Name: Un protocole automatisé pour lanalyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Découvrez une méthode automatisée pour quantifier les populations de fibres musculaires chez le rat par immunohistochimie de la chaîne lourde de myosine. Ce protocole réduit le temps d'analyse et la variabilité inter-utilisateur.

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Cette étude a été soutenue par la Fondation pour la recherche Christian Doppler. Nous tenons à remercier Sabine Rauscher de l&#39;imagerie de l&#39;installation de base à l&#39;Université médicale de Vienne, en Autriche pour le soutien tout au long du projet. Les anticorps primaires ont été développés par Schiaffino, S., obtenu à partir de l&#39;études du développement Hybridome Bank, créée par le NICHD du NIH et maintenu à l&#39;Université de l&#39;Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA.

Toutes les procédures , y compris des sujets animaux ont été menées dans le respect des principes de protection des animaux de laboratoire tel que recommandé par FELASA 26. L&#39;approbation a été obtenue avant l&#39;étude par le comité d&#39;examen institutionnel de l&#39;Université médicale de Vienne et le Ministère autrichien de la recherche et de la Science (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numéro de référence: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014). 1. Muscle récolte NOTE: Une publication précédente par Meng et al. 27 est disponible décrivant le gel correct des échantillons musculaires en détail. <ol><li> Obtenir l&#39; ensemble des muscles ou des tissus suffisante pour acquérir des coupes transversales entières immédiatement après l&#39; euthanasie des animaux. <ol><li> Retirez le muscle entier d&#39;un rat anesthésié ou euthanasiés. Retirez tout le tissu conjonctif et les tendons entourant le muscle avec des pinces et des ciseaux. Pour unnesthesia ou l&#39; euthanasie, suivez les directives internationales de FELASA 28. </li></ol></li><li> Peser musculaire en utilisant une échelle de précision calibrée. Cette étape rapide permet des analyses comparatives entre les échantillons musculaires, en particulier après les procédures d&#39;intervention. </li><li> Mettre muscle dans un récipient, rempli entièrement avec un composé OCT, en fonction de la taille du muscle avec une marge de sécurité d&#39;environ 1 mm sur tous les côtés (par exemple, faite d&#39; une feuille d&#39;aluminium). </li><li> Congeler à environ 2 min prérefroidi isopentane utilisant de l&#39;azote liquide. Le isopentane doit commencer à montrer des cristaux blancs au fond du récipient. REMARQUE: Cette étape est essentielle pour la préservation de l&#39;architecture correcte du muscle et permet ainsi la bonne coloration et analyse des fibres 27. </li><li> Conserver les échantillons conservés dans l&#39;OCT pendant au moins 24 h à -80 ° C. Les échantillons peuvent toutefois être conservés à -80 ° C pendant plusieurs mois, voire des années, si corre<html> refroidi cte. </li><li> Couper 10 um sections transversales de la partie médiane du muscle à -20 ° C en utilisant un cryotome. Si l&#39;on coupe à 10 pm est pas possible, augmenter l&#39;épaisseur par palier de 2 um jusqu&#39;à un maximum de 20 pm. lames de coupe sont essentiels d&#39;une netteté pour cette étape. </li><li> Appliquer les sections aux diapositives adhésives en rapprochant les diapositives des sections transversales. Les sections collera automatiquement aux diapositives adhésives. Conserver les diapositives à -20 ° C pendant la nuit avant la coloration. </li></ol> 2. Staining NOTE: Un grand nombre d&#39;anticorps dirigés contre les protéines de chaîne lourde de myosine sont disponibles; Cependant, les anticorps de haute qualité sont essentiels pour l&#39;acquisition et l&#39;analyse automatisée. Pour des dilutions et référence aux anticorps, voir le tableau 1. Pour un fichier tableur pour