Name: Bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques Après périphériques Ensemencement de lalpha-synucléine Fibrilles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Découvrez l'imagerie de bioluminescence pour quantifier la neuro-inflammation dans un modèle murin de la maladie de Parkinson après injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine. Cette méthode permet un suivi non invasif et répété.

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Les auteurs remercient Olga Sharma, Theresa Hundt, et le personnel des installations de microscopie DZNE et animales pour le soutien technique.

Toutes les procédures y compris les animaux ont été effectuées avec l&#39;approbation du comité de protection des animaux de l&#39;Agence de l&#39;environnement du Nord-Westphalie État de Rhénanie (LANUV). Les animaux ont été logés et soignés en fonction des conditions standard avec une 12 h cycle lumière / obscurité et l&#39;accès libre à la nourriture et de l&#39;eau. 1. Modèle animal <ol><li> Intercross Tg hémizygotes (GFAP -Luc de +/-) de souris hémizygotes avec Tg (M83 +/-) pour générer des souris Tg hémizygotes bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris 15, 16. </li><li> Génotype la descendance avec la PCR en temps réel pour la présence du transgène codant pour l&#39; alpha-synucléine humaine et de PCR standard pour la luciférase de luciole 12, 17. </li><li> Inoculer les animaux à l&#39;âge de six à huit semaines. </li></ol> 2. Préparation Inoculum <ol><li> préparer moalpha-synucléine humaine recombinante nomeric avec la mutation A53T dans du tampon du tampon Tris salin (TBS) contenant 150 mM de NaCl dans 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) comme cela a été décrit précédemment 14. </li><li> Préparer l&#39;alpha-synucléine fibrillaire pour inoculations en agitant 3 ug / ul d&#39;alpha-synucléine humaine recombinante monomère dans un agitateur orbital à 800 tpm et 37 ° C pendant 5 jours. </li><li> Diluer assemblages de fibrilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 1 pg / pl pour intraperitoneale ou 2 ug / ul pour inoculations intraglossal. </li><li> Fragmenter les fibrilles de l&#39;alpha-synucléine avec un sonicateur à tige pendant 1 min (40 impulsions d&#39;une durée de 0,5 avec une pause d&#39;une seconde entre chaque impulsion et une amplitude réglée à 50%) sur de la glace. Pour éviter la contamination croisée par ensemencement. Utiliser des sondes de sonication propres pour préparer un inoculum différent. </li></ol> 3. Injections Intraglossal <ol><li> Anesthésier les animaux avec un intrapeinjection ritoneal de 100 mg / kg de kétamine et 10 mg / kg de xylazine. Pincez l&#39;orteil de l&#39;animal et confirmer qu&#39;il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux de l&#39;animal pour prévenir la sécheresse sous anesthésie. </li><li> Fixer les animaux anesthésiés avec soin avec du ruban adhésif sur une plaque chauffante dans une position couchée dorsale avec leurs têtes tournées vers l&#39;investigateur. </li><li> Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 5 ul de fibrilles d&#39;alpha-synucléine ou soniquée PBS. </li><li> Utilisez une pince pouce-nez émoussé avec des pointes en dents de scie pour maintenir la bouche de l&#39;animal ouvert, et une seconde plus petite paire de pinces pour tirer délicatement la langue pour faire la partie inférieure de la langue accessible pour l&#39;injection. </li><li> Injecter l&#39;aiguille de la seringue dans la partie inférieure droite ou gauche de la languette à proximité du nerf hypoglosse. Injecter lentement l&#39;inoculum après 5 s. rétracter lentement l&#39;aiguille après 5 s pour assurer que l&#39;inoculuma pénétré dans le tissu et ne soit pas perdu pendant la rétraction de l&#39;aiguille. </li><li> Libérer l&#39;animal de ses fixations et laissez-le sur la plaque chauffante sous surveillance constante jusqu&#39;à la récupération complète. </li></ol> 4. intrapéritonéale Injections <ol><li> Pour les injections intraperitoneales, narcotiser les animaux peu de temps dans une chambre