Contrôlable Expression Ion canal par transfection transitoire inductible

L’objectif global de cette procédure est de fournir un moyen pratique de contrôler l’expression des canaux ioniques dans les systèmes hétérologues tout en évitant les complications de longue durée de la culture cellulaire. Fournissant ainsi un moyen de contrôler les conditions entre les expériences et de générer des résultats plus reproductibles. Cette méthode peut faciliter la recherche dans le domaine des canaux ioniques.

Comme la caractérisation des propriétés des canaux en pharmacologie. Étant donné que les méthodes actuelles sont soit complexes, soit présentent une expression incohérente des protéines. Le principal avantage de cette technique est que nous pouvons atteindre des niveaux d’expression contrôlés d’une grande variété de protéines adaptées à des expériences individuelles dans un délai relativement court.

Pour commencer cette procédure, transférez les cellules TREX 293 dans une plaque de 12 puits préparée avec 0,9 millilitre de DMEM complet par puits pour générer une confluence de 50 %. Et incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur à CO2. Ensuite, préparez un mélange de transfection composé de DMEM, le gène d’intérêt, montré ici, TRPV1, un plasmide inerte, et le réactif de transfection lipidique.

Pour les expériences électrophysiologiques, incluez EGFP dans le plasmide d’expression des mammifères dans le cocktail de transfection afin de visualiser les cellules qui subissent avec succès la transfection. Incuber le mélange de transfection à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, transfectez les cellules en pipetant le mélange de transfection goutte à goutte sur les cellules plaquées dans la plaque à 12 puits.

Secouez vigoureusement la plaque pour assurer une dispersion homogène de l’ADN et du réactif de transfection. Ensuite, incubez les cellules transfectées pendant la nuit à 27 degrés Celsius. Le lendemain matin, si vous effectuez une électrophysiologie, confirmez que les cellules ont été transfectées avec succès en observant le signal fluorescent de l’EGFP sous une lampe UV.

Si vous effectuez de l’électrophysiologie, transférez les cellules de la plaque à 12 puits vers des lamelles revêtues de PDL dans 500 microlitres de DMEM plein. Si vous effectuez une imagerie calcique, repérez environ 20 000 cellules dans des chambres d’imagerie calcique recouvertes de PDL. Dans cette procédure, préparez une solution mère de doxycycline à raison d’un milligramme par millilitre dans de l’eau doublement distillée.

Protégez la solution mère de la lumière à quatre degrés Celsius jusqu’à trois semaines. Pour un stockage à long terme, maintenez la solution mère de doxycycline à moins 20 degrés Celsius. Ensuite, préparez une solution fraîche de doxycycline dans du DMEM complet.

Et réchauffez-le à 37 degrés Celsius. Pour les enregistrements électrophysiologiques, pipetez 500 microlitres de solution de doxycycline à deux microgrammes par millilitre dans chaque puits pour obtenir une concentration finale de doxycycline à un microgramme par millilitre. Pour l’imagerie calcique, ajoutez 100 microlitres de solution de doxycycline à trois microgrammes par millilitre dans chaque puits pour obtenir une concentration finale de doxycycline à un microgramme par millilitre.

Incuber l’échantillon pendant la durée souhaitée pour l’induction à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2. Pour calibrer l’expression des protéines par imagerie calcique, préparez la solution de Ringer et réchauffez-la à 37 degrés Celsius. Pour aider à disperser les esters AM, un indicateur d’ions fluroescents, tel que Fura-2 dans les solutions aqueuses, prépare une solution de F-127 non ionique dans le DMSO.

Chauffez la solution à 27 degrés Celsius jusqu’à ce que le F-127 non ionique soit dissous. Conservez ensuite la solution non ionique de F-127 à température ambiante et réchauffez-la à nouveau à 37 degrés Celsius avant de l’utiliser. Après cela, préparez une solution de chargement de Fura-2 AM à partir de la solution de Ringer, complétée par deux à trois micromolaires de Fura-2 AM, 02 milligrammes par millilitre de F-127 non ionique et 10 millimolaires de D-glucose.