calculer les dilutions correctes et voir le nombre de quantités de solution nécessaires, voirsource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx&quot;&gt;Supplemental Fichier 1. <ol><li> Dégeler et sécher à l&#39;air les sections musculaires congelés pendant 10 minutes avant la procédure de coloration. </li><li> Laver les lames avec précaution avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 0,05% de Triton X pendant 10 minutes, puis pendant 5 min. Triton a été montré pour améliorer considérablement la qualité de coloration. Voir la discussion pour plus de détails. </li><li> Laisser sécher à l&#39;air les sections pendant 2 min et de définir des sections transversales individuelles sur chaque diapositive à l&#39;aide d&#39;un stylo hydrophobe (pour minimiser la quantité requise d&#39;anticorps) et permettre un séchage supplémentaire pendant 15 minutes. </li><li> Bloquer toutes les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contenant du sérum de chèvre à 10% pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Diluer tous les anticorps primaires (Tableau 1) dans un cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) contenant 10% de sérum de chèvre. Mélanger suffisamment avant l&#39;application. Triton X est essentielle pour la coloration égale de l&#39;ensemble des sections. Calculerenviron 30 uL de cocktail d&#39;anticorps primaire par section transversale. </li><li> Pour connaître les étapes 2.7-2.13 assurer une protection suffisante de la lumière. lumières de la pièce grisés et des plateaux de coloration couvertes assurent une protection adéquate. En outre, remplir le bac de coloration avec le fluide au fond de fournir un environnement humide pendant la coloration et prévenir le dessèchement. </li><li> Appliquer l&#39; anticorps primaire (tableau 1) cocktails sur les lames pendant 1 h dans un plateau de coloration humide à la température ambiante. </li><li> Laver les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X pendant 10 min puis avec de nouveaux PBST pendant 5 min. </li><li> Diluer Anticorps secondaires dans un cocktail de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + 10% de sérum de chèvre. Calculer 30 uL de cocktail d&#39;anticorps primaire par section transversale. </li><li> Appliquer un cocktail d&#39;anticorps secondaire sur les lames pendant 1 h. </li><li> Laver les lames avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) pendant 10 min et à nouveau PBST pendant 5 min. </li><li> Appliquer un kit de coloration nucléaire DAPI (de préférence des solutions de lecture à utiliser) for 15 min ou selon les instructions pour colorer les noyaux des cellules du fabricant. </li><li> Laver les lames brièvement avec du PBS + 0,05% de Triton X (PBST) pendant 1 min. Ensuite, laissez-diapositives brièvement à l&#39;air sec. </li><li> Appliquer support et des lamelles de montage fluorescent. Conserver à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière et d&#39;effectuer l&#39;imagerie de façon optimale à l&#39;intérieur de 24 à 48 h. </li></ol> 3. Microscopie <ol><li> Charger glisse dans le scanner de diapositives. Un maximum de 12 lames est réalisable en fonction du scanner de diapositives. </li><li> Démarrez un nouveau projet. Pour régler le canal aperçu DAPI et la lentille 2.5X. Pour l&#39;analyse détaillée des canaux utiliser DAPI, GFP, FITC et Cy5 et l&#39;objectif 20X. L&#39;autofocus est acquis tout au long du projet dans le canal DAPI. </li><li> Utilisez les couleurs suivantes pour chaque canal: DAPI -bleu FITC: vert, rouge Texas: rouge, Cy5: jaune. </li><li> Créer des aperçus de chaque diapositive en utilisant le canal DAPI. A cet effet, appliquer mise au point manuelle sur le premier échantillon et l&#39;utiliser tout au long de l&#39;aperçuanalyse d&#39;acquérir des images d&#39;aperçu de chaque spécimen. </li><li> Décrire chaque section qui devrait être inclus dans