d&#39;anesthésie par inhalation avec de l&#39;isoflurane / oxygène en utilisant un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l&#39;orteil de l&#39;animal et confirmer qu&#39;il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée. </li><li> Remplir une 27 seringue hypodermique jetable G avec 50 ul de fibrilles d&#39;alpha-synucléine ou soniquée PBS. </li><li> Injecter directement dans le péritoine de la souris et éviter la pénétration de l&#39;intestin grêle ou le caecum situé derrière la paroi abdominale en tenant l&#39;animal dans une position dorsale avec la tête tournée à l&#39;opposé de l&#39;investigateur et vers le bas à environ 45 °. Surveiller les animaux jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient récupéréde l&#39;anesthésie. </li></ol> 5. bioluminescence Imaging <ol><li> Tg image (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris toutes les 2-4 semaines en utilisant un système d&#39;imagerie par bioluminescence. </li><li> Avant imagerie peu anesthésier les souris dans une chambre isoflurane / oxygène avec un débit de 2 L / min et le vaporisateur fixé à 2%. Pincez l&#39;orteil de l&#39;animal et confirmer qu&#39;il ne retire pas sa patte arrière pour assurer une anesthésie appropriée. </li><li> Rasez et épilé les têtes des souris avec une crème épilatoire. Colorer les oreilles en noir avec un marqueur non irritant pour bloquer non spécifique bioluminescence. </li><li> Diluer le sel de potassium de D-luciférine, le substrat de la luciférase, dans du PBS à une solution mère à 30 mg / mL. Conservez ce dans 1 ml aliquotes à -20 ° C. Protéger la D-luciférine dissous de l&#39;exposition à la lumière. </li><li> Peser les animaux avant l&#39;injection. Calculer le volume exact de D-luciférine pour l&#39;injection de 150 mg / kg de poids corporel. Injecter par voie intraperitoneale D-luciferin et retourner l&#39;animal à la chambre d&#39;anesthésie. </li><li> Démarrez le logiciel d&#39;imagerie. Après que le système de formation d&#39;images a atteint sa température de fonctionnement initialiser le système en cliquant sur le bouton « Initialiser » dans le panneau de commande. </li><li> Sélectionnez les boutons de la luminescentes »et « Photo ». Réglez le temps d&#39;exposition à 60 s, le binning à &#39;moyen&#39;, le F / Stop à &#39;1&#39;, et le gain EM sur &#39;Off&#39;. </li><li> Vérifiez que le filtre d&#39;excitation est réglée sur « bloc » et le filtre d&#39;émission pour « Open » et régler la hauteur de l&#39;objet de 1,50 cm. </li><li> Dix minutes après l&#39;injection de D-luciférine, placer les animaux sur la plaque de chauffage dans la chambre d&#39;imagerie et de veiller à ce que leurs museaux sont correctement placés dans la sortie de l&#39;anesthésie. Fermer la isoflurane / débit d&#39;oxygène de la chambre d&#39;inhalation et d&#39;ouvrir l&#39;écoulement de la chambre de formation d&#39;image avec un débit de 0,25 L / min et une évaporation de 2%. Fermer la porte de la chambre d&#39;imagerie properly. </li><li> Cliquez sur le bouton « Acquire » pour mesurer la bioluminescence, qui prend 60 s. Arrêter le flux de isoflurane et de surveiller les animaux jusqu&#39;à ce qu&#39;ils aient complètement récupéré après les retourner à leurs cages. </li><li> Utiliser le logiciel d&#39;imagerie pour quantifier la bioluminescence. Au sein de la « palette d&#39;outils » sélectionner « Outils de retour sur investissement ». Sous « Type » dans les « Outils de retour sur investissement », sélectionnez « ROI Mesure ». </li><li> Dans les « Outils de retour sur investissement » cliquez sur l&#39;outil « cercle » et sélectionnez le nombre de régions d&#39;intérêt à tirer dans le menu déroulant - idéalement « 3 » pour trois souris. </li><li> Dans l&#39;image, cliquez droit sur chaque ROI et sous « Propriétés » ajuster la largeur et la hauteur à 1,25 cm. Placez chaque ROI sur la zone du cerveau qui est quantifié. </li><li> Dans le coin supérieur gauche de l&#39;image, définir le panneau d&#39;unités de « rayonnement (photons) ». </li><li> Au sein de la « palette d&#39;outils », sélectionnez « Réglage de l&#39;image » et régler le minimum etle maximum de la « échelle de couleur », par exemple, de 0.20e6 à 1.00e6. </li><li> Sous « Fichier » enregistrer les données avec « Save ». </li></ol> 6. Analyse Biochemical <ol><li> Isoler le cerveau et la moelle épinière selon des protocoles établis 18, 19. </li><li> Homogénéiser ensemble du cerveau et des échantillons de moelle épinière séparément dans du PBS en présence d&#39;inhibiteurs de protease et de phosphatase (dilué dans du PBS à 1x) en deux cycles de 30 s à 6000 tours par minute dans un homogénéisateur de tissus. Assurez-vous que le cerveau et les échantillons de la moelle épinière sont homogénéisés à une concentration finale de 20% (poids / volume). </li><li> Soniquer les échantillons deux fois tout en les maintenant sur la glace avec une impulsion constante de 10 s et une amplitude réglée à 50%. </li><li> Ajuster les homogénats à 10% dans du PBS et 750 mM de NaCl par dilution 1: 1 avec du NaCl 1,5 M dans du PBS. </li><li> Pour séparer les débris cellulaires, centrifuger les broyats à 1000 g pendant 5 min à4 ° C. Gardez les surnageants pour les prochaines étapes et jeter les granulés. </li><li> Mesurer la concentration en protéine dans les homogénats utilisant le dosage de l&#39;acide bicinchoninique (BCA) selon les instructions du fabricant. Incuber 1,0 mg de protéine totale à partir des homogénats de cerveau ou de 0,8 mg à partir d&#39;homogénats de la moelle épinière dans le n-laurylsarcosyl à une concentration finale de 10% (poids / volume) pendant 15 min sur de la glace. </li><li> Superposer les homogénats sur un coussin de saccharose à 10% (poids / volume) de 3 ml dans de l&#39;eau distillée et les ultracentrifugation à 465000 g pendant 1 h à 4 ° C. </li><li> Remettre en suspension les pastilles dans un tampon contenant 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS), 2% β-mercaptoéthanol, 192 mM de glycine, 25 mM de Tris, et 5% (poids / volume) de saccharose. </li><li> Faire bouillir les échantillons à 100 ° C pendant 5 min et les charger sur des gels de SDS-polyacrylamide pour l&#39;électrophorèse dans un système de tampon acide morpholineethanesulfonic (MES). </li><li> Transférer les protéines séparées vers des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) dans un MEBiDry système buvard. </li><li> Incuber les membranes dans 0,4% (vol / vol) une solution de formaline dans du PBS pendant 30 min à température ambiante sur un rotor à 35 tours par minute pour réticuler les protéines avec la membrane. </li><li> Bloquer les membranes dans du tampon TBS contenant 0,05% (vol / vol) de Tween 20 et 5% (poids / volume) de lait pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber les blots avec l&#39;anticorps primaire dans du tampon de blocage pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les membranes trois fois dans du tampon TBS et de les incuber avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase ou fluorophores dans du TBS pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Visualiser les anticorps secondaires liés par chimioluminescence ou fluorescence selon des protocoles établis 20. </li></ol> 7. Analyse de Immunofluorescence <ol><li> Déshydrater les cerveaux disséqués et la moelle épinière dans une station de traitement des tissus et de les incorporer dans de la paraffine en utilisant une station de paraffine. </li><li> Couper le tis dans la paraffinepoursuit en justice avec un microtome à 8 um d&#39;épaisseur des coupes coronales et monter les sections sur des lames de verre. </li><li> Déparaffiner les coupes de tissu par incubation dans deux bains de xylol séparés pendant 5 à 10 min et de les réhydrater à travers une série de bains d&#39;éthanol à gradient (100%, 90%, 70%, 50%) et finalement avec H 2 O. </li><li> Incuber les sections dans 0,01 M de tampon citrate (pH 6,0) pendant 5 min à température ambiante et les faire bouillir pendant 10 minutes de plus dans un four à micro-ondes. </li><li> Laissez les sections refroidir à la température ambiante et de les incuber avec une solution de peroxyde d&#39;hydrogène