Isolement, caractérisation et Purification des Macrophages dans les tissus touchés par l’Inflammation associées à l’obésité

L’objectif global de cette procédure est d’isoler et de caractériser efficacement les macrophages des tissus couramment affectés par l’inflammation induite par l’alimentation, tels que le foie. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’immunologie et de l’inflammation sur la façon dont le phénotype des macrophages résidents dans les tissus peut dicter la progression des maladies inflammatoires chroniques. Le principal avantage est que la procédure optimise les étapes d’isolement nécessaires à l’obtention de suspensions unicellulaires dérivées de tissus touchés par l’inflammation chronique de bas grade médiée par l’obésité.

Joselyn Allen, une étudiante diplômée de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour isoler le foie, placez d’abord une souris imbibée d’éthanol en position couchée sur une planche de dissection en mousse de polystyrène et fixez les pattes avant et arrière. Ensuite, utilisez une pince à pointe moyenne pour saisir la peau abdominale près de l’ouverture de l’urètre et utilisez des ciseaux de dissection tranchants pour créer une petite incision dans la peau en relief.

Insérez la lame inférieure des ciseaux dans l’incision entre la peau et le péritoine et faites une incision latérale de l’aine au menton. Tirez doucement la peau vers l’arrière pour exposer la cavité péritonéale et la paroi thoracique intactes et faites une incision latérale à travers le péritoine. Soulevez le sternum et incisez soigneusement le diaphragme.

Ensuite, déplacez les organes gastro-intestinaux sur le côté et localisez la veine cave inférieure sous-hépatique ou VCI. À l’aide d’une pince hémostatique, clampez la VCI suprahépatique pour maintenir une perfusion localisée et fixez une seringue remplie d’un tampon de perfusion préchauffé à un ensemble de prélèvement et de perfusion de sang de calibre 23. Appuyez doucement sur le piston jusqu’à ce que la tubulure et l’aiguille soient remplies de tampon de perfusion et insérez l’aiguille parallèlement à la VCI sous-hépatique.

Une canulation correcte de l’IVC garantit que le tampon de dissociation est distribué localement dans le foie et les tissus périphériques, optimisant ainsi la digestion des tissus. Utilisez une pince hémostatique de quatre centimètres pour fixer l’aiguille en place et appuyez doucement sur le piston pour commencer la perfusion. Si l’aiguille est correctement positionnée, la couleur s’écoulera rapidement du foie et les lobes s’élargiront.

Coupez rapidement la veine porte pour permettre au tampon de perfusion de circuler librement dans le foie, en massant de temps en temps doucement les lobes entre le pouce et l’index pour faciliter l’élimination du sang. Lorsqu’il ne reste que cinq millilitres de tampon de perfusion, remplacez la seringue de tampon de perfusion par une seringue remplie d’un tampon de dissociation préchauffé, en continuant à masser doucement les lobes et à perfuser le foie jusqu’à ce qu’il soit complètement digéré. Confirmez une digestion réussie en appuyant doucement le bord émoussé d’une paire de pinces dans le lobe latéral gauche.

Une indentation doit apparaître sur la surface qui se remplit lentement une fois la pince retirée. Retirez ensuite l’aiguille et utilisez une courte lame droite d’une paire de ciseaux de dissection pour couper soigneusement les ligaments de connexion afin d’exciser tout le foie et la vésicule biliaire. Transférez le foie dans une boîte de 10 centimètres contenant 10 millilitres de DMEM glacé et utilisez une pince dentée pour saisir la VCI suprahépatique sectionnée.

À l’aide d’une pince à pointe moyenne, appliquez un mouvement de caresse rapide à chaque lobe pour libérer les cellules de la capsule de Glisson et faites passer le DMEM saturé à travers une crépine de cellules de 70 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres sur de la glace. Des rendements élevés de cellules viables ne peuvent être obtenus qu’en dissociant correctement les cellules hépatiques de la capsule de Glisson. Lorsque toutes les cellules ont été collectées, retournez le tube pour mélanger doucement la suspension cellulaire et granulez les cellules par centrifugation.

Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres pour trois autres centrifugations à faible spin. Après la dernière centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 50 millilitres et centrifugez les cellules une fois de plus à une vitesse plus élevée. Ensuite, mettez en suspension la pastille de cellules non parenchymateuses dans un tampon FACS pour le comptage et diluez les cellules hépatiques à la concentration appropriée en fonction de leur application en aval dans des tubes de polystyrène à fond rond de cinq millilitres étiquetés.

Les souris nourries avec un régime riche en graisses ou un régime riche en graisses et en cholestérol présentent une infiltration accrue de macrophages M1 classiquement activés dans les tissus affectés tels que l’aorte. Les macrophages Aortic F4/80 positifs au récepteur RON exprimant CD45 positifs, qui présentent un phénotype anti-inflammatoire, sont diminués chez les souris nourries avec un régime riche en graisses et en cholestérol, tandis que les macrophages CD45 positifs et CD11c positifs aux CD45 positifs et pro-inflammatoires sont trouvés en nombre accru dans les aortes isolées de ces animaux. De plus, les macrophages exprimant le récepteur RON trié dérivés d’aortes digérées présentent une expression accrue du gène de l’arginase 1, un marqueur de macrophage M2 bien établi.

En effet, la caractérisation des macrophages résidant dans le foie révèle le phénotype dominant des sous-populations exprimant le récepteur RON avec des populations de macrophages pro-inflammatoires CD11c positifs démontrant une expression réduite des gènes fortement associés au phénotype M2 anti-inflammatoire. Des tendances similaires sont observées dans les populations de macrophages isolés à partir de tissu adipeux blanc digéré avec des populations de macrophages de phénotype pro-inflammatoire présentant une diminution de l’expression de surface du récepteur RON. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 20 à 30 minutes par animal si elle est bien exécutée.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la cytométrie en flux, le tri cellulaire activé par fluorescence et/ou la PCR quantitative peuvent être effectuées pour caractériser davantage le phénotype des macrophages résidants dans les tissus dérivés du foie isolés. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler correctement les macrophages résidents des tissus des foies malades. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.