Name: Analyse des Lymphocytes extravasation Lutilisation dun In vitro Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Découvrez l'analyse de l'extravasation des lymphocytes à l'aide d'un modèle in vitro de la barrière hématoencéphalique humaine. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes des maladies inflammatoires du système nerveux central.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Cette étude a été financée par le Centre de recherche collaborative CRC TR128 « Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease » (Projet A9 à H.W. et C.C.G., Projet B1 à N.S.).

1. Culture cellulaire des cellules cérébrales microvasculaire endothéliales humaines (HBMEC) <ol><li> Revêtement des flacons de culture cellulaire <ol><li> Pour préparer la solution de fibronectine, ajouter 10 ml de PBS à un tube à centrifuger de 15 mL. Ajouter 150 pi fibronectine et bien mélanger. </li><li> Pour couvrir le fond d&#39;un flacon de culture de cellules T-25 ajouter 2 mL de la solution de fibronectine. Incuber le flacon de culture cellulaire pendant au moins 3 h à 37 ° C dans l&#39;incubateur. Des flacons revêtus de fibronectine peuvent être stockés pendant 2 semaines à 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li> Et Ensemencement culture cellulaire de HBMEC <ol><li> Aspirer la solution de fibronectine à partir du fond du flacon de culture de cellules. Ajouter 7,2 x 10 4 HBMEC / cm² en suspension dans 6 ml de milieu ECM-b (= ECM-B supplémenté avec 5% de sérum bovin fœtal, 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de supplément de croissance des cellules endothéliales). Incuber à 37 ° C / 5% CO 2. Vérifiez la croissance cellulaire à l&#39;aide quotidienne d&#39;un microscope. </li><li> Changer le support tous les 3 jours.Récolte ou fractionnement de cellules, lorsque HBMEC atteignent la confluence d&#39;environ 80%. HBMEC doit être utilisé entre le passage 1 et 15 pour éviter la perte des propriétés physiologiques. </li></ol></li><li> Récolte HBMEC. <ol><li> Préparer Accutase solution en mélangeant Accutase (1x) avec du PBS dans un rapport de 1: 1. Maintenir Accutase solution à 37 ° C dans un bain d&#39;eau jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li><li> Transfert moyen ECM-b de la fiole de culture de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL. Laver HBMEC par addition de 5 ml de PBS au fond du flacon de culture de cellules. Aspirer PBS et répéter l&#39;étape de lavage deux fois de plus. </li><li> Ajouter une solution préchauffée Accutase 2 ml. Incuber à 37 ° C pendant 2 min. Par la suite, HBMEC sont remis en suspension en appuyant fermement le flacon de culture cellulaire à plusieurs reprises. détachement des cellules est contrôlée à l&#39;aide d&#39;un microscope </li><li> L&#39;ECM-b-support précédemment stocké dans un tube de 15 ml est ajouté à nouveau dans le ballon de culture de cellules dès HBMEC commencent à se détacher. Rincer à plusieurs reprises le fond du flacon jusqu&#39;à ce que la plupart sont HBMECremis en suspension. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à un tube à centrifuger de 15 mL. Centrifuger à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu ECM-b. Compter les cellules et on dilue la suspension de cellules pour obtenir une concentration finale de 3 x 10 5 ml de milieu par HBMEC ECM-b. