Un protocole automatisé pour l'analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

L'objectif général de cette méthode est de guider rapidement et de manière fiable la quantification des fibres musculaires dans des muscles entiers de rat de façon automatique et indépendante de l'utilisateur, en utilisant une plateforme open source. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuromusculaire concernant les défauts liés au vieillissement, aux maladies ou aux traumatismes sur les muscles squelettiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée pour analyser de manière fiable les populations de fibres musculaires et générer des images de haute qualité de sections transversales musculaires.

Après un dégel suffisant, rincez soigneusement les échantillons dans du PBS supplémenté en Triton X, ou PBST, en effectuant un lavage de dix minutes et un lavage de cinq minutes. Après le deuxième lavage, laissez sécher les sections à l'air pendant deux minutes. Ensuite, utilisez un stylo hydrophobe pour entourer individuellement les coupes transversales.

Après 15 minutes supplémentaires de séchage à l'air, bloquer toute liaison non spécifique avec du PBST enrichi de sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Ensuite, laver les lames et ajouter le mélange approprié d'anticorps primaires à chaque échantillon pour une coloration d'une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, rincer les lames avec un lavage de 10 minutes et un lavage de cinq minutes au PBST.

Ensuite, étiquetez les sections musculaires avec le cocktail d'anticorps secondaires approprié pendant une heure, à l'abri de la lumière. Après avoir lavé les lames deux fois dans du PBST, comme indiqué, séchez les lames, puis coloriez les noyaux à l'aide d'un kit de coloration nucléaire au DAPI selon les instructions du fabricant. Éliminez l'excès de DAPI par un lavage d'une minute dans du PBST, suivi d'un séchage à l'air bref.

Ensuite, recouvrez les échantillons de milieu de montage fluorescent et de lamelles, puis conservez les lames à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière. Entre 24 et 48 heures après la coloration, insérez les lames dans un numériseur de lames et ouvrez un nouveau projet dans le logiciel du programme. Pour l'aperçu de la lame, sélectionnez le canal DAPI et l'objectif 2,5x, puis faites manuellement la mise au point sur le premier spécimen.

Définissez chaque coupe transversale devant être incluse pour le processus d'acquisition détaillé et réglez les temps d'exposition pour chaque canal. Lancez maintenant l'acquisition automatique des images, en vérifiant la bonne acquisition du premier champ, afin d'éviter une acquisition incorrecte en début de processus automatisé. Une fois l'acquisition des images terminée, vérifiez manuellement que la mise au point automatique des coupes transversales est correcte et que les fibres individuelles sont clairement discernables.

Il est essentiel de vérifier et de corriger manuellement la mise au point automatique pour chaque image, selon les besoins. Le processus automatisé de quantification des fibres musculaires nécessite des images de haute qualité pour obtenir des résultats optimaux. Ensuite, pour chaque coupe transversale devant être incluse dans les analyses finales, exporter chaque canal sauf DAPI séparément en tant que fichiers JPEG, puis nommer et classer les fichiers dans les dossiers portant les noms appropriés selon les canaux exposés.

Avant de commencer le processus de quantification des fibres musculaires, prévisualisez chaque image dans un logiciel de retouche d'image approprié afin de confirmer un contraste suffisant entre les fibres colorées et le fond. Ensuite, dans ImageJ, utilisez la commande Plugins>Macros>Edit pour afficher le code source du macro, puis modifiez le répertoire de dossier pour chaque canal dans le code source du macro. Exécutez ensuite le macro à l’aide de la commande Run.

Toutes les images du dossier seront chargées dans le macro et quantifiées dans un ordre consécutif. À la fin de la quantification, exportez les résultats vers le logiciel de tableur approprié et identifiez les valeurs des fibres lentes, intermédiaires et rapides comptées positivement. Le nombre total de fibres peut alors être calculé.

La coloration immunofluorescente des fibres musculaires est rapide et présente une faible réactivité croisée ; les images obtenues mettent en évidence un contraste élevé entre les fibres colorées et les tissus environnants, ainsi qu'une nette distinction entre les différents types de fibres. L'analyse automatique permet de détecter les proportions relatives des populations de fibres musculaires avec une précision de ± 4 % par rapport à l'analyse manuelle, les décomptes absolus totaux étant plus élevés qu'avec l'analyse manuelle. Les décomptes relatifs, en revanche, restent similaires, dans une fourchette de ± 4 %.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cette méthode pour automatiser la quantification des fibres musculaires. N’oubliez pas que le travail avec le DAPI peut présenter des risques. Par conséquent, portez les équipements de protection appropriés lors de la réalisation du marquage.