Reconstitution de nucléosomes avec histones soeurs Différentiellement Isotope marqués

L'objectif général de ce protocole biochimique est de produire des nucléosomes dotés d'histones sœurs marquées de façon différentielle par des isotopes, afin de cartographier simultanément les réactions de modification post-traductionnelle sur les deux histones sœurs. L'objectif global de ce protocole biochimique est de générer des nucléosomes avec des histones sœurs marquées par des isotopes différemment, pour être utilisés dans le cartographage simultané des modifications post-traductionnelles sur les deux histones sœurs.

Cette méthode, combinée à des techniques de haute résolution permettant de cartographier les modifications post-traductionnelles telles que la spectrométrie de masse, permet de répondre à des questions essentielles en biologie de la chromatine, comme quelles mécanismes contribuent à la formation de nucléosomes symétriquement modifiés ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être facilement mise en place dans un laboratoire de biochimie, car elle associe des protocoles standard de reconstitution de nucléosomes à des méthodologies courantes de purification des protéines. Deux pools d'histone H3 seront utilisés pour la reconstitution de l'octamère.

De l'H3 marquée à l'azote 15 contenant une étiquette polyhistidine au niveau du terminus aminé, et de l'H3 marquée au carbone 13 contenant une étiquette d'affinité streptavidine au niveau du terminus aminé. Commencez cette procédure en dissolvant les aliquotes de l'histone lyophilisées, y compris les deux types d'histone H3, dans le tampon de dépliage. Ajoutez un millilitre de tampon de dépliage à chaque tube contenant environ cinq milligrammes d'histones, puis mélangez à l'aide d'une pipette, sans effectuer de vortex.

Gardez les tubes sur de la glace pendant 30 minutes afin de permettre un déroulement complet. Ensuite, mesurez l'absorbance à 280 nanomètres pour déterminer la concentration exacte de chaque histone. Mélangez les histones centrales selon des rapports équimolaires, en veillant à inclure 50 % de chacun des deux lots d'histone H3.

Utilisez le tampon de dépliage pour ajuster la concentration finale en protéine à environ un milligramme par millilitre. Transférez le mélange dans une membrane de dialyse ayant un seuil de coupure de six kilodaltons. Effectuez ensuite une dialyse contre un à deux litres de tampon de repliage refroidi à quatre degrés Celsius.

Le jour suivant, récupérez le matériau dialysé et éliminez tout précipité par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à vitesse maximale. Après avoir déterminé la concentration en octamère, utilisez un filtre centrifuge avec une coupure de 10 kilodaltons pour concentrer l'octamère jusqu'à un volume final d'environ deux millilitres. Une concentration en octamère comprise entre 50 et 100 micromolaire doit être obtenue.

Préparez la filtration sur gel en raccordant la colonne de filtration sur gel à un système FPLC. Équilibrez avec deux volumes de colonne, ou CV, de tampon de repliement filtré à 0,22 micromètre et dégazé. Injectez le matériau concentré à un débit de un millilitre par minute et récupérez des fractions d’un à 1,5 millilitre.

Pour commencer cette procédure, regroupez les fractions pertinentes contenant des octamères purs et déterminez la concentration comme décrit précédemment. Connectez une colonne de nitrilotriacétate de nickel (nickel NTA) d'un millilitre au système FPLC. Équilibrez-la avec 10 CV de tampon de repliement filtré à 0,22 micromètre et dégazé, à un débit de un millilitre par minute.

Faire passer l'octamère purifié à travers la colonne de nickel NTA à un débit d'un millilitre par minute. Recueillir le flux sortant. Éluer avec 10 CV de tampon de repliement contenant 250 millimolaire d’imidazole, à un débit d'un millilitre par minute.

Récupérez l'élution au nickel NTA. La purification basée sur la streptavidine doit idéalement être effectuée dans une chambre froide. Équilibrez une colonne d'affinité de streptavidine commerciale d'un millilitre avec 10 volumes de colonne de tampon de repliement contenant de l'imidazole à 250 millimolaire, en utilisant un montage par gravité en mode discontinu.

