Séquençage de l'ARN

Séquençage de RNA ou RNA-seq, est une technique qui peut fournir des informations sur la séquence et la quantité de chaque ARN exprimé, connu comme le « transcriptome, » dans une population de cellules. Contrairement à d’autre méthodes telles que des puces à ADN, qui impliquent des séquences d’ARN connues de détection, de profilage de l’expression RNA-seq pouvez profiler l’expression des gènes d’organismes avec les génomes non séquencés. En outre, RNA-seq peut mesurer avec exactitude un plus large éventail de niveaux d’expression de transcription que les puces à ADN, en particulier à des niveaux très faibles ou très élevés.

Cette vidéo couvre les principes de la RNA-seq, un protocole pour la préparation d’une bibliothèque de RNA-seq et analyse les données et quelques applications de cette technique.

Tout d’abord, passons en revue quelques principes derrière RNA-Seq. Transcriptome séquencement nécessite d’isoler une population de transcriptions dont les niveaux sont à mesurer. La plupart des ARN dans les cellules est l’ARN ribosomal ou ARNr, l’élément central des machines la production de protéines de la cellule. Pour faciliter la récupération des autres types de transcriptions, ARNr est généralement retiré avant le séquençage par hybridation de l’échantillon à des oligonucléotides complémentaires attachés à magnétique perles et en utilisant un aimant à séparer du reste de l’échantillon de l’ARNr.

Par ailleurs, une population spécifique de l’ARN peut être sélectionnée pour le séquençage. Par exemple, codant pour des protéines des ARN messager ou ARNm, peut être capturées avec « oligo-dT » — courts tronçons de nucléotides désoxy-T qui se lient à la séquence des bases d’un connu comme une queue poly-A à la fin de ces transcriptions. L’ARNr contaminantes est ensuite retiré. Micro-ARN, qui sont 22 nucléotides RNAs réglementaires, peut être sélectivement isolés pour le séquençage selon leur taille. Parce que l’ARN est intrinsèquement sujette à la dégradation, il est premier ADN transcrit à double brin inverse.

Les séquences oligonucléotidiques appelés adaptateurs sont ensuite ligaturés sur les fragments d’ADN. Les adaptateurs contiennent des régions constantes qui servent de sites de liaison du primer pour l’amplification PCR ultérieure, et ceux-ci sont généralement asymétriques afin de préserver la « présence » du modèle. Les adaptateurs contiennent également des séquences uniques, appelés « codes barres », qui identifient tous les fragments provenant d’un seul échantillon. La bibliothèque est alors amplifiée par PCR.

Une puce de séquençage, dans lesquelles se trouvent des oligonucléotides complémentaires sur les adaptateurs, est utilisée pour immobiliser l’exemple de la bibliothèque, qui est dilué tel que les molécules d’ADN recuisent sur la puce à faible densité. L’ADN est amplifié sur la puce via un processus appelé « amplification de pont » pour former « grappes clonales. » Courts fragments, chaque bases de 30-150 de long, sont ensuite synthétisés à partir un ou aux deux extrémités de ces modèles d’ADN, générant des centaines de millions de produits appelés séquençage lectures.

Les résultats de séquençage sont ensuite analysées pour la qualité et les données sont traitées. L’analyse des séquences peut révéler une grande variété d’information, y compris des différences dans les niveaux d’expression d’ARN entre les échantillons et les transcriptions inédites ou formes de transcriptions.

Maintenant que nous avons vu comment fonctionne le RNA-seq, Let ' s go via un protocole pour la préparation d’une bibliothèque de RNA-seq et analyse des données de séquence. RNA provient tout d’abord de l’échantillon, et sa qualité est contrôlée par électrophorèse, par exemple en utilisant un dispositif microfluidique appelé un bioanalyzer. L’ARN doit être de haute qualité pour les résultats du séquençage précis. Pour s’assurer de l’absence de contamination de l’ADN, RT-PCR pour un gène exprimé est réalisée avec ou sans la transcriptase inverse. Il ne devrait y avoir aucun produit en l’absence de la transcriptase inverse.

