Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

L’objectif global de cette expérience est d’explorer les voies biochimiques qui sont activées en réponse à la tension à l’aide de microbilles magnétiques enrobées de ligand et d’une application forcée sur des récepteurs d’adhésion. Cette méthode peut aider à répondre à des questions dans le domaine des transactions mécaniques, telles que la façon dont la tension mécanique de l’hélométrie express les oriente de la différenciation ou comment la compliance tissulaire entraîne leur transformation. Le principal avantage de cette technique est que de nombreuses cellules peuvent être stimulées pour l’analyse chimique en utilisant des billes pour appliquer une tension sur un sous-ensemble spécifique de récepteurs d’adhésion.

Pour commencer, remettez soigneusement en suspension les billes super paramagnétiques tosylactivées dans le flacon d’origine en faisant un vortex pendant au moins 30 secondes. Aliquote 40 microlitres des billes superparamagnétiques remises en suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant un millilitre de phosphate de sodium de 0,1 molaire pH 7,4. Ensuite, placez le tube sur un support de séparation magnétique pour séparer les billes magnétiques de la solution.

Jetez le surnageant et retirez le tube du support de séparation magnétique. Remettez les billes en suspension dans un millilitre de phosphate de sodium de 0,1 molaire pH 7,4. Après avoir lavé les billes deux fois, remettez les billes en suspension dans un millilitre du même tampon.

Ensuite, combinez 100 microgrammes de fibronectine bovine ou de tout autre ligand du récepteur d’adhésion cellulaire aux billes et au vortex. Répétez cette étape en remplaçant le ligand par de la BSA, de la poly-D-lysine ou de l’apotransferrine pour les contrôles négatifs. Incuber les billes avec la solution contenant le ligand pendant 12 à 24 heures à 37 degrés Celsius sur un rotor.

Si des agrégats de billes apparaissent après que la réaction s’est produite, sonicate pendant 10 à 20 secondes au maximum. Ensuite, isolez les billes à l’aide d’un socle de séparation magnétique et aspirez la solution restante. Ajoutez ensuite un millilitre d’une solution de PBS complétée par 0,2 % d’albumen sérique bovin.

Incuber pendant une heure sur un rotor à 37 degrés Celsius. À l’aide d’un aimant, lavez deux fois les billes avec un millilitre de solution de PBS complété par 0,2 % d’albumen sérique bovin. Avant de les remettre en suspension dans un millilitre du même tampon.

Soniquez les billes si les agrégats n’apparaissent pas pendant plus de 20 à 30 secondes. Procédez aux analyses cellulaires ou stockez les billes à quatre degrés Celsius jusqu’à un mois. Cultivez des cellules adhérentes sur une boîte de culture tissulaire de 60 millilitres dans un milieu de croissance approprié jusqu’à ce que la confluence atteigne 80 %.

Après avoir granulé les billes enrobées de ligand, remettre en suspension la pastille dans un millilitre de solution PBS complétée par 0,2 % d’albumen sérique bovin. Ajouter 100 microlitres de solution de billes enrobées de ligand à cinq millilitres de milieu de culture chaud et de vortex. Ensuite, aspirez le milieu dans une boîte de culture de 60 millilitres et ajoutez cinq millilitres de milieu de croissance chaud complété par des billes.

Incuber la suspension pendant 20 minutes dans des conditions de culture cellulaire pour permettre aux billes de sédimenter et d’adhérer aux cellules. Il est crucial de ne pas dépasser 20 minutes, car les billes peuvent être internalisées par phagocytose. Ensuite, observez les billes au microscope optique à l’aide d’un objectif 10X ou 20X.

Vérifiez l’adhérence des billes en secouant légèrement le plat pour faire la distinction entre les perles attachées et les perles flottantes. Placez un aimant rond en néodyme de 38 millimètres sur la face supérieure d’un couvercle de plat de culture normal de 60 millimètres et maintenez-le en place à l’aide de deux aimants en néodyme plus petits de 13 millimètres positionnés sur la face inférieure du couvercle. Incuber les cellules soumises à la tension pendant les points temporels et les conditions de culture cellulaire souhaités.

Remplacez le couvercle du plat normal par un couvercle avec l’aimant. Comme les aimants sont très puissants, manipulez-les avec soin. Après le traitement, placez le plat sur de la glace et aspirez soigneusement tout le milieu du plat.

Ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse cellulaire et incubez pendant 10 minutes sur de la glace. Ensuite, collectez le lysat à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférez-le dans un tube de microcentrifugation pré-refroidi de 1,5 millilitre. Granulez les billes magnétiques à l’aide du support de séparation magnétique et transférez le lysat cellulaire total dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pré-refroidi.

Prélever une aliquote de 15 microlitres du lysat cellulaire total obtenu après séparation des billes pour l’analyse par transfert Western. Lavez les billes trois fois avec un millilitre de tampon de lyse glacée. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tampon d’échantillon à la pastille de bille.

Après avoir mélangé la suspension par vortex, faites-la bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes à l’aide d’un chauffe-bloc sec. Cette fraction contient les complexes d’adhésion isolés. Procédez à l’analyse biochimique ou conservez la fraction à moins 20 degrés Celsius.

Cette figure est montrée pour démontrer la purification des complexes d’adhésion. L’immunoblot GAPDH est utilisé comme contrôle de charge pour le lysat cellulaire total et pour vérifier la pureté des complexes d’adhésion. Une longue exposition a été utilisée pour valider l’absence de signal cytoplasmique dans la fraction du complexe d’adhésion purifiée.

Des billes enrobées de fibronectine ont été utilisées pour étudier les processus de mécano-transduction qui se produisent au fil du temps au niveau des complexes d’adhésion en réponse à la tension. Après séparation magnétique de la fraction du complexe d’adhésion, le lysat et la fraction du complexe d’adhésion ont été analysés par western blot. Le contrôle de charge et les candidats connus pour être recrutés ou phosphorylés au niveau des complexes d’adhésion en réponse à la tension mécanique ont été immunoblottés.

Bien que la tension n’ait pas affecté le recrutement de la paxilline dans les complexes d’adhésion, sa phosphorylation sur la tyrosine 31 a été augmentée en réponse à la tension mécanique à la fois dans le lysat cellulaire total et dans la fraction du complexe d’adhésion. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’appliquer des forces de tension aux protéines de surface d’adhésion à l’aide de billes magnétiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est exécutée correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’être prudent avec les aimants puissants. À la suite de cette procédure, des études biochimiques telles que les western blots, le test de polymérisation de l’actine ou le test enzymatique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que si l’activité kinase est régulée par la tension. Cette technique pourrait aider les chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire à explorer les voies de signalisation sensibles au magnétisme dans les cellules.