Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

L’objectif global de cette stratégie expérimentale est de résoudre les assemblages fonctionnels distincts dans lesquels une protéine peut être impliquée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif bleu, fractionnement de complexes protéiques purifiés d’affinité et profilage de corrélation par spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à ajouter des informations organisationnelles aux listes de protéines générées par des expériences de spectrométrie massive de purification d’affinité. Les principaux avantages de cette procédure sont qu’elle est simple à réaliser, qu’elle a une bonne résolution et qu’elle nécessite un peu plus de travail que les CMSM en gel conventionnels.

Ce protocole est optimisé pour la purification de complexes protéiques de 200 à 500 millions de cellules exprimant des niveaux endogènes d’une protéine marquée FLAG. Après la décongélation de la pastille cellulaire, comme décrit dans le protocole de texte, ajoutez cinq millilitres de tampon de lyse glacé contenant du DTT et des inhibiteurs de protéase à la suspension cellulaire et agitez pour mélanger. Incuber la suspension sur de la glace pendant 10 minutes.

Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur à froid. Lyser les cellules en 20 à 30 coups, à l’aide du pilon étanche jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de viscosité notable, puis transférer l’homogénat dans des microtubes à centrifuger froids. Après avoir centrifugé les tubes, transférez le lysat clair dans un tube froid propre, en laissant environ 50 microlitres de lysat derrière vous.

Conservez une aliquote de 35 microlitres de lysat pour mesurer la concentration en protéines et surveiller la purification. Ensuite, retirez le tampon des perles préalablement préparées. Remettez les billes en suspension avec un millilitre de lysat, puis mélangez avec le reste du lysat.

Incuber le mélange sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Récupérez les perles sur le côté du tube à l’aide d’un aimant. Prélevez une aliquote de 30 microlitres de surnageant et jetez le reste.

Remettez les billes en suspension dans 0,5 millilitre de tampon IPP150 en pipetant quatre à six fois. Ensuite, transférez la suspension dans un tube froid de 1,5 millilitre. Ensuite, lavez les billes trois fois avec 0,5 millilitre de tampon natif d’élution FLAG.

Lors du dernier lavage, transférez les perles dans un nouveau tube froid. Retirez soigneusement le tampon. Remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de 200 microgrammes par millilitre de peptide 3X5 dans un tampon d’élution natif.

Ensuite, incubez à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec une rotation douce. Récupérez les billes avec l’aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube froid. Répétez cette étape deux fois avant de tirer tous les éluats.

Concentrez l’éluat jusqu’à 25 microlitres dans une unité de filtration centrifuge par centrifugation à 10 000 fois G à quatre degrés Celsius. Préparez l’échantillon en ajoutant un tampon de chargement d’échantillon natif 4X et un additif d’échantillon G-250 à 0,5 % à l’éluat concentré de 25 microlitres. Chargez l’échantillon et les marqueurs de poids moléculaire natif, en laissant un puits vide entre eux.

Ensuite, chargez 10 à 20 microlitres de tampon de chargement d’échantillon natif 1X dans tous les puits vides. Remplissez soigneusement la chambre cathodique avec 200 millilitres de tampon cathodique bleu foncé 1X PAGE natif, afin de ne pas perturber les échantillons. Remplissez la chambre d’anode avec 550 millilitres de tampon d’anode 1X natif PAGE.

Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant 30 minutes. Après avoir arrêté le cycle, retirez le tampon cathodique bleu foncé à l’aide d’une pipette sérologique et remplacez-le par 1X tampon cathodique bleu clair. Après avoir continué la course pendant 60 minutes, ouvrez la cassette de gel et jetez l’une des plaques de cassette

Le gel reste attaché à l’autre plaque de la cassette. Placez le gel dans un plateau contenant suffisamment de solution fixatrice pour le couvrir et incubez pendant 30 minutes en secouant doucement. Ensuite, retirez la solution fixatrice et remplacez-la par de l’eau avant de scanner le gel.