à 3% pendant 30 min pour inhiber les peroxydases endogènes. </li><li> Bloquer les coupes de tissu par incubation avec 20% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,5% de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Incuber les sections avec l&#39;anticorps primaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Laver les sections deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS. </li><li> Colorer les sections avec les anticorps secondaires fluorophores conjugués correspondants et le DAPI colorant nucléaire dilué dans 1% (vol / vol) de sérum de chèvre normal, 1% (vol / vol) de BSA et PBS pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Après avoir lavé deux fois avec 0,25% (vol / vol) de Triton X-100 dans du PBS et une fois avec du PBS, les lames couvre-objet avec un support d&#39;encastrement et de visualiser la coloration avec un microscope à balayage laser confocal. </li></ol>

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Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Injection périphérique de fibrilles d&#39;alpha-synucléine dans le péritoine de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris représente une méthode facile pour induire une maladie neurologique accompagnée d&#39; une neuroinflammation de récapituler caractéristiques importantes des synucléinopathies. De même, l&#39;injection de la languette représente une autre voie pour la neuroinvasion par prionoids alpha-synucléine dans les souris transgéniques, mais est moins efficace. Nous avons choisi d...

Il existe des preuves de plus en plus que l&#39;alpha-synucléine a des caractéristiques similaires à celles de la protéine prion, en particulier dans sa capacité à se ressème et se propagent entre les cellules et le mauvais repliement le long des voies neuronales. Cette propriété de l&#39; alpha-synucléine est aussi appelée « prion » ou « prionoid », et est soutenu par des observations dans des expériences de transplantation, ce qui suggère la transmissibilité de l&#39; alpha-synucléine mal repliées de neurones malades aux nouveaux neurones sains transplantés 1, 2 , 3, 4. En outre l&#39; injection directe d&#39;alpha-synucléine dans le cerveau mal repliée ou de la périphérie, par exemple , le muscle du membre postérieur ou de la paroi intestinale, conduit à une propagation de la pathologie alpha-synucléine aux parties distales du système nerveux central 5, 6, 7, &lt;classe sup = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Nous avons analysé la transmission de prionoids alpha-synucléine, par des voies périphériques plus en détail et a abordé la question de savoir si l&#39;alpha-synucléine peut neuroinvade misfolded le système nerveux central après une seule injection intrapéritonéale ou intraglossal, une fonction qui avait été montré précédemment pour prion mais pas pour misfolded alpha- synucléine. Après l&#39; injection des prions dans la langue, neuroinvasion du système nerveux central est réalisée par propagation le long du nerf hypoglosse de la languette qui mène vers le noyau du nerf hypoglosse qui se trouve dans le tronc cérébral 11. En tant que modèle de souris , nous avons choisi Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris qui surexpriment le mutant A53T d&#39;alpha-synucléine humaine à partir du promoteur de prion, et la luciférase de luciole sous le contrôle d&#39;un promoteur GFAP pour surveiller l&#39; activation astrocytaire par bioluminescence, comme indiqué précédemment dans le cerveaudes souris infectées par le prion-12. Dans nos mains Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) des souris n&#39;a pas développé la maladie jusqu&#39;à 23 mois comme cela a été démontré par d&#39; autres 13. Une seule injection de fibrilles d&#39;alpha-synucléine de l&#39; homme par voie intrapéritonéale ou intraglossal induite par une maladie neurologique avec la pathologie dans le cerveau et la moelle épinière des Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris soutenant l&#39;hypothèse que prionoids alpha-synucléine importantes caractéristiques avec 14 prion.

