Name: Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Découvrez l'isolement et la caractérisation des macrophages résidents dans les tissus inflammatoires liés à l'obésité. Cette méthode optimise l'obtention de suspensions unicellulaires à partir du foie pour étudier les maladies inflammatoires chroniques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier le Flow Cytometry Core Facility à The Pennsylvania State Université millénaire Science complexe.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li>
<li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+with+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease.</a> Nature. 444 (12), 875-880 (2006).</li>
<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
<li>Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li>
<li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation+%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+at+the+fork+in+the+road+to+health+or+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages at the fork in the road to health or disease.</a> Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).</li>
<li>Italiani, P., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+monocytes+to+M1%2FM2+macrophages%3A+Phenotypical+vs.+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation.</a> Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).</li>
<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+of+white+adipose+tissue+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).</li>
<li>Fujisaka, S., Usui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+for+Adipose+Tissue+M1+and+M2+Macrophages+in+Diet+Induced+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice.</a> Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotipic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Qureshi, K., Abrams, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+of+obesity+and+role+of+adipose+tissue+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).</li>
<li>Bedossa, P., Paradis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+extracellular+matrix+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver extracellular matrix in health and disease.</a> J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).</li>
<li>Tilg, H., Moschen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammation+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+The+multiple+parallel+hits+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis.</a> Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).</li>
<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+atherosclerosis+and+the+vascular+endothelium%3A+mechanisms+of+reduced+nitric+oxide+bioavailability+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obesity%22%5BJournal%5D)">Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans.</a> Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).</li>
<li>Mestas, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis.</a> Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/ni/journal/v14/n10/full/ni.2705.html">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+Identification%2C+and+Excision+of+Murine+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots.</a> J Vis Exp. (94), e52174(2014).</li>
<li>Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://munin.uit.no/handle/10037/4575">http://munin.uit.no/handle/10037/4575</a> 1-10 (2012).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. <a target="_blank" href="http://www.aidic.it/cet/14/38/042.pdf">Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II.</a> Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Free+Brown+and+White+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Isolation of Free Brown and White Fat Cells.</a> Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).</li>
<li>Seglen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yu, S., Allen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity%2C+Atherosclerosis%2C+and+Hepatosteatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+%26%2334%3BM2c%26%2334%3B+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires &#34;M2c&#34; polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).</li>
<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
<li>Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24480353">Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages.</a> Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).</li>
<li>Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Modèles de trouble métabolique induite par l’alimentation qui imitent des co-morbidités telles que l’athérosclérose, la stéatose simple, stéato-hépatite et diabète de type 2 sont largement utilisés pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de la progression de la maladie. La charge digestion de collagénase est souvent utilisée pour dissocier les tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire (ECM)16,27. Enzymes comme la collag...

Modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier la dynamique des maladies humaines. Isolation correcte des cellules résidentes des souris dans un état de malade peut fournir une plate-forme pour comprendre les contributions moléculaires et cellulaires à la pathogenèse de la maladie1. Un trouble qui est d’une importance cruciale est l’obésité. L’incidence de l’obésité continue d’augmenter dans le monde entier en parallèle avec la résistance à l’insuline et le type 2 mellitus de diabète, maladies cardiovasculaires et stéatose hépatique2,3. Une consommation excessive en éléments nutritifs est plus biaisée par la diminution de l’activité physique déclenchant des signaux altérés provenant du tissu adipeux, ce qui peut modifier le milieu cellulaire des autres tissus périphériques tels que l' aorte et le foie4. Ces perturbations de l’homéostasie métabolique se traduit par une inflammation systémique de chroniques de bas grade5.
Classique activation des macrophages résidents à l’aorte et du foie ainsi que leur recrutement dans le tissu adipeux blanc (WAT) s’est avérée non seulement lancer le dérèglement des signaux métaboliques mais également soutenir l’inflammation6,7. L’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle des macrophages est fortement liée à la pathogenèse de l’obésité des comorbidités7. La plasticité dynamique en polarisation macrophage permet ces cellules présentent un éventail des phénotypes activés qui coordonnent la progression et la résolution de l’inflammation,8. Tandis que les macrophages activés de façon classique (M1) sont impliqués dans la propagation de l’inflammation, alternativement activés macrophages (M2) ont été associés à la résolution et le tissu réparation9,10.
Comme le corps subit des stress métabolique, le tissu adipeux blanc s’accumule anormalement. Le tissu adipeux élargi attire et retient les cellules inflammatoires qui modifient profondément les fonction d’adipocyte normal pour favoriser la résistance à l’insuline, hyperglycémie et diabète de type 2 en fin de compte, insulinorésistance ou hyperglycémie11, 12. En parallèle, le tissu adipeux blanc remodèle en réponse à des signaux inflammatoires libérés par infiltré classiquement activés (M1) du tissu adipeux macrophages (ATMs)13,14. Cet organe multicellulaire exerce une cascade de signaux qui déraille la fonction normale des autre organes du corps humain tels que l’aorte et du foie4.
Le foie est un puissant métabolique qui s’adapte en réponse à des stimuli provenant du voisin dysrégulation WAT15. Macrophages hépatiques ou des cellules de Kupffer, en réponse à des changements métaboliques, sécrètent des cytokines inflammatoires qui transforment les deux parenchymateuses et phénotype cellulaire non parenchymateuses et promouvoir le remodelage tissulaire. Accumulation de lipides hépatiques, inflammation, dépôts excessifs de la matrice extracellulaire, nécrose et fonction éventuelle perte suit les insultes inflammatoires qui contribuent à la vaste gamme d’atteinte hépatique associées non alcoolisées stéatose hépatique 16,17,18.
Parallèlement au WAT compromise et la fonction hépatique, grosses artères s’accumulent des lipides dans la paroi artérielle que le corps subit un stress métabolique chronique19. Accumulation de lipides artérielle déclenche la sécrétion de chimiokines par les cellules endothéliales activées et le recrutement des monocytes20. Une fois recrutés, monocytes prolifèrent, se différencient, ingèrent des lipoprotéines et deviennent des cellules spumeuses. Athérogenèse est initiée et soutenue par l’activité pro-inflammatoire des recrutés et les tissus résident macrophages chargés de lipides. Succomber aux signaux extracellulaires et intracellulaires stress relayés dans ce micro-environnement athérogène, ces macrophages puis s’engager dans une apoptose cascade de signalisation. Comme ces cellules meurent, elles contribuent à leur teneur en lipides rempli au noyau nécrotique de la lésion, ce qui mène à la rupture de plaque, infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral.
Collectivement, l’hétérogénéité des phénotypes macrophage orchestre en partie l’obésité induite par les changements inflammatoires observées dans les tissus de dysrégulation tels que WAT, foie et aorte8,21. Caractérisation des recrutés et macrophages résident tissulaires pourraient donner un aperçu de potentielles cibles moléculaires qui manipulent des macrophages phénotype1. Afin de caractériser efficacement les macrophages des tissus enflammés induites par l’obésité, une suspension de cellules individuelles peut être obtenue par digestion enzymatique. Ces protocoles de dissociation doivent être efficaces dans la dégradation suffisamment de tissu conjonctif tout en minimisant la mort des cellules immunitaires et fournir le rendement cellulaire optimal. Le mélange d’enzymes est dépendant du type de tissu et son maquillage structurelle. Tissus résistants tels que l’aorte nécessite plus forte activité enzymatique, par rapport au foie et WAT, pour atteindre la dissociation tissulaire. De la suspension monocellulaire, macrophages résident tissulaires peuvent être sans ambiguïté caractérise ou isolés pour approfondir les analyses en aval comme le profilage transcriptionnel.
Ici est décrit un protocole tissu-spécifique qui utilise la digestion de collagénase dépendant des tissus et cytométrie polychromatique pour effectivement isoler et de caractériser des macrophages de tissu-résident provenant du régime alimentaire traditionnel induites par l’obésité, l’athérosclérose, simple stéatose et stéato-hépatite modèles murins. Simultanée de la coloration des marqueurs de surface de cellules avec des anticorps dirigés contre les leucocytes-(CD45 et/ou CD11b) et macrophage - antigènes spécifiques (F4/80) est souvent utilisé pour identifier les populations de macrophage22. Cellule activée par fluorescence triant (FACS) est une stratégie puissante permet de trier ces populations identifiées à haute pureté. La population triée peut ensuite être évaluée pour profils de gènes spécifiques de phénotype à l’aide de l’analyse moléculaire en aval (par exemple la PCR quantitative en temps réel)23. Bien que standard cytométrie en flux et tri de cellule axée sur la cytométrie en flux sont des outils puissants pour distinguer les macrophages dans une suspension de cellules très hétérogène, anciens protocoles doivent être optimisés pour assurer une sortie réussie. Dans cette étude, les protocoles qui effectivement isoler et caractérisent les macrophages des tissus viables sont décrits ; plus important encore, cette étude donne un aperçu crucial de questions techniques qui se posent souvent, ainsi que des stratégies proactives et dépannage afin d’éviter et/ou de les résoudre.