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des inserts pour la culture cellulaire <ol><li> Le revêtement des inserts de culture cellulaire Remarque importante: Évitez de toucher la membrane des inserts de culture cellulaire. <ol><li> Ajouter une solution de 100 ul de fibronectine (voir 1.1.1) de chaque insert de culture de cellules (Figure 1A) et un puits d&#39;une plaque à fond plat à 96 puits (puits de contrôle optique). Incuber pendant au moins 3 h à 37 ° C. Après incubation de la solution aspirée fibronectine. </li><li> Ajouter 100 pi suspension HBMEC aux inserts de culture cellulaire et le puits de contrôle optique. Ajouter 600 ul de milieu ECM-B vers le compartiment inférieur de la celluleinserts de culture. Incuber pendant 3 - 4 jours à 37 ° C / 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que l&#39; intégrité de la barrière (figure 1B) est atteinte, vérifier la croissance cellulaire par évaluation microscopique du HBMEC dans le puits de contrôle optique. Note: La croissance cellulaire au-delà de quatre jours est pas recommandé. </li><li> Facultatif: Pour reproduire les conditions inflammatoires Aspirer le milieu du compartiment inférieur et le remplacer par du milieu ECM-B supplémenté avec 500 U / ml d&#39;IFN-γ / TNF-α de 24 h avant l&#39;essai de migration. </li></ol></li></ol> 3. Contrôle de la qualité avec Evans bleu le jour du dosage Transmigration <ol><li> Préparation de la solution bleu evans <ol><li> Pour préparer une solution de mélange PBS / B27 10 ml de PBS avec 200 ul de complément B27 en utilisant un tube à centrifuger de 15 mL. Diluer la solution mère bleu Evans (20 mg / ml de PBS) 1: 1000 avec du PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans essai de perméabilité bleu <ol><li> Aspirer le milieu du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieurd&#39;un insert de culture cellulaire contenant une monocouche confluente HBMEC. Ajouter 100 ul d&#39;une solution bleu evans à l&#39;insert de culture cellulaire. </li><li> Ajouter 600 ul de PBS / B27 dans le compartiment inférieur et incuber pendant 60 min à 37 ° C / 5% CO 2. Retirez délicatement l&#39;insert de culture cellulaire en utilisant une pince. </li></ol></li><li> Evans mesure bleu <ol><li> Retirer PBS / B27 du compartiment inférieur et le transfert de 100 ul de chacun de deux puits d&#39;une polystyrol noir plaque de 96 puits à fond plat. Insérer la plaque dans un lecteur de plaque Tecan Pro infini M200 et déterminer position z optimal. </li><li> excitation de la mesure de Evans en utilisant des paramètres respectifs bleu (par exemple: excitation: 620 nm, émission: 680 nm, largeur de bande d&#39;excitation: 9 nm, largeur de bande d&#39;émission: 20 nm, l&#39;amélioration de 175x, 25 clignote, le temps d&#39;intégration: 20 us). </li><li> Pour déterminer les fonctions de barrière HBMEC pour comparer les données acquises à une courbe étalon représentant permeation bleu Evans à travers HBMEC à différents points de temps après la semencecellules ING (Figure 1B, à droite). </li></ol></li></ol> 4. Essai de migration <ol><li> Préparation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). <ol><li> Ajouter 10 ml RPMI dans un tube de centrifugation de 15 ml et ajouter 200 pi supplément B27. Count PBMC et les cellules de centrifugation à 300 xg pendant 5 min. Re-suspendre PBMC à une concentration finale de 5 x 10 6 cellules / ml de RPMI / B27. </li></ol></li><li> Mise en place du test de migration <ol><li> Aspirer moyen du compartiment inférieur suivie par le compartiment supérieur d&#39;inserts de culture cellulaire contenant des monocouches confluentes HBMEC (figure 1A). Par donneur d&#39; ajouter 100 uL de suspension de PBMC chacun des inserts de culture cellulaire et également à un puits d&#39;une plaque à 24 puits par (contrôle in vitro). </li><li> Ajouter 600 ul de RPMI / B27 dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire et de 500 ul de la PBMC du contrôle in vitro et incuber 6 heures à 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li> La récolte des PBMC migrée <ol><li> Retirez l&#39;insert de culture cellulaire à l&#39;aide des pinces et rincer soigneusement le fond avec 400 ul de PBS sans toucher la membrane. Jeter l&#39;insert de culture cellulaire. </li><li> Ajouter 20 ul Fluorospheres de comptage de débit (environ 