<table><tbody><tr><td>anticorps anti-actine</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synucléine, anticorps phospho S129 [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anti-alpha-synucléine, anticorps phospho S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-séquestosome-1 (p62)</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-ubiquitine [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine&nbsp ;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>Seringue de 27 g</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane&nbsp ;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp ; 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Crème dépilatoire</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline marqueur de laboratoire&nbsp ;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>Sel de potassium de D-luciférine</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>solution mère 30 mg/mL</td></tr><tr><td>Thermomixeur</td><td>Eppendorf</td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 Sonicateur</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II Système d’imagerie</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Logiciel</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>souris Tg(M83+/-) ou B6 ; souris C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif standard</td><td>Outils de science fine</td><td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Pince à motif étroit</td><td>Outils de science fine</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>N-laurylasarcosyl</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse Optima Max-XP&nbsp ;</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tubes en polycarbonate à paroi épaisse</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12 % Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP anticorps conjugués</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 anticorps conjugués&nbsp ;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Substrat de durée prolongée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie Stella 3200 Système d’imagerie</td> infrarouge <td>Raytest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&nbsp ;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp ;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Membrane PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>solution de travail 3 %</td></tr> <tr><td>albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>dilution de travail 1:50 000</td></tr><tr><td>Fluoromount media&nbsp ;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 microscope confocal à balayage laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>homogénéisateur Precellys 24-Dual&nbsp ;</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticorps conjugué</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp ; BCA&nbsp ; Protéine&nbsp ; Assay&nbsp ; Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtome RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 microscope confocal à balayage laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques après périphériques ensemencement de l&#39;alpha-synucléine fibrilles

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Pour étudier le comportement de prion de l&#39;alpha-synucléine mal repliées, les modèles de souris sont nécessaires qui permettent une transmission rapide et simple de prionoids alpha-synucléine, qui provoquent neuropathologie dans le système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici que intraglossal ou injection intrapéritonéale de fibrilles de l&#39; alpha-synucléine dans Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris, qui surexpriment l&#39; alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T à partir du promoteur de la protéine prion et de la luciférase de luciole le promoteur de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), est suffisante pour induire une maladie neuropathologique. Par rapport à Tg homozygote (M83 + / +) de souris qui développent des symptômes neurologiques sévères commençant à l&#39;âge de 8 mois, Tg hétérozygote (+/- M83: GFAP -Luc +/-) les animaux restent indemnes de la maladie spontanée jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent un âge de 22 mois. Fait intéressant, l&#39;injection de fibrilles d&#39;alpha-synucléine via le intraperitoneitinéraire al maladie neurologique induite par la paralysie dans quatre des cinq Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) chez la souris avec un temps d&#39;incubation médiane de 229 ± 17 jours. Les animaux malades ont montré des dépôts sévères de l&#39;alpha-synucléine phosphorylée dans leur cerveau et la moelle épinière. L&#39;accumulation d&#39;alpha-synucléine ont été Sarkosyl insolubles et colocalisés avec l&#39;ubiquitine et p62, et étaient accompagnées d&#39;une réaction inflammatoire entraîne une gliose astrocytaire et microgliose. De manière surprenante, l&#39;inoculation de fibrilles alpha-synucléine dans la langue était moins efficace dans la maladie avec seulement l&#39;un des cinq animaux injectés présentant une pathologie alpha-synucléine après 285 jours. Nos résultats montrent que l&#39; inoculation par voie intraglossal et plus encore par la voie intrapéritonéale convient pour induire une maladie neurologique avec caractéristiques pertinentes de synucléinopathies Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) souris. Cela fournit un nouveau modèle pour l&#39;étude de la pathogenèse comme prion induireD par prionoids alpha-synucléine plus en détail.

