Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

L'objectif général de cette stratégie expérimentale est de résoudre les assemblages fonctionnels distincts dans lesquels une protéine peut être impliquée, grâce à la fractionnement par électrophorèse native bleue sur gel de polyacrylamide de complexes protéiques purifiés par affinité et au profilage de corrélation par spectrométrie de masse. Cette méthode peut aider à ajouter des informations organisationnelles aux listes de protéines générées par des expériences de spectrométrie de masse en masse après purification par affinité. Les principaux avantages de ce protocole sont sa simplicité d'exécution, sa bonne résolution et le fait qu'il nécessite peu de travail supplémentaire par rapport à la spectrométrie CMSMS conventionnelle sur gel.

Ce protocole est optimisé pour la purification de complexes protéiques à partir de 200 à 500 millions de cellules exprimant des niveaux endogènes d'une protéine marquée par un FLAG. Après décongélation du culot cellulaire, comme décrit dans le protocole écrit, ajouter cinq millilitres de tampon de lyse glacé contenant du DTT et des inhibiteurs de protéases à la suspension cellulaire et agiter doucement pour homogénéiser. Incuber la suspension sur glace pendant 10 minutes.

Transférez la suspension cellulaire dans un homogénéisateur refroidi. Lys ez les cellules avec 20 à 30 mouvements à l’aide du piston ajusté, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de viscosité apparente, puis transférez l’homogénat dans des tubes de microcentrifugeuse froids. Après centrifugation des tubes, transférez le lysat clarifié dans un tube froid propre, en laissant environ 50 microlitres de lysat dans le tube d’origine.

Conserver un aliquot de 35 microlitres de lysat pour mesurer la concentration en protéines et suivre la purification. Ensuite, éliminer le tampon des billes préparées précédemment. Resuspendre les billes dans un millilitre de lysat, puis mélanger avec le reste du lysat.

Incuber le mélange sur une roue rotative à quatre degrés Celsius pendant une à deux heures. Rassembler les billes sur le côté du tube à l’aide d’un aimant. Prélever un aliquot de 30 microlitres de surnageant et jeter le reste.

Resuspendre les billes dans 0,5 millilitre de tampon IPP150 en pipettant quatre à six fois. Ensuite, transférer la suspension dans un tube froid de 1,5 millilitre. Puis, laver les billes trois fois avec 0,5 millilitre de tampon natif d'élution FLAG.

Avec le dernier lavage, transférez les billes dans un nouveau tube froid. Éliminez complètement le tampon. Remettez en suspension les billes dans 100 microlitres de peptide 3X5 à 200 microgrammes par millilitre dans du tampon d'élution natif.

Incubez ensuite à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avec une rotation douce. Recueillez les billes à l’aide de l’aimant et transférez le surnageant dans un nouveau tube froid. Répétez cette étape deux fois avant de recueillir tous les éluats.

Concentrer l'éluate jusqu'à 25 microlitres dans une unité de filtration centrifuge par centrifugation à 10 000 ×g à quatre degrés Celsius. Préparer l'échantillon en ajoutant un tampon de charge natif 4X et un additif d'échantillon à 0,5 % G-250 à l'éluate concentré de 25 microlitres. Charger l'échantillon et les marqueurs de poids moléculaire natifs, en laissant un puits vide entre eux.

Ensuite, chargez 10 à 20 microlitres de tampon de charge natif 1X dans tous les puits vides. Remplissez soigneusement la chambre cathodique avec 200 millilitres de tampon cathodique bleu foncé natif PAGE 1X, sans perturber les échantillons. Remplissez la chambre anodique avec 550 millilitres de tampon anodique natif PAGE 1X.

Faire migrer le gel à 150 volts pendant 30 minutes. Après l'arrêt de la migration, retirer le tampon cathodique bleu foncé à l’aide d’une pipette sérologique et le remplacer par du tampon cathodique bleu clair 1X. Après avoir poursuivi la migration pendant 60 minutes, ouvrir la cassette du gel et éliminer l’une des plaques de la cassette.

Le gel reste attaché à l'autre plaque de cassette. Placer le gel dans un récipient contenant suffisamment de solution de fixation pour le recouvrir et incuber pendant 30 minutes avec agitation douce. Ensuite, retirer la solution de fixation et la remplacer par de l'eau avant de numériser le gel.