1000 perles / ul) au compartiment inférieur de la culture cellulaire insérer ainsi que pour le contrôle in vitro et bien mélanger. Transfer 1 ml de suspension de PBMC résultant de cytométrie en flux tubes. </li></ol></li></ol> 5. cytométrie en flux <ol><li> La préparation des échantillons <ol><li> Centrifugeuse PBMC à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Préparer la solution d&#39;anticorps par addition d&#39;un fluorochrome conjugué d&#39;anticorps à 100 pi de tampon de cytométrie en flux (PBS / 1% BSA / EDTA 2 mM) par échantillon. Pour les résultats présentés ci-dessous 1 ul CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 pl CD56-PC7, 1 pi CD8-A700 et 1 ul CD16-A750 ont été utilisés par échantillon. </li><li> Resuspendre PBMC dans 100 ul de la solution d&#39;anticorps et incuber pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter tampon cytométrie de flux 250 uL et centrifuger à 300 g pendant 5 min. </li></ol></li><li> acquisition d&#39;échantillons <ol><li> Re-suspendre PBMC en la quantité requise (varie en fonction du cytomètre de flux utilisé) de cytométrie de flux tampon. </li><li> Acquérir coloré les PBMC en utilisant un cytomètre à écoulement avec un détecteur actif entre 525 et 700 nm de longueur d&#39;onde pour détecter Fluorospheres de comptage de débit (excitation 488 nm, émission 525 à 700 nm). (Les étapes suivantes sont, par exemple, si un flux Gallios cytomètre fonctionnant avec le logiciel Kaluza G est utilisé:. (1) Démarrer l&#39;ordinateur (2) Lorsque le système d&#39;exploitation est entièrement chargé, démarrer le cytomètre à écoulement en appuyant sur le « cytomètre sur bouton » . (3) Chargez le protocole d&#39;acquisition respectif en appuyant sur le bouton « protocole ouvert ». (4) Choisissez le protocole requis et sélectionnez « ouvrir ». (5) en double le protocole pour chaque échantillon en cliquant avec le droitbouton de la souris sur le protocole visible dans le carrousel virtuel et un clic gauche sur le terrain « en double ». (6) d&#39;étiquetage de chaque échantillon dans la liste de l&#39;échantillon. (7) Transférer les échantillons aux positions indiquées sur le carrousel et commencer l&#39;acquisition.) </li></ol></li><li> L&#39;analyse des échantillons <ol><li> Ouvrir flux résultant cytométrie données à l&#39;aide du logiciel respectif. Déterminer le nombre de sous - populations d&#39;intérêt pour transmigré PBMC ainsi que les cellules provenant de puits de contrôle in vitro et de débit comptage Fluorospheres en utilisant le logiciel d&#39;analyse respective. (Un exemple de la stratégie de déclenchement est donnée dans la partie des résultats (Figure 1 C: Pour analyser la transmigration des sous - ensembles de cellules NK, d&#39; abord sélectionner les lymphocytes dans un canal de diffusion latéral (SSC) par rapport au canal de diffusion vers l&#39; avant (FSC) parcelle Lymphocytes sont. puis affichés dans une CD3 contre parcelle CD56 et CD56 + CD3 -. Les cellules NK sont choisies pour distinguer entre les sous - ensembles des cellules NK, les cellules NK sont affichées dansCD56 contre CD16 intrigue et CD56 CD16 lumineux dim / - ainsi que CD56 CD16 + dim cellules NK sont sélectionnées. En outre, comptage de flux Fluorospheres sont choisis parmi un FSC contre SSC terrain et par la suite affichées dans une trame d&#39;un canal avec une émission entre 525 et 700 nm en fonction du temps pour déterminer leur nombre.) </li><li> Pour calculer le nombre total de cellules de chaque échantillon, à normaliser le nombre détecté de cellules en utilisant Fluorospheres de comptage de débit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Déterminer le pourcentage de cellules ayant migré comme rapport entre les cellules totales et les cellules ayant migré au total dans le contrôle in vitro. </li></ol></li></ol>