le processus d&#39;acquisition détaillé. Ne pas tirer contours près des bords de l&#39;échantillon, afin d&#39;assurer la légende de toute la zone d&#39;intérêt. </li><li> Régler les temps d&#39;exposition pour chaque canal. Dans la plupart des cas, les paramètres d&#39;exposition des différents canaux sont identiques pour toutes les sections. </li><li> Exécutez l&#39;acquisition automatique d&#39;images. Vérifiez correcte acquisition pour le premier champ de vues, afin d&#39;empêcher l&#39;acquisition incorrecte au début du processus automatisé. </li><li> Si nécessaire, établir un contrôle à distance en utilisant le logiciel de mise en miroir de bureau. Cela permet la surveillance à distance du processus d&#39;acquisition de l&#39;image en miroir de l&#39;écran d&#39;ordinateur du scanner de diapositives à un autre ordinateur par l&#39;intermédiaire d&#39;un réseau ou une connexion Internet. Bien que, aucune modification ne peut être à la configuration physique en ce qui concerne les diapositives utilisées, l&#39;environnement virtuel du logiciel d&#39;acquisition d&#39;images permet de surveiller la<html> mise au point ou corriger les temps d&#39;exposition des images. De plus, le temps estimé pour l&#39;achèvement peut être vérifié régulièrement. </li><li> Après l&#39;achèvement de l&#39;acquisition de l&#39;image, le contrôle de la mise au point correcte de toutes les images en contrôlant manuellement si l&#39;architecture de fibres, les fibres individuelles et les différents types de fibres peuvent être distingués. </li><li> Réacquérir les zones d&#39;image focalisée de manière incorrecte pour les champs de vue uniques ou des domaines d&#39;intérêt tout entier. Pour réacquisition des zones simples, marquer des zones ou des images tout au long de l&#39;ensemble du projet et réacquérir les zones avec mise au point manuelle. Dans la plupart des cas, un détail d&#39;image supplémentaire dans un niveau de mise au point différent conduit à mal les images centrées </li><li> Pour chaque section qui devrait être inclus dans les analyses finales, exporter chaque canal (hors DAPI) séparément sous forme de fichiers JPEG. Nom et trier les fichiers selon les canaux exposés dans des dossiers nommés Texas Red, FITC et Cy5. </li></ol> 4. Analyse automatisée de fibres tente &quot;&gt; NOTE: La macro peut être obtenue à partir de la page Web suivante: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/ <ol><li> Aperçu de chaque image à l&#39;aide d&#39;un logiciel d&#39;édition d&#39;image classique avant les analyses et vérifier un contraste suffisant entre les fibres colorées et fond. Si nécessaire, ajuster le contraste et la luminosité pour augmenter la différence, en utilisant les commandes de luminosité et de réglage du contraste. </li><li> Ouvrez ImageJ ou Fidji. Ouvrez la macro en utilisant la commande « Plugins - macros - Modifier ». Cela montre le code source de macros et permet une adaptation rapide des paramètres. Si nécessaire, modifiez le répertoire du dossier pour chaque canal dans le code source de la macro. REMARQUE: Les valeurs pour les analyses de fibres musculaires sont basées sur des biceps de rat et les muscles lombrical, d&#39;autres espèces ou les muscles peuvent exiger des valeurs différentes. </li><li> Utilisez la commande « run » pour lancer la macro. Toutes les images du dossier sont maintenant chargés dans la macro et quantifiés dans un ordre consécutif. Les résultats sont shoWN dans une nouvelle fenêtre. Cette étape peut prendre de quelques secondes à plusieurs heures, en fonction de la quantité de données en cours d&#39;analyse. </li><li> Exporter la fenêtre de résultats dans un fichier tableur. Identifier les valeurs de Cy5 compté positivement (lent), les fibres FITC (intermédiaire) et le rouge Texas (rapide) et résumé pour le nombre total de fibres. </li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