Injection périphérique de prionoids alpha-synucléine par la langue ou la neuropathologie péritoine induite dans le système nerveux central de Tg bigéniques (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) chez la souris (Tableau 1 et Figure 1). Après une seule injection intraperitoneale avec des fibrilles d&#39;alpha-synucléine, quatre des cinq souris ont développé une maladie neurologique avec un temps d&#39;incubation médiane de 229 ± 17 jours. ...

Injection périphérique de fibrilles d&#39;alpha-synucléine dans le péritoine ou de la langue de Tg (+/- M83: GFAP -Luc +/-) des souris qui expriment l&#39; alpha-synucléine humaine avec la mutation A53T familiale et la luciférase de luciole, peut induire une neuropathologie, y compris la neuroinflammation , dans leur système nerveux central.

Bioluminescence imagerie de la neuro-inflammation chez des souris transgéniques Après périphériques Ensemencement de l&#39;alpha-synucléine Fibrilles

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Le but général de cette méthode d'imagerie bioluminescente est de quantifier la neuroinflammation dans le système nerveux central d'un modèle murin de la maladie de Parkinson après une injection périphérique de fibrilles d'alpha-synucléine. Cette méthode peut aider à déterminer quand et dans quelle mesure la neuroinflammation survient dans les modèles murins des maladies neurodégénératives. Le principal avantage de cette technique est que la neuroinflammation peut être surveillée de manière non invasive et répétée jusqu'à ce que des souris développent une maladie neurologique.L'implication de cette technique est le diagnostic de la maladie neurologique à la 10e heure, car une augmentation de la bioluminescence due à l'inflammation nerveuse accompagne non seulement, mais précède souvent la maladie neurologique. Commencez par anesthésier correctement l'animal pour la chirurgie. Appliquez une pression sur l'orteil et vérifiez que l'animal ne retire pas le membre, ce qui indiquerait un niveau chirurgical d'anesthésie.Appliquer un onguent ophtalmique pour prévenir le dessèchement pendant l'anesthésie. Utiliser du ruban adhésif pour fixer soigneusement l'animal sur une plaque chauffante en position dorsale, la tête orientée vers l'expérimentateur. Ensuite, remplir une seringue hypodermique jetable de calibre 27 avec cinq microlitres de fibrilles de l'alpha-synucléine soniquées.Ensuite, utilisez une paire de pinces à bec émoussé pour maintenir la bouche de l'animal ouverte et utilisez la paire de plus petites pinces pour dégager délicatement la langue afin de rendre accessible son face inférieure pour l'injection. Insérez l'aiguille de la seringue sur le côté inférieur droit ou gauche de la langue, à proximité du nerf hypoglosse. Après cinq secondes, injectez lentement l'inoculum.Laisser l'aiguille en place pendant encore cinq secondes afin de s'assurer que l'inoculum pénètre le tissu, puis retirer soigneusement l'aiguille. Après l'injection, relâcher l'animal et le laisser sur la plaque chauffante sous surveillance constante jusqu'à un rétablissement complet. Pour les injections intrapéritonéales, narcotiser brièvement les animaux dans une chambre d'anesthésie à l'isoflurane.De nouveau, pincez l'orteil de l'animal et vérifiez qu'il ne retire pas sa patte postérieure afin de confirmer une anesthésie adéquate. Remplissez une seringue hypodermique jetable de calibre 27 avec 50 microlitres de fibrilles d'alpha-synucléine soniquées ou de PBS. Maintenez l'animal en position dorsale, la tête tournée vers le bas et éloignée de l'expérimentateur, à environ 45 degrés.Injecter directement dans le péritoine de la souris sans pénétrer l'intestin grêle ou le caecum situés derrière la paroi abdominale. Surveiller les animaux jusqu'à ce qu'ils se réveillent de l'anesthésie. Avant l'imagerie, raser et épiler la tête des souris