<table><tbody><tr><td>Aiguilles de 26 g x 5/8 po BD</td><td></td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 g x aiguille de 0,75 po tube de 12 po Kit de prélèvement sanguin</td><td>BD</td><td>367297</td><td>Utilisé pour la canulation de la VCI sous-hépatique pendant la perfusion hépatique</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 po. Aiguilles</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 1 mL avec butées en caoutchouc</td><td>309659</td><td></td> seringues BD 309604 <td></td></tr><tr><td></td><td>10 mL</td><td></td> Seringue BD 309659 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32 Fc Block&nbsp ;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Bleu Pacifique</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Rat IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Hamster arménien IgG Biolegend</td><td></td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Rat IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Rat bleu du Pacifique IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)&nbsp ;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu ; Crépines à cellules m</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Tube de microcentrifugation de 1,7 mL</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde -16x</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Micro ciseaux de dissection, 3,5 pouces, droit, 23 mm, pointu ;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Utilisé à des fins générales de dissection</td></tr><tr><td>Micro pince, 4 pouces, pleine courbure, 0,8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp ;</td><td>Utilisé à des fins générales de dissection</td></tr><tr><td>Ciseaux de dissection à ressort &ndash ; 3 mm Tranchant&nbsp ;</td><td>Outil de science fine</td><td>15000-10</td><td>Utilisé pour la dissection de l’aorte Étapes 1.3.3.17 à 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Courbée 0,07 mm x 0,04 mm Pointe Pince</td><td>Outil de science fine</td><td>11297-10</td><td>Utilisé pour la dissection de l’aorte Étapes 1.3.3.17 à 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Pince hémostatique (courbée)</td><td>Outil de science fine</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Sel de sodium</td><td>Fischer Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de culture cellulaire/de Petri de 35 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en polystyrène (10 cm) avec couvercle</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger coniques de 15 mL (polypropylène)</td>Tubes à centrifuger coniques <td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>de 50 mL&nbsp ;( Polypropylène)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubes en polystyrène à fond rond</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Gemini Bio-produits</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol (alcool éthylique de base dénaturé, anyhydre)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase de type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>500 mL bécher&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>4 cm Pince hémostatique</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Pince dentée</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu ; m Filtres jetables</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase Type IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td> 17104019 Chlorure <td>d’ammonium</td><td></td></tr><tr><td>de potassium (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp ;</td><td></td><td>Rasoirs A1049201</td></tr><tr><td>(0,22 mm (0,009"))VWR</td> <td>International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Live/Dead stain</td><td></td><td></td><td>Red viability stain (en Figure 1A)</td></tr></tbody></table>

isolement, caractérisation et purification des macrophages dans les tissus touchés par l’inflammation associées à l’obésité

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

L’obésité favorise un état inflammatoire chronique qui est largement médiatisé par les macrophages tissulaires-résident ainsi que les macrophages dérivés de monocytes. L’obésité induite par l’alimentation (DIO) est un modèle précieux pour l’étude du rôle de l’hétérogénéité des macrophages ; Cependant, des isolations de macrophage adéquates sont difficiles à acquérir à partir de tissus enflammés. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes de l’isolement et les directives de dépannage nécessaires provenant de nos études pour obtenir une population convenable des macrophages de tissu-résident de souris après 18 semaines de haute teneur en graisses (HFD) ou de la haute-graisse/riche en cholestérol ( Intervention HFHCD) de régime. Ce protocole se concentre sur trois tissus de hallmark étudiés dans l’obésité et l’athérosclérose y compris le foie, le tissu adipeux blanc (WAT) et l’aorte. Nous mettons en évidence l’utilisation comment dualiste de l’écoulement cytometry peut atteindre une nouvelle dimension de l’isolement et la caractérisation des macrophages de tissu-résident. Un article fondamental du présent protocole aborde les subtilités qui sous-tendent les digestions enzymatiques spécifiques des tissus et l’isolement de macrophage et ultérieures anticorps de surface cellulaire coloration pour cytométrie. Ce protocole traite des complexités existantes qui sous-tendent la cellule activée par fluorescence triant (FACS) et présente des éclaircissements à ces complexités afin d’obtenir la caractérisation de la vaste gamme de populations cellulaires correctement trié. Méthodes d’enrichissement de rechange sont inclus pour le tri des cellules, comme le foie dense, permettant la gestion de la flexibilité et l’heure lorsque vous travaillez avec des FACS. En bref, ce protocole facilite le chercheur pour évaluer l’hétérogénéité des macrophages d’une multitude de tissus enflammés dans une étude donnée et fournit des conseils de dépannage perspicaces qui ont réussi pour la caractérisation et l’isolement cellulaire favorable des cellules immunitaires dans l’inflammation induite par la DIO.

Lorsque vous utilisez la souris C57BL/6 (ApoE KO) (BL6) déficientes en apolipoprotéine E, soumis à une diète de haute graisse cholestérol élevé (HCHFD ou HCD) pendant 18 semaines, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ de F4/80 macrophages aortiques peuvent être isolés, lorsque les deux échantillons sont mis en commun. Les foies disséqués des souris nourries HFHCD ApoE KO, produit plus de 5 x 105 trier des cellules de Kupffer (qui dépend des temps ...

Ce protocole permet un chercheur d’isoler et de caractériser les tissus-résident hallmark de macrophages dans divers tissus enflammés extraites de modèles induite par le régime alimentaire des troubles métaboliques.

Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de caractériser efficacement les macrophages à partir de tissus fréquemment affectés par une inflammation induite par l'alimentation, tels que le foie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et de l'inflammation concernant la manière dont le phénotype des macrophages résidents du tissu peut déterminer l'évolution des maladies inflammatoires chroniques. Le principal avantage de cette approche réside dans l'optimisation des étapes d'isolement nécessaires à l'obtention de suspensions monocellulaires provenant de tissus affectés par une inflammation chronique de bas grade médiée par l'obésité.La procédure sera démontrée par Joselyn Allen, étudiante diplômante de mon laboratoire. Pour isoler le foie, placez d'abord une souris imbibée d'éthanol en position dorsale sur une planche de dissection en mousse de polystyrène et fixez les pattes antérieures et postérieures. Ensuite, utilisez une pince à pointe moyenne pour saisir la peau abdominale près de l'orifice urétral et utilisez des ciseaux de dissection pointus pour pratiquer une petite incision dans la peau soulevée.Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l'incision entre la peau et le péritoine et pratiquez une incision latérale allant de l'aine jusqu'au menton. Écartez doucement la peau pour exposer la cavité péritonéale intacte ainsi que la paroi thoracique, puis effectuez une incision latérale à travers le péritoine. Soulevez le sternum et incisez soigneusement le diaphragme.Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux sur le côté et repérez la veine cave inférieure sous-hépatique ou VCI. À l’aide de pinces hémostatiques, serrez la VCI sus-hépatique afin de maintenir une perfusion localisée, puis fixez une seringue remplie de tampon de perfusion préchauffé à un ensemble de prélèvement et d’infusion sanguin de calibre 23. Appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que les tubulures et l’aiguille soient remplies de tampon de perfusion, puis insérez l’aiguille parallèlement à la veine cave inférieure sous-hépatique.Une canulation correcte de la VCI assure une distribution localisée du tampon de dissociation dans tout le foie et les tissus périphériques, optimisant ainsi la digestion des tissus. Utilisez une pince hémostatique de quatre centimètres pour fixer l'aiguille en place et appuyez doucement sur le piston pour commencer la perfusion. Si l'aiguille est correctement positionnée, la couleur disparaîtra rapidement du foie et les lobes s'agrandiront. Couper rapidement la veine porte pour permettre au tampon de perfusion de circuler librement à travers le foie, en massant occasionnellement les lobes entre le pouce et l'index pour faciliter l'élimination du sang. Lorsqu'il ne reste que cinq millilitres de tampon de perfusion, remplacer la seringue de tampon de perfusion par une seringue remplie de tampon de dissociation préchauffé, continuer à masser doucement les lobes et à perfuser le foie jusqu'à ce qu'il soit complètement digéré. Confirmer une digestion réussie en appuyant délicatement le bord émoussé d'une pince sur le lobe latéral gauche.Une empreinte devrait apparaître à la surface et se remplir lentement une fois la pince retirée. Ensuite, retirez l'aiguille et utilisez une lame droite courte provenant d'une paire de ciseaux de dissection pour couper délicatement les ligaments connectifs afin d'exciser l'ensemble du foie et de la vésicule biliaire. Transférez le foie dans une boîte de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM glacé et utilisez une pince dentelée pour saisir la VCI suprahépatique sectionnée.À l’aide de pinces moyennes, appliquer un mouvement de frottement rapide sur chaque lobe afin de libérer les cellules de la capsule de Glisson, puis faire passer le DMEM saturé à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace. Un rendement élevé de cellules viables ne peut être obtenu qu’en dissociant correctement les cellules hépatiques de la capsule de Glisson. Une fois toutes les cellules recueillies, retourner le tube pour mélanger doucement la suspension cellulaire, puis mettre les cellules en pellet par centrifugation.Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour trois autres centrifugations à faible vitesse. Après la dernière centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et centrifugez les cellules une fois supplémentaire à une vitesse plus élevée. Resuspendez ensuite le culot de cellules non parenchymateuses dans du tampon FACS pour le comptage, puis diluez les cellules hépatiques à la concentration appropriée selon leur application en aval, dans des tubes étiquetés de 5 millilitres à fond rond en polystyrène.Les souris nourries avec un régime riche en graisses ou un régime riche en graisses et en cholestérol présentent une infiltration accrue de macrophages M1 classiquement activés dans les tissus affectés, tels que l'aorte. Les macrophages aortiques exprimant le récepteur RON, positifs pour CD45 et F4/80, qui présentent un phénotype anti-inflammatoire, sont réduits chez les souris nourries avec un régime riche en graisses et en cholestérol, tandis que les macrophages pro-inflammatoires, positifs pour CD45, F4/80 et CD11c, sont présents en nombre accru dans les aortes isolées de ces animaux. De plus, les macrophages triés exprimant le récepteur RON, obtenus à partir d'aortes digérées, montrent une expression accrue du gène Arginase 1, un marqueur bien établi des macrophages M2.En effet, la caractérisation des macrophages résidents du foie révèle un phénotype prédominant de sous-populations exprimant le récepteur RON, les populations de macrophages pro-inflammatoires positives pour CD11c montrant une diminution de l'expression des gènes fortement associés au phénotype anti-inflammatoire M2. Des tendances similaires sont observées dans les populations de macrophages isolées à partir de tissu adipeux blanc digéré, les macrophages à phénotype pro-inflammatoire présentant une expression réduite à la surface cellulaire du récepteur RON. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes par animal si elle est effectuée correctement.Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la cytométrie en flux, le tri cellulaire par fluorescence activée et/ou la PCR quantitative peuvent être réalisées afin de caractériser davantage le phénotype des macrophages tissulaires résidents issus du foie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler correctement les macrophages tissulaires résidents à partir de foies malades. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

L'article décrit une adaptation facile...

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

Le tissu adipeux (AT) est un site d'activation intense des cellules immunitaires et de l'interaction. Presque toutes les cellules du système immunitaire sont présents dans A et leurs rapports sont modifiés par l'obésité. Une bonne isolation, la quantification et la caractérisation des AT populations de cellules immunitaires sont essentielles pour la compréhension de leur rôle dans la maladie immunometabolic.

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Les macrophages sont les cellules clés impliquées dans la pathogénicité de l’hôte. Les macrophages présentent une diversité phénotypique et fonctionnelle qui peut être analysée et détectée par analyse protéomique. Cet article décrit comment réaliser l’électrophorèse 2D de cultures primaires de macrophages humains différenciés en phénotype M1 ou M2.

Protéomique profilage des macrophages par électrophorèse 2D

Nous décrivons ici un protocole simple pour isoler les macrophages péritonéaux murins. Cette procédure est suivie d’une extraction de l’ARN pour effectuer une analyse de l’expression génique lors de la stimulation des récepteurs de type Toll.

Isolement d&#39;anticorps murins péritonéale macrophages pour effectuer Analyse expression génique Sur Toll-like récepteurs Stimulation

Cet article décrit une méthode pour analyser le contenu de la cellule immunitaire du tissu adipeux par l’isolement de cellules immunitaires dans le tissu adipeux et l’analyse ultérieure à l’aide de cytométrie en flux.

Caractérisation des cellules immunitaires dans les tissus adipeux humains à l’aide de cytométrie en flux

Nous présentons un protocole visant à obtenir les signatures de protéomique des macrophages humains et cela s’applique à la détermination de l’impact d’un environnement pauvre en oxygène sur la polarisation de macrophages.

Analyse protéomique de polarisation des macrophages humains dans un environnement pauvre en oxygène

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Découvrez l'isolement et la caractérisation des macrophages résidents dans les tissus inflammatoires liés à l'obésité. Cette méthode optimise l'obtention de suspensions unicellulaires à partir du foie pour étudier les maladies inflammatoires chroniques.

Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

Explorer plus de vidéos