<html> Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour étudier et quantifier automatiquement les populations de fibres musculaires des sections de rat par immunohistochimie dans un temps de manière efficace. Pour la reproductibilité, nous présentons une étape détaillée par la description de l&#39;étape et les modifications potentielles pour des applications dans d&#39;autres espèces ne sont pas décrites dans cette étude. De plus, nous discutons des avantages de la procédure, les conditions préalables pour...

Composition du muscle squelettique subit de profondes modifications au cours des processus physiologiques tels que le vieillissement 1, 2, 3 exercice, 4, 5, 6, 7 ou processus pathophysiologiques telles que la maladie 8, 9, 10 ou 11 traumatisme. Par conséquent, plusieurs champs de concentré de recherche sur les effets structurels de ces processus pour comprendre les changements fonctionnels. L&#39;un des aspects clés qui déterminent la fonction musculaire est la composition des fibres musculaires. Les fibres musculaires expriment différentes chaînes lourdes de myosine (MHC) des protéines et sont ainsi classés en fibres lentes, intermédiaires, ou rapides 7, 12, 13 </sup<html> &gt;, 14, 15, 16, 17. Physiologiquement, les muscles ont différentes compositions de fibres de muscle selon leur fonction dans le corps. En utilisant typage des fibres musculaires, les populations de fibres peuvent être quantifiés pour identifier l&#39; adaptation à des processus physiologiques ou physiopathologiques 7, 17. Historiquement, un certain nombre de méthodes qui prennent du temps ont été appliquées à la différence entre les types de fibres musculaires. A cet effet, les fibres musculaires ont été classés soit par la réactivité de la myosine ATPase à différents niveaux de pH ou de l&#39;activité enzymatique musculaire. Comme différentes qualités de fibres ne peuvent pas être évalués en une seule section, les sections transversales multiples ont été nécessaires pour identifier toutes les fibres musculaires et de permettre la quantification manuelle 14, 16, 17,= &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20, 21, 22. En revanche, les publications récentes utilisées immunohistochimie (IHC) contre la protéine de chaîne lourde de myosine pour colorer rapidement plusieurs types de fibres dans une seule des sections transversales. Sur la base des avantages de cette procédure, il est maintenant considéré comme l&#39;étalon-or dans l&#39; analyse de la population des fibres musculaires 19, 23, 24. En utilisant l&#39;amélioration des protocoles de coloration IHC, nous avons récemment pu montrer que l&#39;acquisition automatique des sections entières de croix musculaire et la quantification ultérieure des fibres musculaires automatique est possible en utilisant la plate-forme open source ImageJ. Par rapport à la quantification manuelle, notre procédure a fourni une diminution significative du temps (environ 10% des analyses manuelle) requise par diapositive tout en étant précis à ± 4% 25 </sup&gt;. L&#39;objectif global de cette méthode est de décrire un guide rapide, fiable, indépendante de l&#39;utilisateur à la quantification des fibres musculaires automatique dans les muscles entiers de rat en utilisant une plate-forme open source. De plus, nous décrivons les modifications potentielles qui permettraient son utilisation pour d&#39;autres spécimens tels que des souris ou des muscles humains.