L’auteur (s) a (sont) déclaré(s) les conflits d’intérêts potentiels suivants en ce qui concerne la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : A.S.-M. et U.B. n’ont pas de divulgations financières. T. S.-H. a reçu des frais de déplacement et de conférence de Biogen. N.S. a reçu des honoraires de conférencier et de membre du conseil consultatif de Biogen et de Novartis Pharma, ainsi que des frais de déplacement de Biogen. H.W. a été rémunéré pour avoir siégé à des conseils consultatifs scientifiques et à des comités directeurs pour Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis et Sanofi-Genzyme. Il a également reçu des honoraires de conférencier et une aide pour ses déplacements de Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis et Sanofi-Genzyme. Il a été rémunéré en tant que consultant par Biogen, Merck Serono, Novartis et Sanofi-Genzyme. H.W. a reçu le soutien de Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Allemagne et Sanofi US. C.C.G. a reçu des honoraires de conférencier et des frais de déplacement pour assister à des réunions de Genzyme, de Novartis Pharma GmbH et de Bayer Health Care.

Nous présentons ici une technique pour étudier la transmigration des lymphocytes à travers la barrière sang-cerveau humain. L&#39;analyse in vitro de la migration des lymphocytes au système nerveux central est important d&#39;étudier les processus de base de l&#39; extravasation des lymphocytes, des altérations liées aux maladies potentielles, et de nouvelles approches thérapeutiques. Plusieurs modifications du modèle de barrière hémato-encéphalique sont possibles. Par exemple, des ...

la migration des lymphocytes du sang dans les tissus est crucial pour la surveillance immunitaire. Une séquence d&#39;interactions moléculaires spécifiques assure le site extravasation spécifique dans l&#39; intestin grêle, peau, ganglions lymphatiques, le système nerveux central (SNC) et d&#39; autres tissus 1. Les modifications de la migration des lymphocytes sont impliqués dans la physiopathologie d&#39;un certain nombre de maladies largement répandus 2. La migration dans le SNC immuno-privilégié est étroitement régulée , et en conséquence des modifications de ce procédé sont impliqués dans les maladies liées au SNC, comme l&#39; encéphalomyélite 3, la neuromyélite optique, accident vasculaire cérébral et la sclérose en plaques (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Il est donc important d&#39;étudier extravasation des lymphocytes pour mieux comprendre la physiopathologie de la maladie et de développer des outils pour une<html> mélioration de la charge de morbidité 8, 9, 10, 11, 12. Les lymphocytes migrent dans le système nerveux central par des voies distinctes. Extravasation à travers veinules post - capillaires dans l&#39;espace sous - arachnoïdien par l&#39; intermédiaire de la barrière de fluide céphalo-sang dans les plexus choroïdes et à travers la barrière sang-cerveau ont été décrits 1, 13, 14, 15. La migration à travers la barrière hémato-encéphalique est réalisée par l&#39;interaction des lymphocytes avec des cellules endotheliales 14. Contrairement aux cellules endotheliales à la périphérie, les cellules endotheliales du système nerveux central expriment de grandes quantités de molécules de jonctions serrées, ce qui limite strictement la quantité de cellules et de protéines capables de traverser la barrière hémato-encéphaliquelass = &quot;xref&quot;&gt; 16. Résultats de l&#39;inflammation dans le desserrage des jonctions serrées et induit l&#39;expression de molécules d&#39;adhésion; Ainsi, l&#39; amélioration de la migration des lymphocytes dans le SNC 1, 17, 18. Extravasation via la barrière hémato-encéphalique est un processus en plusieurs étapes. Lymphocytes attache aux cellules endothéliales et ensuite rouler le long de l&#39;endothélium dans un procédé principalement médiée par les sélectines 1, 15. Par la suite, les interactions entre les chimiokines sécrétées par l&#39;endothélium et les récepteurs de chimiokines respectifs exprimés sur les lymphocytes induisent des changements conformationnels d&#39;intégrines, favorisant ainsi l&#39; adhésion ferme aux cellules endothéliales 1. Enfin, les lymphocytes, soit exploration le long de la barrière endothéliale contre le flux sanguin avant transmigrant dans l&#39;espace périvasculaire, ou bloquer immédiatement et directement transmigrate au niveau du site d&#39;adhérence de la firme 1, 19, 20. Toutes ces étapes de l&#39; extravasation des lymphocytes peuvent être analysés in vitro en utilisant des techniques distinctes 21. La microscopie vidéo time-lapse est utilisé pour étudier la fixation initiale et le laminage 15. Des tests d&#39;adhésion fournissent des informations détaillées sur l&#39; arrestation ferme endothéliale barrières 22. Des dosages de transmigration comme démontré ici permettent l&#39; analyse de la transmigration des cellules immunitaires 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Utilisation de l&#39;humain in vitro modèle de barrière hémato-encéphalique, on pourrait montrer récemment que plus migrla capacité de Atory de CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK par rapport à leur CD56 CD16 + dim homologues est reflété par une prédominance de ce sous - ensemble des cellules NK dans le compartiment 21 intrathécale. Ainsi, notre dispositif expérimental semble être approprié pour simuler la situation in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>sans CaCl2 ou MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectine 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>de plasma bovin</td></tr><tr><td>Fiole de culture cellulaire T-25</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Supplément de croissance des cellules endothéliales</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>clair, 6,5 mm de diamètre, 3,0 & micro; m pore size</td></tr><tr><td>96-well flat bottom plate</td><td>plate Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>solution mère : 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentré</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well black flat bottom plate plate</td><td>plate plaque Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48 puits</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Nombre de débit Fluorosphères</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Cytomètre en flux 10 couleurs</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alpha ;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma ;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

