L'évaporation de réduction Culture Condition Augmente la reproductibilité de la formation multicellulaire Spheroid en plaques de microtitration

L’objectif global de cette procédure est d’améliorer l’évolutivité et la reproductibilité de la formation uniforme de sphéroïdes à l’aide d’une technique de recouvrement liquide dans des plaques à 384 puits. Le principal avantage de cette technique est qu’elle réduit la réopération excessive du milieu à partir de plusieurs plaques, améliorant ainsi la reproductibilité de la formation de sphéroïdes. Nous avons développé et validé la méthode de culture de sphéroïdes 3D pour les tests de dépistage d’arthropodes dans notre laboratoire et notre étude a consisté à évaluer quel est l’effet de bord dans les plaques des cultures multicellulaires.

Aujourd’hui, je vais faire une démonstration de la procédure avec Sona, une affiche du laboratoire. Commencez cette procédure en pesant zéro virgule sept cinq grammes d’agarose à bas point de fusion et ajoutez-le à 100 millilitres de milieu mccoy’s 5a avec ou sans rouge de phénol et sans sérum. Faites chauffer la solution au micro-ondes et faites-la tourner toutes les une à deux minutes pour dissoudre complètement l’agarose.

Ensuite, autoclavez la solution pour la stériliser. Après avoir laissé l’agarose autoclavé refroidir à environ 70 degrés Celsius, filtrez-le à travers un filtre de 500 millilitres à point zéro deux micromètres dans une boîte à flux laminaire. Ensuite, si la solution entière ne doit pas être utilisée en une seule fois, aliquotez-la.

Conservez cette solution d’agarose prête à l’emploi de manière aseptique dans une chambre froide ou un réfrigérateur à quatre degrés Celsius jusqu’à quatre semaines. En travaillant dans une boîte de flux, installez une cassette de distribution à embout en plastique ou en métal dans un distributeur de réactifs combiné. Placez le poids du tube dans un récipient contenant 70 % d’éthanol, puis amorcez la cassette.

Ensuite, déplacez le poids du tube dans un récipient de PBS et amorcez-le à nouveau. Ensuite, chauffez une aliquote stockée de solution d’agarose filtrée au micro-ondes pour la faire fondre. Amorcez la cassette de distribution avec une solution d’agarose, puis démarrez le protocole pour enrober 384 microplaques bien traitées par culture tissulaire avec 15 microlitres de solution d’agarose filtrée.

Laissez refroidir l’agarose dans la plaque pendant 15 à 20 minutes avant d’ensemencer les cellules comme décrit dans la section suivante de la vidéo, ou de les stocker à quatre degrés Celsius et à l’abri de la lumière directe. Enfin, pour nettoyer la cassette de distribution, placez le poids du tube dans de l’eau stérile à 70 à 80 degrés Celsius et appuyez sur le bouton d’amorçage du distributeur. Cela éliminera toute agarose restante dans les pointes de la cassette et les tubes.

Le processus d’ensemencement cellulaire suivant doit être effectué dans des conditions stériles et dans une boîte à flux laminaire. Commencez par retirer le nombre requis de microplaques enrobées d’agarose 384 bien traitées pour la culture tissulaire de l’entrepôt frigorifique et laissez-les s’équilibrer à température ambiante pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez le distributeur de réactifs combiné pour la visualisation cellulaire en amorçant une cassette de distribution de tube standard avec 70 % d’éthanol et de PBS stérile.

Ensuite, à l’aide des boutons de réglage manuel du distributeur, réglez le volume de vision au microlitre requis et la vitesse de distribution à moyenne. Utilisez l’enzyme de dissociation cellulaire recombinante pour prélever les cellules de carcinome colorectal humain HCT116 adhérentes d’une fiole de culture tissulaire. Dans un bécher stérile, faites une suspension cellulaire avec des cellules à une densité de 2,5 fois 10 à la quatrième cellules par millilitre par puits dans 50 microlitres de milieu de croissance complet.

Si plus d’une plaque de 384 puits doit être ensemencée, utilisez un agitateur magnétique pour éviter qu’elles ne se déposent au fond du bécher. À l’aide d’un distributeur, ajoutez les 25 cents cellules dans chaque puits d’une plaque de 384 puits. Laisser reposer les assiettes pendant 30 minutes à température ambiante.

Pendant ce temps, prenez un couvercle de microplaque environnementale réduisant l’évaporation et, à l’aide d’une pipette de cinq millilitres, distribuez quatre millilitres de diméthylsulfoxyde à cinq pour cent dans l’auge latérale, en balayant lentement de haut en bas. Répétez ce processus avec l’auge du côté droit. Assurez-vous que le liquide ajouté dans les auges latérales ne fusionne pas au centre du couvercle et ne laisse pas d’espace pour l’échange gazeux.