Pour préparer l'échantillon pour la spectrométrie de masse, placez d'abord une plaque de 96 puits à fond conique sur une autre plaque de 96 puits afin de recueillir les déchets. Percez le fond des puits de la plaque à fond conique à l'aide d'une aiguille de calibre 21. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de 50 % acétonitrile, 0,25 % acide formique dans les puits de la plaque perforée.

Incuber la pile de plaques dans un agitateur pendant 10 minutes. Ensuite, centrifuger la plaque à 500 × g pendant une minute, afin que le liquide passe par les trous dans la plaque de collecte des déchets. Après avoir répété deux fois les étapes de lavage, remplir les puits de la plaque 96 puits perforée avec 150 microlitres de bicarbonate d'ammonium 50 millimolaire.

Ensuite, placez le gel sur une surface propre. Découpez la bande contenant l'échantillon en 48 tranches identiques. Coupez chaque tranche en deux ou trois morceaux plus petits, sauf les cinq dernières tranches situées en haut du gel.

Placer chaque tranche successivement dans un puits d'une plaque 96 puits dont l'extrémité perforée a été préalablement lavée. Ajouter 50 microlitres d'acétonitrile dans chaque puits et incuber la plaque sous agitation pendant 30 à 60 minutes. Après élimination du liquide par centrifugation, ajouter 200 microlitres de TSEB à deux millimètres et de bicarbonate d'ammonium à 50 millimolaire dans chaque puits.

Incuber la plaque avec agitation pendant 30 minutes à température ambiante avant d'éliminer le liquide par centrifugation comme précédemment. Déshydrater les morceaux de gel en ajoutant 200 microlitres d'acétonitrile pur et incuber avec agitation à température ambiante pendant 20 minutes, jusqu'à ce que les morceaux de gel deviennent blancs et opaques. Après avoir éliminé l'acétonitrile, ajouter 150 microlitres de trypsine dans du bicarbonate d'ammonium froid dans chaque puits.

Incuber la plaque avec agitation à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Ensuite, placer une plaque propre à fond conique sous la plaque contenant le gel, en veillant à l'orientation correcte des plaques. Puis, recueillir le liquide contenant les peptides par centrifugation à 200 fois G pendant une minute.

Placer la plaque contenant les peptides dans un évaporateur centrifuge et évaporer le liquide tout en effectuant l'étape suivante. Ajouter 150 microlitres de 50 % acétonitrile, 0,25 % acide formique aux morceaux de gel. Incuber sous agitation à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Recueillir le liquide dans la plaque partiellement sèche par centrifugation à 200 fois G pendant une minute. Continuer à faire évaporer la plaque contenant les peptides tout en effectuant l'étape suivante. Transférer les solutions de peptides vers la plaque de filtration centrifuge lavée.

Placer une plaque propre à fond conique en dessous pour recueillir les peptides et centrifuger l'empilement de plaques comme précédemment. Évaporer le liquide dans la plaque à fond conique jusqu'à ce que les puits soient complètement secs. Une fois secs, la plaque peut être recouverte d'un couvercle en silicone et stockée à moins 20 degrés Celsius jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse et l'analyse des données, comme décrit dans le protocole textuel.

Des résultats représentatifs issus du regroupement hiérarchique des profils de migration en électrophorèse native bleue des protéines Mta2 et des protéines copurifiées sont présentés ici sous forme de dendrogramme et de carte thermique représentant les intensités protéiques. Le profil de migration de Mta2 montre deux pics, indicatifs de deux complexes distincts. Certaines sous-unités du complexe NuRD présentent un profil similaire, avec une abondance maximale dans l'assemblage de poids moléculaire inférieur.

En revanche, d'autres sous-unités de NuRD sont plus abondantes dans l'assemblage NuRD de poids moléculaire plus élevé. D'autre part, l'interacteur de Mta2, Cdk2ap1, n'est présent que dans l'assemblage NuRD de poids moléculaire plus élevé. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours et demi.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder tous les échantillons et réactifs sur de la glace afin d'éviter la dissociation des complexes protéiques. Cette procédure peut être appliquée à toute protéine d'intérêt, à condition qu'elle puisse être récupérée à partir du milieu d'affinité par élution compétitive dans des conditions natives. Après cette procédure, d'autres méthodes comme la co-immunoprécipitation inverse ou séquentielle peuvent être réalisées afin de valider les sous-complexes identifiés.