<table><tbody><tr><td>Composé O.C.T</td><td>Tissue-Tek, Sakura, Pays-Bas</td><td></td><td>Pour l’enrobage du tissu musculaire</td></tr><tr><td>Isopentane</td><td></td><td></td><td>pour une congélation adéquate du tissu musculaire</td></tr><tr><td>Lames Superfrost Ultra Plus Thermo</td><td>Scientific, Allemagne</td><td>1014356190</td><td>lames adhésives tamponnées</td></tr><tr><td>au phosphate saline&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>85112</td><td>Détergent Soluation</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>50197Z</td><td>Sérum de chèvre</td></tr><tr><td>DAKO Fluorescent Montage Medium</td><td>Dako Danemark</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Dako stylo</td><td>Dako Danemark</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Vienne, Autriche</td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Anticorps primaires</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MHC-I (Cat# BA-F8, RRID : AB_10572253)</td><td>Études développementales Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID : AB_2147165)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID : AB_2266724)</td><td>Études développementales Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, États-Unis)</td><td></td><td>Surnageant</td></tr><tr><td><fort>Anticorps secondaires</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp ; Fluor&nbsp ; 633&nbsp ; Chèvre Anti-Souris IgG2b&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Chèvre Anti-souris IgG1&nbsp ;( et gamma ; 1)</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Chèvre Anti-Souris IgM (&micro ; chaîne)</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Réactif</td><td>Thermo Scientific, Allemagne</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat muscle sections cross utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification des populations de fibres de muscle donne une idée plus précise des effets de la maladie, un traumatisme, et d&#39;autres influences sur la composition du muscle squelettique. Diverses méthodes chronophages ont traditionnellement été utilisées pour étudier les populations de fibres dans de nombreux domaines de recherche. Cependant, récemment mis au point des méthodes immunohistochimiques basées sur l&#39;expression des protéines de chaîne lourde de la myosine fournir une alternative rapide pour identifier les types de fibres multiples dans une seule section. Nous présentons ici un protocole rapide, fiable et reproductible pour une meilleure qualité de coloration, ce qui permet l&#39;acquisition automatique des sections entières et la quantification automatique des populations de fibres avec ImageJ. A cet effet, les muscles squelettiques sont coupés intégrés dans les sections transversales, colorées à l&#39;aide des anticorps chaînes lourdes de myosine avec des anticorps fluorescents secondaires et DAPI pour la coloration des noyaux de cellules. des sections transversales entières sont ensuite balayées automatiquement à l&#39;aide d&#39;un scanner de diapositives pour obtenir composite à haute résolutionimages de l&#39;échantillon entier. Les analyses de la population des fibres sont ensuite effectuées pour quantifier les fibres lentes, intermédiaires et rapides en utilisant une macro automatique pour ImageJ. Nous avons déjà montré que cette méthode permet d&#39;identifier les populations de fibres de manière fiable à un degré de ± 4%. De plus, cette méthode réduit la variabilité inter-utilisateur et le temps par des analyses en utilisant de manière significative la plate-forme open source ImageJ.

musculaires de rat Le total des sections ont été colorées par immunohistochimie rapidement pour identifier le CMH I, IIA et IIB fibres musculaires. L&#39;utilisation d&#39;un scanner de diapositives de microscope à fluorescence, des sections transversales entières ont été acquises alors automatiquement pour fibre musculaire automatisé avec analyse ImageJ. Le concept de la procédure est basée sur la fourniture d&#39;un flux de travail simple, fiable et efficace du temps pour la quantifica...

Nous présentons ici un protocole d&#39;analyse des fibres musculaires rapides, ce qui permet une meilleure qualité de coloration, et ainsi l&#39;acquisition automatique et la quantification des populations de fibres à l&#39;aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement.

Un protocole automatisé pour l&#39;analyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