analyse des lymphocytes extravasation l&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; in vitro</em&gt; modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation dans le système nerveux central (SNC) est essentiel pour la surveillance immunitaire. altérations liés à la maladie de l&#39;extravasation des lymphocytes pourraient entraîner des changements physiopathologiques du système nerveux central. Ainsi, l&#39;enquête sur la migration des lymphocytes dans le système nerveux central est important de comprendre les maladies inflammatoires du système nerveux central et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Nous présentons ici un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau humain pour étudier extravasation des lymphocytes. les cellules endotheliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) sont cultivées confluente sur un téréphtalate de polyéthylène poreux Transwell insérer pour imiter l&#39;endothélium de la barrière hémato-encéphalique. Fonction de barrière est validée par l&#39;immunohistochimie de zonula, des mesures de résistance électrique (TEER) transendothéliale ainsi que l&#39;analyse de permeation bleu Evans. Ce modèle permet d&#39; étudier la diapédèse des sous - ensembles de lymphocytes rares tels que CD56 CD16 lumineux dim / - cellules NK. e plusle minerai, les effets d&#39;autres cellules, des cytokines et des chimiokines, des altérations liées à la maladie, et les schémas thérapeutiques distincts sur la capacité migratoire des lymphocytes peut être étudiée. Enfin, l&#39;impact des stimuli inflammatoires, ainsi que différents régimes de traitement sur la barrière endothéliale peuvent être analysées.

Les résultats représentatifs montrant transmigration des sous - ensembles de cellules NK et de lymphocytes T en utilisant le modèle de barrière sang-cerveau humain (figure 1A) sont représentés. L&#39;intégrité de la monocouche mesures HBMEC a été validé par la coloration de la molécule de jonction étanche ZO-1, transendothéliaux résistance électrique (TEER), et permeation bleu Evans (figure 1B). Suite à 3 - 4 jours de culture HBMEC a exprimé la molécule ...

Ici, nous décrivons un modèle humain de barrière hémato-encéphalique permettant d’étudier in vitro la transmigration des lymphocytes dans le système nerveux central.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