Si une trop grande quantité de liquide est ajoutée, elle s’infiltrera à l’extérieur du couvercle et pénétrera ensuite dans le puits extérieur de la plaque de culture tissulaire 384. Après 30 minutes, examinez les cellules au microscope. Le repos des plaques pendant 30 minutes permet aux cellules de se déposer complètement dans le fond du puits et à proximité les unes des autres, ce qui est important pour la formation de sphéroïdes uniques par puits.

Centrifugez les plaques ensemencées pendant 15 minutes à quatre fois G.Après l’essorage, remplissez le réservoir de liquide de la plaque de culture tissulaire 384 avec de l’eau stérile et remplacez les couvercles de plaque habituels par les couvercles environnementaux remplis de liquide. Placez les plaques dans un incubateur rotatif à 37 degrés Celsius avec 95 % d’humidité, 5 % de CO2 et 20 % d’oxygène et laissez les cellules s’agréger en sphéroïdes tumoraux multicellulaires ou TCMT pendant quatre jours. Évitez d’ouvrir la porte de l’incubateur trop longtemps les jours suivants afin que le taux d’humidité ne baisse pas brusquement.

Le quatrième jour suivant la formation du NCTS, utilisez un distributeur automatique de lave-microplaques pour ajouter 30 microlitres de milieu préchauffé à chaque puits. Remettez les SCTM dans l’incubateur et laissez-les croître jusqu’à ce qu’ils atteignent la taille souhaitée pour l’expérimentation. Tous les trois jours, pour remplacer le fluide, ajustez empiriquement la hauteur Z du collecteur de laveuse et réglez la vitesse de distribution et la vitesse à laquelle le collecteur de lavage descend dans les puits au taux le plus bas pour minimiser les turbulences dans les puits.

Aspirez 30 microlitres de milieu par puits et remplacez-le par 30 microlitres de milieu frais et préchauffé. Remettez ensuite les cellules dans l’incubateur. Imagez les SCTM dans un système d’imagerie automatisé à haut contenu à l’aide d’un objet aérien quatre X avec une ouverture numérique de 16.

À l’aide du logiciel d’imagerie, réglez le temps d’exposition à 11 millisecondes et le binning à quatre par quatre. Ajustez le nombre et l’espacement des piles z et du regroupement de pixels comme vous le souhaitez pour que l’expérience capture un SCTM entier dans chaque puits. Traitez les images 2D par étapes pour mesurer l’aire des SCTM, les grands et petits axes, le périmètre et la solidité.

Veuillez consulter le code m et les fichiers de lecture de texte qui l’accompagnent pour des instructions spécifiques. Pour déterminer l’applicabilité potentielle de la routine, des SCTM âgés de sept jours ont été traités avec différentes concentrations de médicaments anticancéreux, le Paclitaxel, le PTX, la Vincristine, le VCR, l’Oxalyplatine, l’OXA, la Doxyrubicine, le DOX et cinq flurouracil, le 5-FU, à trois concentrations différentes pendant quatre jours. Des images des SCTM sont présentées ici.

Ces images ont été analysées pour déterminer l’aire, les axes majeurs et mineurs, le périmètre et la solidité des SCTM traités médicamenteusement par rapport aux témoins, les CTL. Les axes majeur et mineur ont été utilisés pour calculer le volume géométrique. Il y a eu une diminution de la surface et du volume des SCTM en fonction de la concentration après le traitement médicamenteux.

Bien que le point zéro d’un microgramme par millilitre de Vincrystine et le point zéro de quatre microgrammes par millilitre de doxyrubicine et de cinq fluorouraciles aient entraîné une augmentation de la surface des SCTM, le volume n’a été augmenté de manière significative qu’après le point zéro zéro d’un microgramme par millilitre de Vincrystine. Le périmètre des SCTM n’était significativement différent qu’aux concentrations les plus élevées de Packlitaxel, de Doxyrubicine et de Five Fleurouracil, ce qui a complètement affecté la taille des SCTM. Le traitement avec du Packlitaxel et de la Vincrystine à zéro virgule deux cinq microgrammes par millilitre et zéro point zéro six microgrammes par millilitre et de la doxyrubicine et du Five Fleurouracil à 100 microgrammes par millilitre, a entraîné une diminution significative de la solidité, indiquant une désintégration complète à partielle des SCTM.

Prises ensemble, ces données démontrent l’utilité de cette méthode dans l’étude de médicaments anticancéreux potentiels. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est correctement exécutée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de noter que toutes les lignées cellulaires ne conviennent pas à une méthode de culture 3D particulière et que différentes lignées cellulaires forment des sphéroïdes qui présentent des différences dans les formes, la taille, l’histologie et la cinétique de croissance des sphéroïdes.

La routine de stimulation que nous avons développée permet une évaluation efficace de la taille des sphéroïdes, en particulier dans les sphéroïdes partiellement désintégrés traités par médicament qui n’ont pas de limite clairement définie pour la mesure de la section transversale. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension du fait que les modifications présentes ici ne nécessitent aucun équipement ou consommable supplémentaire et peuvent être mises en œuvre régulièrement dans votre laboratoire de dépistage d’arthropodes.