Lavage bronchoalvéaire des poumons murins pour analyser l'infiltration cellulaire inflammatoire

L’objectif global de cette procédure est de récolter le contenu cellulaire et acellulaire de la lumière pulmonaire par lavage broncoalvéolaire pour des analyses ex vivo et pour l’évaluation de l’état pathologique en cours de l’animal. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’immunologie respiratoire sur les mécanismes immunitaires induits par les infections et l’inflammation grâce à la quantification des réponses cellulaires et humorales innées dans les poumons. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est simple, efficace et hautement reproductible et qu’il n’est pas nécessaire d’utiliser d’équipement ou d’outils spéciaux.

Avant de commencer la procédure, créez un cathéter en insérant une aiguille de calibre 23 dans un morceau de tube en plastique transparent de calibre 21 de 0,5 centimètre et placez l’animal en position couchée. Sécurisez les membres de la souris et désinfectez le cou avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, à l’aide d’un scalpel, faites une incision cutanée près de la trachée.

Ouvrez la peau pour exposer les glandes salivaires et utilisez des pinces pour séparer les glandes et révéler le muscle hyoïde sternal. Utilisez la pince pour inciser le muscle autour de la trachée. Lorsqu’il est visible, utilisez la pince pour enfiler une suture en coton sous le tissu trachéal.

Ensuite, utilisez une aiguille de calibre 26 pour percer soigneusement le milieu de la trachée entre deux anneaux cartilagineux et insérez le cathéter préfabriqué à environ 0,5 centimètre dans la lumière trachéale. Stabilisez le cathéter avec la suture. Ensuite, chargez une seringue d’un millilitre avec un millilitre de solution saline équilibrée stérile complétée par 100 micromolaires d’EDTA.

Connectez la seringue chargée au cathéter et injectez doucement la solution équilibrée de sel et d’EDTA dans le poumon. Lorsque toute la solution saline a été injectée, aspirez doucement la solution tout en massant le thorax. Il est très important d’être doux lors de l’injection et de la reprise du fluide solide afin de maximiser la récupération du fluide BAL et de minimiser les forces de débordement.

Si le liquide solide passe par le nez, fixez à nouveau la suture le long du cathéter. Lorsque toute l’aspiration a été recueillie, transférez le liquide dans un tube de 15 millilitres sur de la glace et répétez le lavage deux fois de plus. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en sept minutes si elle est exécutée correctement.

Après le troisième prélèvement de lavage broncho-alvéolaire, centrifugez l’aspiration en grappe et stockez le surnageant à moins 80 degrés Celsius. Remettez la pastille en suspension dans 200 microlitres de tampon de lyse ACK. Après pas plus de deux minutes à température ambiante, diluez le tampon de lyse avec un millilitre de PBS froid et collectez les cellules par centrifugation.

Remettre la pastille en suspension dans le volume approprié de PBS pour le nombre d’échantillons à analyser et aliquoter les cellules dans le nombre approprié de puits d’une plaque de 96 puits pour l’analyse. Récupérez les cellules par une autre centrifugation et remettez les granulés en suspension dans 50 microlitres de FC Block et PBS. Après 10 minutes à température ambiante, ajoutez 50 microlitres du cocktail d’anticorps approprié d’intérêt à chaque puits et incubez les cellules pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius à l’abri de la lumière.

À la fin de l’incubation, centrifugez la plaque et jetez le surnageant, en remettant les pastilles en suspension jusqu’à un volume final de 200 microlitres de tampon FAX par puits pour l’analyse cytométrique en flux. En utilisant une stratégie de déclenchement basée sur l’expression différentielle d’antigènes à la surface de diverses populations de cellules de lavage broncho-alvéolaire, il est possible d’identifier une variété de types de cellules immunitaires. Les cellules et les singlets sont fermés en fonction de leurs propriétés de diffusion directe et latérale.

Les cellules négatives, vivantes ou mortes, sont contrôlées, suivies de l’identification des cellules Cd11c High et Cd11c Low. Dans la population Cd11c High, les macrophages et les cellules dendritiques peuvent être identifiés sur la base de leur expression respective du CMH-II et du SinglecF. Dans la population Cd11c Low, les lymphocytes T et B peuvent être identifiés en fonction de leur expression respective de CD3/CD19 et du CMH-II.

Dans les cellules restantes, les éosinophiles et les neutrophiles peuvent être identifiés par l’expression de leur marqueur Cd11b ou Ly-6G respectivement. Le comptage des billes peut également être ajouté pour déterminer le nombre absolu de cellules des différentes populations cellulaires en comparant le rapport entre les billes et les événements cellulaires, par exemple, chez les animaux naïfs par rapport aux animaux stimulés par le LPS. Après la récolte du liquide BAL, d’autres techniques telles que l’immunoblot ELISA, le réseau de billes de cytokines peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires sur le contenu acellulaire du liquide BAL.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en immunologie pour explorer le contenu cellulaire et acellulaire de la lumière pulmonaire de souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer des BAL de manière efficace et reproductible.