Ensuite, aspirez le milieu des cellules dans les chambres et remplacez-le par la solution de chargement Fura-2 AM. Incuber les cellules pendant 60 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Ensuite, aspirez la solution Fura-2 AM.

Et lavez les cellules avec une solution de Ringer et de D-glucose de 10 millimolaires pour éliminer le colorant extracellulaire. Laissez 200 microlitres de solution de Ringer’s et 10 millimolaires de D-glucose dans chacun. Et incubez-le pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Au bout de 30 minutes, placez la chambre sur la platine au-dessus de l’embout nasal du microscope et fixez-la avec un support. Ensuite, calculez et préparez une concentration de travail de capsaisine, un agoniste spécifique du TRPV1, en fonction de la concentration finale souhaitée. Ensuite, allumez la lampe, l’appareil photo et le microscope, puis sélectionnez le filtre Fura-2 pour détecter l’émission à une longueur d’onde de 510 nanomètres.

Ajustez le grossissement souhaité et faites la mise au point des cellules dans le champ sélectionné en manipulant ces paramètres à l’aide des boutons du microscope. Dans l’obscurité, soustrayez la lumière d’arrière-plan et réglez le temps d’exposition. Réglez l’échantillonnage d’images au taux souhaité.

Ensuite, commencez par enregistrer la réponse de fluorescence des cellules chargées de Fura-2 en les excitant à des longueurs d’onde de 340 nanomètres et 380 nanomètres. Le rapport entre 340 et 380 signaux est un indicateur de la concentration intracellulaire de calcium et donc aussi de l’activité TRPV1. Par la suite, ajoutez deux micromolaires de capsaïcine dans 200 microlitres de solution de Ringer pour créer une concentration finale saturante d’une micromolaire de capsaïcine afin d’évaluer le niveau d’expression de TRPV1 et d’analyser la réponse de TRPV1.

Pour déterminer le temps d’induction idéal pour l’enregistrement monocanal, préparez d’abord le bain et les solutions de pipette. Préparez ensuite des pipettes en verre, polies au feu à une résistance de 10 à 12 mégaohms. Effectuez une pince de patch de cellule entière en créant un joint sur la membrane de la cellule ciblée.

Par la suite, réglez le potentiel de maintien à moins 40 millivolts. Et rompre la membrane en appliquant une pression négative. Ensuite, à l’aide du micromanipulateur, soulevez la pipette avec le patch de mébrane pour l’éloigner de la cellule.

Positionnez ensuite le système de profusion directement à côté de la pipette contenant le patch membranaire. Réduisez le filtre de Bessel et le gain de sortie à deux à cinq killahurtz et 10 ampères respectivement. Ensuite, abondez les concentrations saturantes d’agoniste sur le patch membranaire.

Analysez ensuite le nombre de patchs monocanal enregistrés avec succès par rapport au temps d’induction appliqué aux cellules et ajustez le temps d’induction en fonction des résultats souhaités. Voici les images pseudo-colorées des cellules TREX 293 exprimant transitoirement RTRPV1, avant et après l’application de capsaïcine. Et voici les changements correspondants des niveaux de calcium intracellulaire avec le temps dans les cellules TREX 293 traitées et transfectées.

Chaque graphique représente en moyenne 50 cellules. Le taux de réussite du patch monocanal dans les enregistrements TRPV1 dépend du temps d’induction. Voici les traces actuelles de patchs de cellules TREX 293 exprimant transitoirement le RTRPV1 après deux heures et quatre heures d’induction.

Et ce graphique décrit le nombre de canaux dans un patch après le temps d’induction indiqué. Cette technique peut nous donner l’analyse d’une protéine à expression contrôlée dans les 12 heures suivant la transfection si elle est effectuée correctement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler de normaliser les concentrations de transfection et le temps d’induction pour différentes protéines.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un système d’expression contrôlable de manière efficace pour l’ion de votre choix.