L'objectif général de ce test de transmigration est d'étudier l'extravasation des lymphocytes vers le système nerveux central in vitro. Cette méthode peut contribuer à approfondir notre compréhension des maladies inflammatoires du système nerveux central et au développement de nouvelles approches thérapeutiques. Certains avantages de cette technique sont son accessibilité facile et sa capacité à analyser des populations rares de lymphocytes au niveau cellulaire individuel.Cette méthode peut fournir des informations sur la transmigration des lymphocytes à travers la barrière hémato-encéphalique et peut être appliquée à l'étude de la transmigration via la barrière hémato-encéphalique. En outre, une analyse de la perméation du bleu d'Evans peut être réalisée pour évaluer l'intégrité du modèle de barrière hémato-encéphalique. Commencez par recouvrir le fond d'un flacon de culture cellulaire T-25 avec deux millilitres de solution de fibronectine fraîchement préparée, puis incubez pendant au moins trois heures dans une étuve à cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.À la fin de l'incubation, remplacer la solution de fibronectine par 7,2 × 10⁴ cellules endothéliales microvasculaires humaines du cerveau, ou HBMEC, dans six millilitres de milieu ECM-b complet, puis replacer le flacon dans l'incubateur. Lorsque les HBMEC atteignent une confluence de 80 %, transférer le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres et laver les cellules adhérentes trois fois avec cinq millilitres de PBS. Après le troisième lavage, ajouter deux millilitres de solution d'Accutase préalablement réchauffée aux cellules pendant deux minutes à 37 degrés Celsius.Tapotez ensuite fermement le flacon plusieurs fois, en confirmant le détachement des cellules par microscopie optique. Lorsque les cellules commencent à se détacher du fond du flacon, utilisez le surnageant récupéré pour rincer le flacon de manière répétée jusqu'à ce que la majorité des HBMEC soient remises en suspension. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres pour la centrifugation, et remettez en suspension le culot dans un millilitre de milieu ECM-b frais pour le comptage.Pour préparer les inserts de culture cellulaire pour un test de transmigration, ajoutez d'abord 100 microlitres de solution de fibronectine dans chaque insert ainsi que dans un puits d'une plaque à 96 puits à fond plat. Après trois heures à 37 degrés Celsius, remplacez la solution de fibronectine par 100 microlitres de HBMEC, puis ajoutez 600 microlitres de milieu ECM-b frais dans les compartiments inférieurs des inserts de culture cellulaire. Replacez ensuite les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire pendant trois à quatre jours.Pour vérifier si l'intégrité de la barrière a été atteinte, aspirez le milieu des compartiments inférieur et supérieur d'un insert de culture cellulaire, puis ajoutez 100 microlitres de solution de bleu d'Evans fraîchement préparée dans l'insert. Ajoutez 600 microlitres de PBS supplémenté avec B27 dans le compartiment inférieur, puis remettez la plaque dans l'incubateur. Après une heure, utilisez une pince pour retirer délicatement l'insert, puis transférez 100 microlitres de PBS B27 du compartiment inférieur dans deux puits distincts d'une plaque noire en polystyrène, plate, de 96 puits.Ensuite, chargez la plaque dans un lecteur de microplaque multimode et déterminez la position z optimale. Pour évaluer la fonction barrière des HBMEC, mesurez l'excitation de la solution de bleu d'Evans à l'aide des paramètres appropriés et comparez les données obtenues à une courbe standard illustrant la perméation du bleu d'Evans à travers les HBMEC à différents points temporels après l'ensemencement. Après avoir confirmé la formation de la monocouche cellulaire, resuspendez l'échantillon de cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, à une concentration de cinq fois 10 à la puissance six cellules par millilitre dans un milieu RPMI supplémenté avec B27.Ensuite, aspirez le milieu des compartiments inférieur et supérieur du nombre approprié d'inserts pour culture cellulaire contenant les monocouches confluentes de HBMEC, puis ajoutez 100 microlitres de PBMC par donneur dans les inserts pour culture cellulaire et dans un puits d'une plaque 24 puits par contrôle in vitro. Ajoutez 600 microlitres de RPMI supplémenté de B27 dans les compartiments