Faites passer l'élution de la colonne à l'affinité du nickel NTA à travers la colonne d'affinité streptavidine. Récupérez le flux sortant. Élué avec 10 CV de tampon de repliement contenant 2,5 millimolaire de desthiobiotine.

Recueillir l'élution. Après avoir mesuré la concentration en octamère dans l'élution, ajouter une quantité dix fois moindre de protéase TEV et laisser la réaction se dérouler toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, transférer le mélange dans une membrane de dialyse ayant une coupure à 50 kilodaltons et effectuer une dialyse contre le tampon de repliement toute la nuit à quatre degrés Celsius.

Concentrez l'octamère asymétrique purifié à l'aide d'un dispositif de filtration centrifuge avec une coupure de 10 kilodaltons jusqu'à un volume d'un à deux millilitres. La concentration attendue de l'octamère est de 20 à 50 micromolaire. La reconstitution des nucléosomes nécessite de l'ADN contenant une séquence de positionnement des nucléosomes.

Ajuster la concentration en sel de l'ADN à deux molaire en chlorure de sodium à l'aide d'une solution mère de chlorure de sodium à cinq molaire. Mélanger l'ADN avec l'octamère et le tampon de repliement en utilisant le rapport optimal octamère/ADN déterminé lors d'un test à petite échelle. Ajouter l'octamère en dernier pour éviter tout risque de mélanger l'octamère et l'ADN à une concentration en sel inférieure à deux molaire.

Transférez le mélange dans une membrane de dialyse ayant un seuil de coupure de six kilodaltons et effectuez la dialyse contre un litre de tampon de repliement pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, réduisez de manière progressive la concentration en sel du tampon de dialyse. Conservez l'échantillon dans chaque tampon de chlorure de sodium pendant au moins trois heures.

Ensuite, transférez la membrane de dialyse dans un bécher contenant un litre de tampon d'essai et poursuivez la dialyse toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, récupérez l'échantillon dialysé. Éliminez tout précipité formé par centrifugation dans une microcentrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius à vitesse maximale.

Concentrer l'échantillon à l'aide d'un filtre centrifuge à coupure de 30 kilodaltons jusqu'à un volume final d'environ 300 microlitres. Mesurer la concentration en ADN à 260 nanomètres. La concentration finale doit se situer entre 10 et 20 micromolaire.

Conserver l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant plusieurs semaines au maximum. Un profil d'élution par filtration sur gel du mélange d'histones repliées montre que les octamères d'histones sont élués vers 70 millilitres. Un gel SDS-PAGE montre la stœchiométrie correcte des histones.

Le pool octamérique reconstitué, contenant les trois types d'octamères, est soumis à un schéma de purification par affinité en tandem. L'isolement des espèces asymétriques est vérifié par la présence de la marque d'affinité. Les marques d'affinité sont ensuite éliminées à l'aide de la protéase TEV.

Une reconstitution à petite échelle de nucléosomes à l'aide de différents rapports molaires ADN/octamère a montré qu'un rapport de un à un était optimal. Une reconstitution de nucléosomes à grande échelle a été réalisée en utilisant le rapport molaire optimisé ADN/octamère, et la stœchiométrie correcte des quatre histones centrales a été observée. La spectroscopie RMN de nucléosomes marqués différemment par des isotopes a confirmé la présence de sœurs histones H3 marquées à l'azote 15 et au carbone 13.

Dans cet exemple d'application, des nucléosomes marqués isotopiquement de manière différentielle et phosphorylés de façon asymétrique sur l'anneau C 10 de l'histone H3 ont été mis en réaction avec l'acétyltransférase GCN5. L'acétylation de la lysine 14 de l'histone H3 sur les deux copies de H3 a ensuite été suivie en temps réel par spectroscopie RMN. L'analyse a révélé que la phosphorylation de l'anneau C 10 de l'histone H3 stimule l'acétylation de la lysine 14 de l'histone H3 par GCN5 en *cis*, par rapport à l'effet en *trans*.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq jours si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment reconstituer des nucléosomes contenant des histones sœurs aux caractéristiques différentes.