que FGF23 peut cibler directement les hépatocytes et provoquer une réponse inflammatoire en augmentant la CRP et l&#39;IL-6 production dans le foie 7. Par conséquent, le FGF23 pourrait agir comme un facteur de circulation qui contribue à l&#39;inflammation systémique CKD. Dans les années 70, les hépatocytes primaires ont été isolées et étudiées pour la première fois 8. Depuis lors , les cellules hépatiques en culture primaire ont été largement utilisées pour étudier la transformation métabolique, de la fonction hormonale, le métabolisme des médicaments et de la toxicité, ainsi que l&#39; immunité et les réponses inflammatoires 9, 10. Protocoles précédents ont principalement décrit l&#39;isolement enzymatique des hépatocytes primaires à partir de tissus de foie humain 11, 12. Alors un excellent modèle, ce qui laisse la possibilité d&#39;étudier la façon dont la manipulation génétique affecte les mécanismes de signalisation hépatique complexes ainsi que des conséquences fonctionnelles sur différents types de stimuli. Dans ce qui suit, nous décrivons l&#39;isolement des hépatocytes primaires murins. Notamment, l&#39;effet de plusieurs médiateurs de la réponse de phase aiguë hépatique, comme le lipopolysaccharide (LPS), IL-6 et FGF23 peut être analysé d&#39;une manière facile, rapide et reproductible 13. Ici, nous présentons un protocole pour l&#39;isolement enzymatique des hépatocytes de souris adultes et nous démontrons que les inducteurs établies de l&#39;inflammation, tels que le LPS et l&#39;IL-6, ainsi que des médiateurs inflammatoires nouveaux tels que le FGF23, peuvent stimuler directement l&#39;expression et la sécrétion de les cytokines inflammatoires, telles que la CRP et IL-6 dans des hépatocytes cultivés.

<table><tbody><tr><td>Consommables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu ; m Passoire à cellules en nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique en polypropylène</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 Applicateurs à pointe de coton de 6 pouces.</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Seringue à insuline 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture tissulaire 100 x 20 mm Style</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 puits Culture cellulaire</td><td>Cluster Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Soie chirurgicale tressée noire (100 yards)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>EquipmentMinipuls</td> 3 Gilson F155007 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Kits, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer Cover Glasses, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux - Sharp/Blunt</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris-ToughCut droit</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Pince</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissus pour étudiants</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td><Nom>strong</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td>Acetic Acid Solution, 2.0 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N</td><td>Sigma</td><td>&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp ; &nbsp ; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1 000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>²nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 100 mg/mL</td><td>AnaSed injectable</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de Willams E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de perfusion hépatique (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de digestion hépatique (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Décongélation et placage des hépatocytes primaires Suppléments</td><td>Life Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Suppléments d’entretien des hépatocytes primaires Life</td><td>Technologies</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Collagène de type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induction d&#39;une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Le foie joue un rôle décisif dans la régulation de l&#39;inflammation systémique. Dans la maladie rénale chronique, en particulier, le foie réagit en réponse au milieu urémique, le stress oxydatif, l&#39;endotoxémie et la diminution de la clairance de la circulation cytokines pro-inflammatoires par la production d&#39;un grand nombre de réactifs de phase aiguë. inflammation des outils expérimentaux pour étudier et le rôle sous-jacent des hépatocytes sont cruciales pour comprendre la régulation et la contribution des cytokines hépatiques à une réponse en phase aiguë systémique et un scénario pro-inflammatoire prolongée, en particulier dans un cadre complexe comme la maladie rénale chronique. Depuis l&#39; étude des mécanismes complexes de l&#39; inflammation in vivo reste difficile, de ressources et nécessite généralement l&#39;utilisation d&#39;animaux transgéniques, les hépatocytes isolés primaires constituent un outil robuste pour acquérir des connaissances mécanistes dans la réponse de phase aiguë hépatique. Cette technique in vitro comporte des coûts modérés, élevés reproductibilité et de la connaissance technique commune, hépatocytes isolés primaires peuvent également être facilement utilisé comme une approche de dépistage. Ici, nous décrivons une méthode enzymatique basée à isoler les hépatocytes primaires de souris, et on décrit l&#39;évaluation d&#39;une réponse inflammatoire dans ces cellules en utilisant la méthode ELISA et la PCR quantitative en temps réel.

Histologie Représentatifs des images de microscopie de lumière de cellules isolées et cultivées primaires sont représentées sur la figure 1A. Analyse immunocytochimique démontre que des hépatocytes isolés expriment fortement l&#39;albumine (rouge) ainsi que des récepteurs de croissance des fibroblastes facteur 4 (FGFR4) (vert). Les noyaux sont colorés avec 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (bleu). <stron...

Ici, nous montrons une approche enzymatique pour isoler des hépatocytes primaires de souris adultes, et nous décrivons la quantification d&#39;une réponse inflammatoire par ELISA et la PCR en temps réel.

L&#39;induction d&#39;une réponse inflammatoire dans les cultures hépatocytes primaires de souris

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler avec succès des hépatocytes murins fonctionnels afin d'étudier l'expression et la sécrétion de cytokines inflammatoires telles que la CRP et l'IL6 en réponse à des médiateurs de la réponse hépatique aiguë. Cette méthode pourrait aider à répondre à des questions clés concernant la fonction hépatocytaire et la contribution des cytokines hépatiques à un environnement inflammatoire prolongé, tel qu'observé dans la maladie rénale chronique. Le principal avantage de cette technique est qu'elle fournit un outil robuste pour une analyse simple, rapide et reproductible du métabolome hépatique et de l'inflammation, ainsi que de la réponse aux médicaments.Pour commencer, préchauffez le milieu de perfusion hépatique et le milieu de digestion hépatique dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Installez une pompe de perfusion comme indiqué ici. Ensuite, utilisez le milieu de perfusion hépatique pour remplir soigneusement à l’avance le système de tubulure de la pompe.Essayez d'éviter toute bulle d'air dans le système. Préparez le microscope stéréotaxique pour la procédure de perfusion. Ensuite, après avoir anesthésié une souris donneuse conforméme

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Cette vidéo montre comment provoquer hypophysite auto-immunes chez la souris SJL et comment évaluer sa gravité par histopathologie.

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Découvrez l'isolation enzymatique d'hépatocytes primaires de souris pour étudier la réponse inflammatoire hépatique. Cette méthode permet d'analyser l'expression des cytokines CRP et IL6 par ELISA et PCR en temps réel.

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