Analyse des Lymphocytes extravasation L'utilisation d'un In vitro Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

L’objectif global de cet essai de transmigration est d’étudier in vitro l’extravasation des lymphocytes dans le système nerveux central. Cette méthode peut contribuer à approfondir notre compréhension des maladies inflammatoires du système nerveux central et à développer de nouvelles approches thérapeutiques. Certains avantages de cette technique sont qu’elle est facilement accessible et qu’elle permet d’analyser des populations de lymphocytes rares au niveau d’une seule cellule.

Cette méthode peut fournir des informations sur la transmigration des lymphocytes à travers la barrière hémato-encéphalique et peut être appliquée à l’étude de la transmigration à travers la barrière hémato-céphalo-rachidienne. De plus, une analyse de la perméation du bleu d’Evans peut être effectuée pour évaluer l’intégrité du modèle de barrière hémato-encéphalique. Commencez par couvrir le fond d’un flacon de culture cellulaire T-25 avec deux millilitres de solution de fibronectine fraîchement préparée pour une incubation d’au moins trois heures dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

À la fin de l’incubation, remplacez la solution de fibronectine par 7,2 fois 10 à la quatrième cellule endothéliale microvasculaire du cerveau humain, ou HBMEC, dans six millilitres de milieu ECM-b complet, et retournez le flacon dans l’incubateur. Lorsque les HBMEC atteignent une confluence de 80 %, transférez le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres et lavez les cellules adhérentes trois fois avec cinq millilitres de PBS. Après le troisième lavage, ajoutez deux millilitres de solution d’Accutase préchauffée dans les cellules pendant deux minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, tapotez fermement le ballon à plusieurs reprises, en confirmant le détachement des cellules par microscopie optique. Lorsque les cellules commencent à se soulever du fond du ballon, utilisez le surnageant récolté pour rincer le ballon à plusieurs reprises jusqu’à ce que la majeure partie des HBMEC soit remise en suspension. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation, puis remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu ECM-b frais pour le comptage.

Pour préparer les inserts de culture cellulaire pour un test de transmigration, ajoutez d’abord 100 microlitres de solution de fibronectine dans chaque insert et dans un puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Après trois heures à 37 degrés Celsius, remplacez la solution de fibronectine par 100 microlitres de HBMEC et ajoutez 600 microlitres de milieu ECM-b frais dans les compartiments inférieurs des inserts de culture cellulaire. Remettez ensuite les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois à quatre jours.

Pour vérifier si l’intégrité de la barrière a été atteinte, aspirez le milieu à partir des compartiments inférieur et supérieur d’un insert de culture cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution Evans blue fraîchement préparée dans l’insert. Ajoutez 600 microlitres de PBS complété par de la B27 dans le compartiment inférieur et remettez la plaque dans l’incubateur. Après une heure, utilisez une pince pour retirer soigneusement l’insert et transférez 100 microlitres de PBS B27 du compartiment inférieur dans deux puits individuels d’une plaque à fond plat noir, en polystyrol et à 96 puits.

Chargez ensuite la plaque dans un lecteur de microplaques multimode et déterminez la position z optimale. Pour déterminer la fonction de barrière HBMEC, mesurez l’excitation de la solution de colorant bleu Evans à l’aide des paramètres appropriés, et comparez les données acquises à une courbe standard représentant la perméation du bleu Evans à travers le HBMEC à différents moments après l’ensemencement. Après avoir confirmé la formation de la monocouche cellulaire, remettre en suspension l’échantillon de cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, à une concentration de cinq fois 10 à six cellules par millilitre dans un milieu RPMI complété par de la B27.

Ensuite, aspirez le milieu à partir des compartiments inférieur et supérieur du nombre approprié d’inserts de culture cellulaire contenant les monocouches HBMEC confluentes, et ajoutez 100 microlitres de PBMC par donneur aux inserts de culture cellulaire et à un puits d’une plaque de 24 puits par témoin in vitro. Ajoutez 600 microlitres de RPMI plus B27 dans les compartiments inférieurs des inserts de culture cellulaire et 500 microlitres dans les puits de contrôle in vitro, et retournez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six heures. À la fin de l’incubation, utilisez une pince pour retirer les inserts de culture cellulaire, en rinçant soigneusement les fonds avec 400 microlitres de PBS sans toucher les membranes.

Ensuite, mélangez soigneusement 20 microlitres de fluorosphères Flow-Count avec les cellules dans les puits de contrôle expérimentaux et in vitro, et transférez un millilitre des suspensions PBMC résultantes dans les tubes de cytométrie en flux correspondants appropriés. Prélever les cellules par centrifugation et ajouter à chaque échantillon les anticorps conjugués au fluorochrome d’intérêt dans 100 microlitres de tampon de cytométrie en flux. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec 250 microlitres de tampon de cytométrie en flux frais et remettez les pastilles en suspension dans le volume de tampon de cytométrie en flux approprié pour l’analyse.

Lorsque toutes les données ont été acquises, ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Pour analyser la transmigration du sous-ensemble de cellules NK, sélectionnez d’abord les lymphocytes dans un graphique de canal de diffusion latéral par rapport à un canal de diffusion direct, puis affichez les cellules dans un graphique à points CD3 par rapport à CD56. Sélectionnez ensuite les cellules NK CD56 positives et CD3 négatives.

Pour distinguer les sous-ensembles de cellules NK transmigrées, affichez les cellules dans un tracé CD56 et CD16 et une porte pour les cellules CD56bright, CD16dim ou négatives, et CD56dim, CD16 positives. Sélectionnez ensuite les fluorosphères de comptage de débit à partir d’un graphique de dispersion avant ou latéral. Pour déterminer le nombre de billes, affichez les données sélectionnées dans un graphique d’un canal couvrant une longueur d’onde d’émission comprise entre 525 et 700 nanomètres en fonction du temps.

Enfin, déterminez le pourcentage de cellules NK migrées comme le rapport entre le nombre total de cellules migrées et le nombre total de cellules dans le contrôle in vitro. Après trois à quatre jours de culture, le HBMEC a exprimé la molécule de jonction serrée Zonula occludens-1 et s’est développé en monocouches qui présentent une résistance électrique transendothéliale et une perméation réduite du colorant bleu d’Evans. La stimulation de la monocouche de cellules endothéliales avec de l’interféron gamma et du TNF alpha pendant 24 heures avant un test complet de transmigration PBMC entraîne une migration accrue de toutes les populations de lymphocytes analysées.

Il est intéressant de noter que les cellules CD56bright, CD16dim ou NK négatives présentent une capacité migratoire plus élevée que les cellules CD56dim et CD16 positives dans les HBMEC non stimulés et activés par des cytokines. Bien que l’augmentation relative de la transmigration à travers une monocouche cellulaire enflammée soit plus élevée pour les cellules CD56dim dans leur ensemble, imitant les observations in vivo selon lesquelles les cellules NK CD56bright et CD16dim-négatives sont enrichies dans le compartiment intrathécal. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 heures.

Le prétraitement de la structure de transmigration in vitro avec de l’interféron gamma et du TNF alpha permet d’étudier la migration des lymphocytes dans des conditions inflammatoires. Notre protocole peut être modifié en appliquant des forces de cisaillement ou en co-cultivant avec d’autres cellules de la barrière hémato-encéphalique, comme les astrocytes, pour fournir un modèle raffiné de transmigration des lymphocytes dans le système nerveux central. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la transmigration des lymphocytes à l’aide d’un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine.