Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de caractériser efficacement les macrophages à partir de tissus fréquemment affectés par une inflammation induite par l'alimentation, tels que le foie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l'immunologie et de l'inflammation concernant la manière dont le phénotype des macrophages résidents du tissu peut déterminer l'évolution des maladies inflammatoires chroniques. Le principal avantage de cette approche réside dans l'optimisation des étapes d'isolement nécessaires à l'obtention de suspensions monocellulaires provenant de tissus affectés par une inflammation chronique de bas grade médiée par l'obésité.

La procédure sera démontrée par Joselyn Allen, étudiante diplômante de mon laboratoire. Pour isoler le foie, placez d'abord une souris imbibée d'éthanol en position dorsale sur une planche de dissection en mousse de polystyrène et fixez les pattes antérieures et postérieures. Ensuite, utilisez une pince à pointe moyenne pour saisir la peau abdominale près de l'orifice urétral et utilisez des ciseaux de dissection pointus pour pratiquer une petite incision dans la peau soulevée.

Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l'incision entre la peau et le péritoine et pratiquez une incision latérale allant de l'aine jusqu'au menton. Écartez doucement la peau pour exposer la cavité péritonéale intacte ainsi que la paroi thoracique, puis effectuez une incision latérale à travers le péritoine. Soulevez le sternum et incisez soigneusement le diaphragme.

Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux sur le côté et repérez la veine cave inférieure sous-hépatique ou VCI. À l’aide de pinces hémostatiques, serrez la VCI sus-hépatique afin de maintenir une perfusion localisée, puis fixez une seringue remplie de tampon de perfusion préchauffé à un ensemble de prélèvement et d’infusion sanguin de calibre 23. Appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que les tubulures et l’aiguille soient remplies de tampon de perfusion, puis insérez l’aiguille parallèlement à la veine cave inférieure sous-hépatique.

Une canulation correcte de la VCI assure une distribution localisée du tampon de dissociation dans tout le foie et les tissus périphériques, optimisant ainsi la digestion des tissus. Utilisez une pince hémostatique de quatre centimètres pour fixer l'aiguille en place et appuyez doucement sur le piston pour commencer la perfusion. Si l'aiguille est correctement positionnée, la couleur disparaîtra rapidement du foie et les lobes s'agrandiront.

Couper rapidement la veine porte pour permettre au tampon de perfusion de circuler librement à travers le foie, en massant occasionnellement les lobes entre le pouce et l'index pour faciliter l'élimination du sang. Lorsqu'il ne reste que cinq millilitres de tampon de perfusion, remplacer la seringue de tampon de perfusion par une seringue remplie de tampon de dissociation préchauffé, continuer à masser doucement les lobes et à perfuser le foie jusqu'à ce qu'il soit complètement digéré. Confirmer une digestion réussie en appuyant délicatement le bord émoussé d'une pince sur le lobe latéral gauche.

Une empreinte devrait apparaître à la surface et se remplir lentement une fois la pince retirée. Ensuite, retirez l'aiguille et utilisez une lame droite courte provenant d'une paire de ciseaux de dissection pour couper délicatement les ligaments connectifs afin d'exciser l'ensemble du foie et de la vésicule biliaire. Transférez le foie dans une boîte de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM glacé et utilisez une pince dentelée pour saisir la VCI suprahépatique sectionnée.

À l’aide de pinces moyennes, appliquer un mouvement de frottement rapide sur chaque lobe afin de libérer les cellules de la capsule de Glisson, puis faire passer le DMEM saturé à travers un tamis cellulaire de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres placé sur de la glace. Un rendement élevé de cellules viables ne peut être obtenu qu’en dissociant correctement les cellules hépatiques de la capsule de Glisson. Une fois toutes les cellules recueillies, retourner le tube pour mélanger doucement la suspension cellulaire, puis mettre les cellules en pellet par centrifugation.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour trois autres centrifugations à faible vitesse. Après la dernière centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et centrifugez les cellules une fois supplémentaire à une vitesse plus élevée. Resuspendez ensuite le culot de cellules non parenchymateuses dans du tampon FACS pour le comptage, puis diluez les cellules hépatiques à la concentration appropriée selon leur application en aval, dans des tubes étiquetés de 5 millilitres à fond rond en polystyrène.

Les souris nourries avec un régime riche en graisses ou un régime riche en graisses et en cholestérol présentent une infiltration accrue de macrophages M1 classiquement activés dans les tissus affectés, tels que l'aorte. Les macrophages aortiques exprimant le récepteur RON, positifs pour CD45 et F4/80, qui présentent un phénotype anti-inflammatoire, sont réduits chez les souris nourries avec un régime riche en graisses et en cholestérol, tandis que les macrophages pro-inflammatoires, positifs pour CD45, F4/80 et CD11c, sont présents en nombre accru dans les aortes isolées de ces animaux. De plus, les macrophages triés exprimant le récepteur RON, obtenus à partir d'aortes digérées, montrent une expression accrue du gène Arginase 1, un marqueur bien établi des macrophages M2.

En effet, la caractérisation des macrophages résidents du foie révèle un phénotype prédominant de sous-populations exprimant le récepteur RON, les populations de macrophages pro-inflammatoires positives pour CD11c montrant une diminution de l'expression des gènes fortement associés au phénotype anti-inflammatoire M2. Des tendances similaires sont observées dans les populations de macrophages isolées à partir de tissu adipeux blanc digéré, les macrophages à phénotype pro-inflammatoire présentant une expression réduite à la surface cellulaire du récepteur RON. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes par animal si elle est effectuée correctement.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la cytométrie en flux, le tri cellulaire par fluorescence activée et/ou la PCR quantitative peuvent être réalisées afin de caractériser davantage le phénotype des macrophages tissulaires résidents issus du foie. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler correctement les macrophages tissulaires résidents à partir de foies malades. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.