Pour vous préparer à la spectrométrie de masse, placez d’abord une plaque conique à fond 96 puits sur une autre plaque à 96 puits pour collecter les déchets. Percez le fond des puits de la plaque à fond conique à 96 puits avec une aiguille de calibre 21. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 50 % d’acétonitrile, 0,25 % d’acide formique dans les puits de la plaque percée.

Incuber la pile de plaques dans un shaker pendant 10 minutes. Ensuite, centrifugez la plaque à 500 fois G pendant une minute, de sorte que le liquide s’écoule à travers les trous dans la plaque de collecte des déchets. Après avoir répété deux fois les étapes de lavage, remplissez les puits de la plaque percée à 96 puits avec 150 microlitres de bicarbonate d’ammonium de 50 millimolaires.

Ensuite, placez le gel sur une surface propre. Découpez le couloir contenant l’échantillon en 48 tranches identiques. Coupez chaque tranche en deux ou trois petits morceaux, à l’exception des cinq dernières tranches en haut du gel.

Placez chaque tranche séquentiellement dans un puits de l’extrémité percée lavée à 96 puits. Ajoutez 50 microlitres d’acétonitrile dans chaque puits et incubez la plaque en secouant pendant 30 à 60 minutes. Après avoir éliminé le liquide par centrifugation, ajoutez 200 microlitres de TSEB de deux millimètres et 50 millimolaires de bicarbonate d’ammonium dans chaque puits.

Incuber la plaque en secouant pendant 30 minutes à température ambiante avant de retirer le liquide par centrifugation comme précédemment. Déshydratez les morceaux de gel en ajoutant 200 microlitres d’acétonitrile pur et incubez en agitant à température ambiante pendant 20 minutes jusqu’à ce que les morceaux de gel soient blancs et opaques. Après avoir retiré l’acétonitrile, ajoutez 150 microlitres de trypsine dans du bicarbonate d’ammonium froid dans chaque puits.

Incuber l’assiette en secouant à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, placez une plaque inférieure conique propre sous la plaque contenant du gel, en veillant à ce que les plaques soient correctement orientées. Ensuite, récupérez le liquide contenant les peptides par centrifugation à 200 fois G pendant une minute.

Placez la plaque contenant les peptides dans un évaporateur centrifuge et évaporez le liquide tout en effectuant l’étape suivante. Ajoutez 150 microlitres de 50 % d’acétonitrile et 0,25 % d’acide formique aux morceaux de gel. Incuber en secouant à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Recueillir le liquide dans la plaque partiellement séchée par centrifugation à 200 fois G pendant une minute. Continuez à évaporer la plaque contenant les peptides tout en effectuant l’étape suivante. Transférez les solutions peptidiques dans la plaque de filtration centrifuge lavée.

Placez une plaque inférieure conique propre en dessous pour recueillir les peptides et centrifuger la pile de plaques comme auparavant. Évaporez le liquide dans la plaque inférieure conique jusqu’à ce que les puits soient complètement secs. Une fois sèche, la plaque peut être recouverte d’un couvercle en silicone et stockée à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle effectue une spectrométrie de masse et une analyse des données comme décrit dans le protocole textuel.

Les résultats représentatifs de l’agrégation hiérarchique des profils de migration PAGE natifs bleus de Mta2 et des protéines copurifiantes sont présentés ici sous la forme d’un dendrogramme et d’une carte thermique représentant les intensités protéiques. Le profil de migration de Mta2 montre deux pics indiquant deux complexes distincts. Certaines sous-unités NuRD présentent un schéma similaire, avec une abondance plus élevée dans l’assemblage de poids moléculaire inférieur.

En revanche, d’autres sous-unités NuRD sont plus abondantes dans l’assemblage NuRD de poids moléculaire plus élevé. D’autre part, l’interacteur Mta2, Cdk2ap1, n’est présent que dans l’assemblage NuRD de poids moléculaire supérieur. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de garder tous les échantillons et réactifs sur de la glace pour éviter la dissociation des complexes protéiques. Cette procédure peut être appliquée à n’importe quelle protéine d’intérêt, à condition qu’elle puisse être examinée à partir du milieu d’affinité par élution compétitive dans des conditions natives. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme la co-immunoprécipitation inverse ou séquentielle peuvent être réalisées pour valider les sous-complexes identifiés.