L'objectif général de cette méthode est de guider rapidement et de manière fiable la quantification des fibres musculaires dans des muscles entiers de rat de façon automatique et indépendante de l'utilisateur, en utilisant une plateforme open source. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuromusculaire concernant les défauts liés au vieillissement, aux maladies ou aux traumatismes sur les muscles squelettiques. Le principal avantage de cette technique est qu'elle peut être utilisée pour analyser de manière fiable les populations de fibres musculaires et générer des images de haute qualité de sections transversales musculaires.Après un dégel suffisant, rincez soigneusement les échantillons dans du PBS supplémenté en Triton X, ou PBST, en effectuant un lavage de dix minutes et un lavage de cinq minutes. Après le deuxième lavage, laissez sécher les sections à l'air pendant deux minutes. Ensuite, utilisez un stylo hydrophobe pour entourer individuellement les coupes transversales.Après 15 minutes supplémentaires de séchage à l'air, bloquer toute liaison non spécifique avec du PBST enrichi de sérum de chèvre pendant une heure à température ambiante. Ensuite, laver les lames et ajouter le mélange approprié d'anticorps primaires à chaque échantillon pour une coloration d'une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière. À la fin de l'incubation, rincer les lames avec un lavage de 10 minutes et un lavage de cinq minutes au PBST.Ensuite, étiquetez les sections musculaires avec le cocktail d'anticorps secondaires approprié pendant une heure, à l'abri de la lumière. Après avoir lavé les lames deux fois dans du PBST, comme indiqué, séchez les lames, puis coloriez les noyaux à l'aide d'un kit de coloration nucléaire au DAPI selon les instructions du fabricant. Éliminez l'excès de DAPI par un lavage d'une minute dans du PBST, suivi d'un séchage à l'air bref.Ensuite, recouvrez les échantillons de milieu de montage fluorescent et de lamelles, puis conservez les lames à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière. Entre 24 et 48 heures après la coloration, insérez les lames dans un numériseur de lames et ouvrez un nouveau projet dans le logiciel du programme. Pour l'aperçu de la lame, sélectionnez le canal DAPI et l'objectif 2,5x, puis faites manuellement la mise au point sur le premier spécimen.Définissez chaque coupe transversale devant être incluse pour le processus d'acquisition détaillé et réglez les temps d'exposition pour chaque canal. Lancez maintenant l'acquisition automatique des images, en vérifiant la bonne acquisition du premier champ, afin d'éviter une acquisition incorrecte en début de processus automatisé. Une fois l'acquisition des images terminée, vérifiez manuellement que la mise au point automatique des coupes transversales est correcte et que les fibres individuelles sont clairement discernables.Il est essentiel de vérifier et de corriger manuellement la mise au point automatique pour chaque image, selon les besoins. Le processus automatisé de quantification des fibres musculaires nécessite des images de haute qualité pour obtenir des résultats optimaux. Ensuite, pour chaque coupe transversale devant être incluse dans les analyses finales, exporter chaque canal sauf DAPI séparément en tant que fichiers JPEG, puis nommer et classer les fichiers dans les dossiers portant les noms appropriés selon les canaux exposés.Avant de commencer le processus de quantification des fibres musculaires, prévisualisez chaque image dans un logiciel de retouche d'image approprié afin de confirmer un contraste suffisant entre les fibres colorées et le fond. Ensuite, dans ImageJ, utilisez la commande Plugins>Macros>Edit pour afficher le code source du macro, puis modifiez le répertoire de dossier pour chaque canal dans le code source du macro. Exécutez ensuite le macro à l’aide de la commande Run.Toutes les images du dossier seront chargées dans le macro et quantifiées dans un ordre consécutif. À la fin de la quantification, exportez les résultats vers le logiciel de tableur approprié et identifiez les valeurs des fibres lentes, intermédiaires et rapides comptées positivement. Le nombre total de fibres peut alors être calculé.La coloration immunofluorescente des fibres musculaires est rapide et présente une faible réactivité croisée ; les images obtenues mettent en évidence un contraste élevé entre les fibres colorées et les tissus environnants, ainsi qu'une nette distinction entre les différents types de fibres. L'analyse automatique permet de détecter les proportions relatives des populations de fibres musculaires avec une précision de ± 4 % par rapport à l'analyse manuelle, les décomptes absolus totaux étant plus élevés qu'avec l'analyse manuelle. Les décomptes relatifs, en revanche, restent similaires, dans une fourchette de ± 4 %. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser cette méthode pour automatiser la quantification des fibres musculaires. N’oubliez pas que le travail avec le DAPI peut présenter des risques. Par conséquent, portez les équipements de protection appropriés lors de la réalisation du marquage.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Les auteurs décrivent une nouvelle technique expérimentale que nous appelons minimalement Invasive Muscle Embedding (MIME), qui repose sur la preuve que le tissu musculaire squelettique contienne des cellules myogènes viables pouvant faciliter la myogenèse donneur-cell-mediated lorsqu’elles sont implantées dans un muscle de l’hôte.

Mini-Invasive Muscle enrobage (MIME) - une nouvelle Technique expérimentale pour faciliter des donateurs-Cell-Mediated myogenèse

Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c'est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.

Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

La capacité de détecter avec précision les composants neuromusculaires de jonction est cruciale en évaluant les modifications de son architecture en raison des processus pathologiques ou développementaux. Nous présentons ici une description complète d’une méthode simple pour obtenir des images de haute qualité de jonctions neuromusculaires à montage entier qui peuvent être utilisées pour effectuer des mesures quantitatives.