inférieurs des inserts pour culture cellulaire et 500 microlitres dans les puits de contrôle in vitro, puis remettez les plaques dans l'incubateur de culture cellulaire pendant six heures. À la fin de l'incubation, utilisez une pince pour retirer les inserts pour culture cellulaire, en rinçant soigneusement leurs parties inférieures avec 400 microlitres de PBS sans toucher les membranes.Mélangez ensuite soigneusement 20 microlitres de fluorosphères Flow-Count avec les cellules des puits expérimentaux et des puits témoins in vitro, puis transférez un millilitre des suspensions de PBMC obtenues dans les tubes de cytométrie en flux correspondants. Récupérez les cellules par centrifugation, puis ajoutez les anticorps conjugués à un fluorochrome d'intérêt dans 100 microlitres de tampon de cytométrie en flux à chaque échantillon. Après 30 minutes à quatre degrés Celsius, lavez les cellules avec 250 microlitres de tampon de cytométrie en flux frais, puis resuspendez les culots dans le volume approprié de tampon de cytométrie en flux pour l'analyse.Une fois toutes les données acquises, ouvrez le logiciel d'analyse approprié pour la cytométrie en flux. Pour analyser la transmigration de la sous-population de cellules NK, sélectionnez d'abord les lymphocytes sur un graphique de dispersion latérale versus diffusion avant, puis affichez les cellules sur un graphique en nuage de points CD3 versus CD56. Ensuite, sélectionnez les cellules NK positives pour CD56 et négatives pour CD3.Pour distinguer les sous-ensembles de cellules NK transmigrées, affichez les cellules sur un graphique CD56 en fonction de CD16 et sélectionnez les cellules CD56bright, CD16dim ou négatives, ainsi que les cellules CD56dim, CD16-positives. Ensuite, sélectionnez les Fluorosphères Flow-Count sur un graphique de diffusion directe en fonction de la diffusion latérale. Pour déterminer le nombre de billes, affichez les données sélectionnées sur un graphique d'un canal couvrant une longueur d'onde d'émission comprise entre 525 et 700 nanomètres en fonction du temps.Enfin, déterminer le pourcentage de cellules NK migrées comme étant le rapport entre le nombre total de cellules migrées et le nombre total de cellules dans le témoin in vitro. Après trois à quatre jours de culture, les HBMEC exprimaient la molécule de jonction serrée Zonula occludens-1 et se développaient en monocouches présentant une résistance électrique transendothéliale et une perméabilité réduite au colorant bleu d'Evans. La stimulation de la monocouche de cellules endothéliales par l'interféron gamma et le TNF alpha pendant 24 heures avant un test de transmigration de PBMC entiers entraîne une migration accrue de toutes les populations de lymphocytes analysées.Il est intéressant de noter que les cellules NK CD56bright, CD16dim ou négatives présentent une capacité de migration plus élevée que les cellules NK CD56dim, CD16-positives, tant à travers les HBMEC non stimulées qu'activées par des cytokines. Bien que l'augmentation relative de la transmigration à travers une monocouche cellulaire enflammée soit globalement plus importante pour les cellules CD56dim, ce résultat reflète les observations in vivo selon lesquelles les cellules NK CD56bright, CD16dim-négatives sont enrichies dans le compartiment intrathécal. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 10 heures.Le prétraitement du dispositif de transmigration in vitro avec l'interféron gamma et le TNF alpha permet l'étude de la migration des lymphocytes dans des conditions inflammatoires. Notre protocole peut être modifié en appliquant des forces de cisaillement ou en réalisant une co-culture avec d'autres cellules de la barrière hémato-encéphalique, comme les astrocytes, afin d'obtenir un modèle affiné de la transmigration des lymphocytes vers le système nerveux central. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'étudier la transmigration des lymphocytes à l'aide d'un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une étude expérimentale de la transmigration des lymphocytes à travers un modèle d’endothélium de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) est générée in vitro, et des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) contenant des lymphocytes sont ajoutées à la monocouche. Les cellules sont ensuite incubées pour permettre la transmigration des lymphocytes, et les cellules migrées sont...

