Question 1

Qu'est-ce que le RNA-seq et en quoi diffère-t-il des puces à ADN?

Accepted Answer

Le RNA-seq est une technique de séquençage à haut débit qui mesure la séquence et la quantité de tous les ARN exprimés dans une population cellulaire, appelée le transcriptome. Contrairement aux puces à ADN, qui recherchent des séquences d'ARN connues, le RNA-seq peut profiler expression génique à partir d'organismes dont le génome n'a pas été séquencé et mesurer avec précision une plus large gamme de niveaux d'expression des transcrits, en particulier à des niveaux très faibles ou très élevés.

Question 2

Pourquoi l'ARNr est-il éliminé avant la préparation de la bibliothèque RNA-seq?

Accepted Answer

La plupart de l'ARN dans les cellules est de l'ARN ribosomique (ARNr), qui est la composante centrale du mécanisme de production de protéines de la cellule. L'élimination de l'ARNr facilite la récupération d'autres types de transcrits pour une mesure précise. L'ARNr est généralement éliminé en hybridant l'échantillon à des oligonucléotides complémentaires attachés à des billes magnétiques, puis en utilisant un aimant pour séparer l'ARNr du reste de l'échantillon.

Question 3

Comment les échantillons d'ARN sont-ils convertis en ADN pour le séquençage?

Accepted Answer

Parce que l'ARN est intrinsèquement sujet à la dégradation, il est d'abord transcrit en sens inverse en ADN double brin. Des séquences d'oligonucléotides appelées adaptateurs sont ensuite liées aux fragments d'ADN. Ces adaptateurs contiennent des régions constantes qui servent de sites de liaison des amorces pour l'amplification par PCR et des séquences uniques appelées codes-barres qui identifient les fragments de chaque échantillon.

Question 4

Quel rôle jouent les codes-barres dans la préparation des bibliothèques RNA-seq?

Accepted Answer

Les codes-barres sont des séquences oligonucléotidiques uniques contenues dans des adaptateurs qui identifient tous les fragments d'ADN provenant d'un seul échantillon. Cela permet de mélanger des bibliothèques provenant de différents échantillons et de les séquencer simultanément. Après le séquençage, les codes-barres permettent aux chercheurs de trier et d'analyser les lectures par leur échantillon source.

Question 5

Comment la qualité des données RNA-seq est-elle évaluée pendant le séquençage ?

Accepted Answer

La qualité du séquençage est indiquée par le score Q, qui reflète la probabilité qu'une base incorrecte soit identifiée. Les scores Q supérieurs à 30 correspondent à moins d'une chance sur 1 000 d'une lecture incorrecte. De plus, les séquences d'ADN de référence ajoutées à faible concentration servent de contrôle de qualité, et leur récupération au taux attendu indique que toutes les séquences de la bibliothèque sont uniformément représentées.

Question 6

Que peut révéler le RNA-seq sur les différences d'expression génique entre les échantillons?

Accepted Answer

Le RNA-seq peut identifier des gènes qui sont exprimés de manière différentielle dans différentes conditions en comparant les transcriptomes entre les échantillons. Les chercheurs peuvent compter le nombre de lectures par transcrit pour mesurer l'abondance de l'ARN. Même pour les organismes sans génomes séquencés, les informations sur le transcriptome peuvent être comparées à celles d'autres espèces séquencées pour identifier les gènes avec des niveaux d'expression augmentés ou diminués.

Question 7

Comment le RNA-seq est-il utilisé pour étudier les interactions ARN-protéine?

Accepted Answer

L'analyse RNA-seq peut être adaptée pour identifier les transcrits auxquels une protéine d'intérêt se lie en immunoprécipitant la protéine avec des anticorps et en définissant les ARN liés par le séquençage. Lorsque les complexes ARN-protéine sont réticulés au début, l'analyse de séquençage peut cartographier le site de réticulation et identifier le site de liaison protéique sur l'ARN jusqu'au niveau du nucléotide.

Séquençage de l'ARN - Quiz d'évaluation