Pour sélectionner l’ARN polyA, les échantillons sont liés aux sondes oligo-dT joint à billes magnétiques. L’ARN sélectionné est fragmenté en morceaux 200 nucléotides à haute température en présence d’ions magnésium, réduisant la longueur dépendant des biais dans les analyses et les réactions subséquentes. Les fragments sont ensuite convertis en ADN bicaténaire et adaptateurs sont ligaturés. La bibliothèque est amplifiée par PCR, et sa qualité est vérifiée sur un bioanalyzer et en effectuant de qPCR. Les résultats de bioanalyzer devraient révéler un maximum de produits à la taille attendue basé sur la taille de fragment moyenne et la longueur de l’adaptateur.

Bibliothèques d’échantillons différents, contenant barcoded différents adaptateurs, peuvent être mélangés ensemble, ainsi qu’un échantillon de référence ajouté à faible concentration comme un contrôle de qualité pour les étapes suivantes du processus, tels que la génération de grappes clonales et les réactions de séquençage de l’ADN. Le mélange est ajouté à une puce de séquençage et chargé dans la machine.

Au cours de la réaction de séquençage la densité des grappes d’ADN est contrôlée : il ne doit pas être trop élevée, qui peut conduire à la contamination croisée, ou trop faible, qui peut conduire à l’insuffisance des données. La qualité du séquençage est donnée par le score de Q, ce qui indique la probabilité d’une base incorrecte étant identifiée. Les scores de Q pour la plupart des bases doivent être supérieurs à 30, ce qui correspond à une chance de moins de 1 à 1000 pour une lecture incorrecte. Recouvrement des séquences d’ADN de référence au taux prévu indique que toutes les séquences de bibliothèque sont régulièrement représentés.

Puis, lectures produites par le séquençage sont chevauchent entre eux pour déduire l’ARN qui a été séquencé. Pour les organismes avec l’information de génome disponible, lectures peuvent être alignés sur le génome de référence. Le nombre de lectures par transcription est compté pour mesurer l’abondance de chaque ARN.

Après avoir vu comment fonctionne la RNA-seq, regardons quelques façons qu'il est utilisé.

Séquençage de transcriptome permet d’identifier les gènes qui sont exprimés dans des conditions différentes. Par exemple, dans cette expérience, transcriptomes des produits sous différentes conditions de croissance des larves de moustiques ont été comparés. Même si cette espèce particulière de moustiques porteurs de maladies n’a pas un génome séquencé, les chercheurs ont pu comparer les informations transcriptome obtenus à d’autres espèces séquencée et d’identifier les gènes avec les niveaux d’expression une augmentation ou une diminution.

RNA-seq peut également être utilisé dans les « essais de reporter massivement parallèle » pour étudier les mécanismes de régulation génique. Ceci est fait en transfectant les cellules de mammifères avec une bibliothèque de milliers de plasmides, qui contiennent chacun une variante mutante d’un site de gène régulateur « en route » la transcription d’une séquence de journaliste qui est couplée aux balises uniques. Après isolement d’ARN et séquençage haut-débit, les niveaux de chaque balise sont évalués afin d’évaluer l’expression du Rapporteur de chaque construction, laquelle donne aperçu de l’importance fonctionnelle des nucléotides mutés dans chaque variante site régulateur.

Enfin, le séquençage de RNA peut être adapté pour étudier les interactions ARN-protéine, notamment pour identifier les transcriptions qui lie une protéine d’intérêt. La protéine immunoprecipitated avec des anticorps et le RNAs lié sont définis par séquençage. Si les complexes ARN-protéines sont réticulés au début, analyse de la séquence peut mapper le site de la réticulation et identifier le site la liaison aux protéines de l’ARN jusqu’au niveau des nucléotides.

Vous avez juste regardé la vidéo de JoVE sur RNA-Seq. Dans cette vidéo, nous avons vu comment les échantillons d’ARN sont convertis en bibliothèques, séquencés et les données analysées, ainsi que les types d’informations qui permet à l’analyse de la séquence. Grâce à sa sensibilité, potentiel pour être utilisé dans n’importe quel organisme et le coût réduit du séquençage, RNA-seq est plus en plus utilisé dans de multiples domaines de recherche en génétique et vous donnent un aperçu de nombreuses questions entourant la fonction cellulaire et le développement. Merci de regarder !