Quantification des molécules d'endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes
22 mai 2017
L'étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C'est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.
L'objectif général de cette analyse d'imagerie est d'observer la motilité des vésicules dans les neurones et de la quantifier facilement. Cette approche permet d'analyser le trafic membranaire dans les neurones de manière simple et efficace en termes de temps. Pour commencer cette procédure, transférez l'utérus dans une nouvelle boîte de Pétri contenant de l'éthanol à 70 %.
Ensuite, transférez l'utérus dans une autre boîte de Pétri contenant du HBSS. Puis retirez les fœtus de l'utérus à l'aide de pinces anatomiques stériles et de ciseaux chirurgicaux. Placez-les ensuite dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du HBSS.
Sous un microscope stéréo, retirer la peau et les crânes, puis extraire les cerveaux à l’aide de pinces de dissection stérilisées. Ensuite, les transférer dans une autre boîte de Pétri contenant du HBSS. Retirer les méninges à l’aide de pinces de dissection stérilisées.
Ensuite, découpez les régions excédentaires. Puis, transférez les cortèges dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du HBSS. Rassemblez tous les cortèges à l’aide d’un compte-gouttes jetable ou d’une pipette de 25 millilitres et placez-les dans un tube de 15 millilitres.
Ensuite, retirez le HBSS par pipetage. Puis, ajoutez trois millilitres de solution enzymatique du cortex cérébral dans le tube contenant les cortices. Placez le tube dans un bain-marie et incubez-le à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, ajoutez trois millilitres supplémentaires de solution enzymatique du cortex cérébral dans le tube contenant les cortices et incubez-les à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant cinq minutes supplémentaires. Au bout de cinq minutes, retirez la solution enzymatique du cortex cérébral et ajoutez cinq millilitres de DMEM contenant 10 % de sérum de veau fœtal. Dissociez les cortices en pipetant doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette de cinq millilitres équipée d’une pointe stérile P1000.
Ensuite, prélevez à nouveau les cortèges à l’aide d’une pipette de cinq millilitres munie d’une pointe P200. Placez un filtre cellulaire en nylon de 40 micromètres sur un tube de 50 millilitres et filtrez la suspension afin d’éliminer les débris. Ensuite, centrifugez la suspension à 420 × g pendant cinq minutes à température ambiante, puis retirez le milieu DMEM.
Ensuite, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture cortical cérébral et resuspendez délicatement le culot cellulaire. Puis, comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration cellulaire à l’aide du milieu de culture cortical cérébral. Ensuite, ensemencez trois fois 10 puissance six neurones corticaux dans deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque boîte codée de 35 millilitres à fond en verre.
Dans cette procédure, mélangez quatre microgrammes de plasmide avec 200 microlitres de milieu sans sérum. Dans un tube séparé, diluez huit microlitres du réactif de transfection dans 200 microlitres de milieu sans sérum. Incubez ensuite la solution pendant cinq minutes à température ambiante.
Après cinq minutes, mélanger la solution de plasmide et la solution de réactif de transfection, puis incuber le mélange pendant 20 minutes à température ambiante. Ensuite, ajouter le mélange aux boîtiers codés à fond en verre. Incuber les neurones à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, remplacez le milieu par deux millilitres de milieu de culture de cortex cérébral et incubez les neurones à 37 degrés Celsius pendant un à deux jours. Pour l'imagerie, utilisez un microscope à fluorescence équipé d'une caméra CCD avec des objectifs 40X. Maintenez la température à 37 degrés Celsius à l'aide d'un système d'incubation.
Acquérir des images de neurones à raison d'une image toutes les cinq secondes pendant une période de 100 secondes contrôlée par le logiciel d'acquisition d'images. Pour analyser les images, ouvrez toutes les images séquentielles dans le logiciel ImageJ avec le suivi manuel. Pour combiner les images séquentielles, sélectionnez Image, puis Stacks, suivi de Images to Stack, puis cliquez sur OK. Ensuite, choisissez Plugins, puis Manual Tracking.
Une fenêtre de suivi va s'ouvrir. Cliquez sur la case à cocher Afficher les paramètres et définissez les paramètres de suivi dans la section Paramètres. Ensuite, cliquez sur Ajouter un suivi pour démarrer un nouveau suivi.
Après avoir déterminé les vésicules d'intérêt, cliquez sur le centre des signaux dans les images séquentielles pour enregistrer les coordonnées xy. Répétez cette procédure afin de recueillir les coordonnées xy des vésicules à partir de toutes les images séquentielles ; chaque image passe automatiquement à l'image suivante une fois le point de référence sélectionné. Cette image montre la mobilité des vésicules contenant LAMP-EGFP dans les dendrites des neurones corticaux de souris après deux jours de transfection, commencée au jour 4 in vitro.
L'encart montre l'image en lapse de temps des vésicules positives pour LAMP-EGFP. La flèche rouge indique une vésicule en mouvement et la flèche bleue indique une vésicule au repos. Les flèches orange indiquent des signaux fluorescents plus intenses.
Voici la position sur l'axe des abscisses en fonction du temps des vésicules positives pour LAMP-EGFP. La vésicule dans le cercle rouge, étiquetée b, est en mouvement, tandis que la vésicule dans le cercle bleu, étiquetée a, est au repos. Ce diagramme en barres indique la distance totale parcourue par les vésicules LAMP-EGFP.
Et ce graphique en barres indique la distance moyenne de mobilité des vésicules contenant LAMP-EGFP.