Étude de la transmigration lymphocytaire à travers une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires

Création de modèles humains de la barrière hémato-encéphalique (BHE) peut bénéficier des recherches sur les conditions du cerveau associées à l'échec du Bureau. Nous décrivons ici une technique améliorée pour la préparation d'un modèle de BBB de contact, ce qui permet de co-culture d'astrocytes humains et les cellules endothéliales du cerveau sur les côtés opposés d'une membrane poreuse.

Amélioration de la méthode pour la préparation d&#39;une base de cellules humaines, Contactez modèle de la barrière hémato-encéphalique

Ici, nous décrivons un modèle murin in vitro de la barrière hémato-encéphalique qui utilise la spectroscopie cellulaire d’impédance, en mettant l’accent sur les conséquences sur l’intégrité et la perméabilité des cellules endothéliales lors de l’interaction avec les cellules T activées.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hémato-encéphalique utilisant la spectroscopie d&#39;impédance: un regard sur T Cell-endothélial cellulaire Interaction

Ici, nous montrons les méthodes in vivo la quantification d’évacuation de leucocytes de naïve, enflammée et peau murine maligne. Nous effectuons une comparaison entre deux modèles : transdermique FITC application et in situ photoconversion. En outre, nous démontrent l’utilité de photoconversion pour le suivi des sorties de leucocytes de tumeurs cutanées.

Quantification des leucocytes évacuation via les vaisseaux lymphatiques de peau Murine et tumeurs

Nous présentons un test de fluorescence pour démontrer que Lucifer Yellow (LY) est un marqueur robuste pour déterminer la perméabilité paracellulaire apparente des monocouches de cellules hCMEC/D3, un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine. Nous avons utilisé cet exemple pour déterminer la cinétique d'une formation de monocouches confluentes dans les cellules cultivées de hCMEC/D3.

Lucifer Yellow - Un marqueur de perméabilité paracellulaire robuste dans un modèle cellulaire de la barrière de sang-cerveau humain

Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.

Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

Dans ce protocole, les lymphocytes sont placés dans la chambre supérieure d'un système de transmigration, séparés de la chambre inférieure par une membrane poreuse. La chimiokine est ajoutée à la chambre inférieure, qui induit une migration active le long d'un gradient de chimiokine. Après 48 h, les lymphocytes sont comptés dans les deux chambres pour quantifier la transmigration.

Évaluation de la migration des lymphocytes dans un système de transmigration ex vivo

Ce manuscrit présente un protocole pour induire l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale active (EAE) chez les souris. Une méthode pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes infiltrés dans le système nerveux central (SNC) est également présentée pour montrer comment les lymphocytes sont impliqués dans le développement de la maladie auto-immune de CNS.

Analyse cytométrique du flux de l’infiltration de lymphocytes dans le système nerveux central pendant l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale

Ici, nous décrivons un protocole, la méthode de culture cellulaire endothéliale étendue (EECM), qui permet de différencier les cellules souches pluripotentes en cellules de type cellule endothéliale microvasculaire cérébrale (BMEC). Ces cellules présentent l’expression de molécules d’adhésion cellulaire endothéliale et constituent donc un modèle de barrière hémato-encéphalique humain adapté à l’étude des interactions entre cellules immunitaires in vitro.

Différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme en cellules endothéliales microvasculaires cérébrales de type phénotype avec un phénotype immunitaire mature

Ce rapport fournit des protocoles d’assemblage, de culture cellulaire et de dosage sur la plateforme μSiM pour la construction de modèles de barrière hémato-encéphalique.

Utilisation de la plateforme tissulaire barrière MicroSiM (μSiM) pour la modélisation de la barrière hémato-encéphalique

Une méthode a été mise au point pour visualiser l’extravasation du colorant due à la rupture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) en administrant deux colorants fluorescents à des souris à différents moments dans le temps. L’utilisation du glycérol comme cryoprotecteur a facilité l’immunohistochimie sur le même échantillon.

Évaluation de la rupture de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de lésion cérébrale traumatique légère

Découvrez l'analyse de l'extravasation des lymphocytes à l'aide d'un modèle in vitro de la barrière hématoencéphalique humaine. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes des maladies inflammatoires du système nerveux central.

Analyse des Lymphocytes extravasation L'utilisation d'un

Explorer plus de vidéos