Dissection des fibres musculaires squelettiques simples pour les analyses immunofluorescentes et morphométriques des jonctions neuromusculaires de mont entier

Ce protocole décrit une méthode d’analyse morphométrique des jonctions neuromusculaires par microscopie confocale et STED combinée qui est utilisée pour quantifier les changements pathologiques dans les modèles murins de SMA et de CMS liés à ColQ.

Caractérisation des jonctions neuromusculaires chez la souris par microscopie confocale et super-résolution combinée

De plus en plus de preuves indiquent qu’une infiltration excessive de lipides à l’intérieur du muscle squelettique entraîne une lipotoxicité et un diabète. Ici, nous présentons un protocole complet, y compris le traitement des tissus, la coloration avec Bodipy, l’acquisition d’images et l’analyse, pour quantifier la taille, la densité et la distribution subcellulaire des gouttelettes lipidiques d’une manière spécifique au type de fibre.

Analyse du type de fibre et de la teneur en gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique

Le protocole montre une méthode pour examiner la corrélation spatiale entre les terminaux pré-synaptiques, les récepteurs post-synaptiques et les cellules de Schwann péri-synaptiques dans le muscle gastrocnémien médian du rat en utilisant l’immunohistochimie fluorescente avec différents biomarqueurs, à savoir le neurofilament 200, le transporteur vésiculeux d’acétylcholine, l’alpha-bungarotoxine et S100.

Visualiser les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire dans le muscle gastrocnémien médian du rat

Nous présentons ici un protocole permettant d’analyser les changements de densité mitochondriale et de distribution longitudinale par imagerie des muscles squelettiques vivants à l’aide de la microscopie confocale pour le balayage du réseau mitochondrial.

Analyse de la densité mitochondriale et de la distribution longitudinale dans les fibres musculaires squelettiques vivantes du rat par microscopie confocale

Nous décrivons un protocole pour obtenir des fibres dissociées enzymatiquement de différentes longueurs et types à partir de six muscles de souris adultes : trois d’entre eux déjà décrits (fléchisseur des doigts court, extenseur des doigts long, soléaire) et trois d’entre eux dissociés avec succès pour la première fois (extenseur de l’hallucis long, péronier long, péronier des doigts quarti).

Fibres musculaires squelettiques courtes, intermédiaires et longues intactes obtenues par dissociation enzymatique de six muscles des membres postérieurs de souris : au-delà du fléchisseur digitorum brevis

Ici, nous décrivons une méthode complète pour mesurer la phosphorylation oxydative mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques perméabilisées fraîches à partir de muscles humains ou de souris. Cette méthode permet de quantifier en temps réel la respiration mitochondriale et d’évaluer la préférence pour le carburant et la flexibilité métabolique tout en préservant les réseaux mitochondriaux existants et l’intégrité de la membrane.

Mesure de la respiration mitochondriale dans les fibres musculaires squelettiques humaines et murines par respirométrie à haute résolution

Ce protocole décrit l’isolement des fibres musculaires uniques intactes du solèus oxydatif et l’établissement de cultures de myoblast hautement purifiées dérivées de ces fibres. La procédure optimisée permet de fournir de manière fiable environ 300 à 500 myofibres intactes par souris, permettant des analyses moléculaires et cellulaires en aval.

Essai d’isolation à fibre unique pour l’évaluation du comportement des myofibres oxydatives

Découvrez une méthode automatisée pour quantifier les populations de fibres musculaires chez le rat par immunohistochimie de la chaîne lourde de myosine. Ce protocole réduit le temps d'analyse et la variabilité inter-utilisateur.

Un protocole automatisé pour lanalyse rapide de la population de fibre musculaire chez le rat Muscle Sections Cross Utilisation myosine chaîne lourde immunohistochimie (Vidéo) | JoVE Journal

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