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Aperçu
Cette étude présente une méthode permettant de quantifier la motilité des vésicules dans les neurones, ce qui est essentiel pour comprendre les fonctions neuronales. L'approche permet une analyse simple du trafic membranaire dans le système nerveux.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Trafic membranaire
Contexte
- Le trafic membranaire est essentiel au fonctionnement neuronal.
- La mobilité des vésicules joue un rôle clé dans ce processus.
- Comprendre ces mécanismes peut fournir des informations sur la santé neuronale.
- Les méthodes actuelles de quantification du déplacement des vésicules sont souvent complexes.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode pratique pour quantifier la motilité des vésicules.
- Faciliter l'analyse du trafic membranaire dans les neurones.
- Approfondir la compréhension des fonctions neuronales grâce à des méthodologies améliorées.
Méthodes utilisées
- Analyse d'images pour observer la motilité des vésicules.
- Transfert des échantillons biologiques vers des milieux appropriés pour analyse.
- Utilisation d'outils stérilisés pour la manipulation des échantillons.
- Procédures rapides pour la quantification.
Résultats principaux
- La méthode permet une quantification facile de la mobilité des vésicules.
- Elle offre une approche simple pour analyser le trafic membranaire.
- Les résultats peuvent contribuer à une meilleure compréhension des fonctions neuronales.
- Applications potentielles dans divers domaines de recherche en neurosciences.
Conclusions
- Cette méthode simplifie l'étude de la motilité des vésicules dans les neurones.
- Elle peut être adaptée à diverses applications en neurosciences.
- Des recherches ultérieures peuvent s'appuyer sur cette approche pour explorer la santé neuronale.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La quantification de la motilité des vésicules fournit des informations essentielles sur les mécanismes du trafic membranaire qui influencent la santé neuronale et les phénotypes liés aux maladies. Cette méthode permet une validation précoce des cibles en reliant la dynamique subcellulaire à des résultats fonctionnels dans des modèles de neurodégénérescence. L'approche renforce la confiance prédictive dans le criblage préclinique en fournissant des lectures quantitatives et reproductibles du transport vésiculaire dans des systèmes neuronaux pertinents pour la maladie.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la Découverte et Validation de la Cible
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en mesurant la motilité des endosomes et des lysosomes comme indicateurs fonctionnels de la santé neuronale.
- Valeur opérationnelle : Soutient la détection biologique des risques grâce à une quantification standardisée du mouvement des vésicules dans des modèles cellulaires pertinents pour la maladie.
- Valeur prédictive : Facilite le tri du portefeuille en corrélant les défauts de motilité avec des voies mécanistiques dans les troubles neurologiques.
Développement de tests et de criblages
- Valeur scientifique : Fournit des mesures quantitatives de la distance et de la vitesse de migration pour le criblage de composés dans les neurites et le soma.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité du test grâce à un suivi basé sur ImageJ avec des paramètres définis et une imagerie en laps de temps.
- Extensibilité : Compatible avec plusieurs types cellulaires, notamment les fibroblastes et les cellules endothéliales, permettant une réutilisation sur différentes plates-formes.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : S'aligne sur les stratégies translationnelles de biomarqueurs en associant la dynamique des vésicules à la survie neuronale et à la fonction synaptique.
- Valeur opérationnelle : Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique grâce à des mesures de mobilité cohérentes entre les différents modèles.
- Atténuation des risques : Guide les décisions d'avancement pondérées en fonction des risques en identifiant les composés capables de corriger les défauts de trafic intracellulaire.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'intègre aux flux de travail de la phase de découverte précoce en fournissant des données quantitatives sur la motilité qui renseignent sur l'interaction avec la cible et la modulation des voies dans les systèmes neuronaux.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses en quantifiant le déplacement des vésicules comme indicateur fonctionnel de l'intégrité du trafic membranaire.
- Essais de dépistage : Permet la préparation des tests grâce à des protocoles d'imagerie et de suivi standardisés pour l'analyse des vésicules dépendante du temps.
- Analytique : Génère des mesures de distance de mobilité et de mouvement moyen permettant des analyses comparatives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien avec la continuité préclinique en associant les défauts de transport vésiculaire aux mécanismes des maladies neurodégénératives.
- Réutilisation en milieu professionnel : Fonctionne comme une plateforme d'imagerie réutilisable, applicable à diverses lignées cellulaires neuronales et non neuronales.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en réduisant l'ambiguïté des liens mécanistiques entre les défauts de trafic et les phénotypes neuronaux.
- Valeur opérationnelle : Renforce la standardisation et la reproductibilité grâce à une analyse basée sur des modules complémentaires et à des paramètres de suivi définis.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en fournissant des données objectives et quantitatives sur l'engagement de la cible dans les voies de mobilité des vésicules.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque en identifiant les composés modulant la dynamique endosome-lysosome dans les modèles de maladie.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture neuronale, transfection et microscopie de fluorescence pour un marquage et une imagerie précis des vésicules.
- Repose sur la plateforme ImageJ avec le module complémentaire Manual Tracking et des capacités de traitement séquentiel d'images.
- Exige une standardisation de l'efficacité de transfection, des intervalles d'imagerie et des paramètres de suivi entre les expériences.
- L'adaptation à différentes lignées cellulaires peut nécessiter une optimisation de l'expression des marqueurs et des mesures de référence de la mobilité.
- Les limitations pratiques incluent la dépendance à l'efficacité de transfection et les risques de phototoxicité durant des acquisitions prolongées en mode laps de temps.