anesthésiées à l'isoflurane.Colorer les oreilles en noir à l’aide d’un marqueur non irritant pour bloquer la bioluminescence non spécifique. Peser les animaux avant l’injection. Ensuite, calculer le volume exact de D-luciférine à injecter, soit 150 milligrammes par kilogramme de poids corporel.Injectez par voie intrapéritonéale le volume calculé de D-luciférine, puis remettez chaque animal dans la chambre d'anesthésie. Lancez le logiciel d'imagerie. Une fois que le système d'imagerie a atteint sa température de fonctionnement, initialisez le système en cliquant sur le bouton Initialiser dans le panneau de contrôle.Ensuite, sélectionnez les boutons Luminescent et Photograph. Réglez le temps d'exposition sur 60 secondes, le Binning sur moyen, le F/Stop sur un et le gain EM sur off. Sélectionnez Block, puis Open.Ensuite, dans l'onglet hauteur du sujet, sélectionnez 1,50 dans le menu déroulant. Dix minutes après l'injection de D-Luciférine, placez les animaux sur la plaque chauffante dans la chambre d'imagerie, et assurez-vous que leurs muscles sont correctement positionnés dans la sortie d'anesthésie. Passez le débit d'isoflurane de la chambre d'inhalation à la chambre d'imagerie, puis fermez correctement la porte de la chambre d'imagerie.Cliquez sur le bouton d'acquisition pour mesurer la bioluminescence, ce qui prend 60 secondes. Arrêtez le flux d'isoflurane, puis remettez les animaux dans leurs cages. Utilisez le logiciel d'imagerie pour quantifier la bioluminescence en ouvrant le menu de la palette d'outils et en sélectionnant Outils de régions d'intérêt (ROI Tools).Sous Type, sélectionnez ROI de mesure. Dans Outils ROI, cliquez sur l'outil cercle et sélectionnez le nombre de ROI à dessiner dans le menu déroulant. Idéalement trois pour trois souris.Dans l'image, cliquez avec le bouton droit sur chaque ROI et, dans les propriétés, réglez la largeur et la hauteur à 1,25 centimètre. Positionnez chaque ROI au-dessus de la zone cérébrale qui est quantifiée. Dans le coin supérieur gauche de l'image, réglez le panneau des unités sur le rayonnement exprimé en photons.Ouvrez ensuite le menu de la palette d'outils. Sélectionnez Ajustement d'image et réglez les valeurs minimale et maximale de l'échelle de couleur. Par exemple, de 200 000 à un million.Enfin, sous fichier, cliquez sur enregistrer pour sauvegarder les données. Comme indiqué ici, après une injection intrapéritonéale de fibrilles d'alpha-synucléine, quatre des cinq souris transgéniques A53T synucléine GFAP luciférase réceptrices ont développé une maladie neurologique en 229 jours, comme l'indiquent les carrés violets. Cependant, une seule des cinq souris injectées de manière interglossoïdale a développé une maladie neurologique en 285 jours, comme l'indiquent les cercles verts.L'imagerie de bioluminescence a révélé que les souris transgéniques émettaient une bioluminescence accrue provenant de leurs cerveaux et de leurs moelles épinières, peu de temps avant le développement de signes de maladie neurologique. Cette bioluminescence était plus marquée après une injection intrapéritonéale et absente après une injection de PBS, suggérant l'absence d'une gliose astrocytaire. Cette figure montre la bioluminescence dans les cerveaux de souris transgéniques au fil du temps après injection intrapéritonéale de fibrilles d'alpha-synucléine.Tels qu'indiqués par les cercles bleu, vert, brun et orange. Une augmentation des niveaux de bioluminescence au-dessus d'un seuil de 2 millions de photons par seconde par centimètre carré par stéradian a été observée quelques semaines avant que ces quatre souris individuelles ne développent des signes neurologiques de la maladie. L'un des cinq animaux a également montré des niveaux élevés de bioluminescence peu de temps avant son décès, survenu 285 jours après l'injection intralinguale de fibrilles d'alpha-synucléine.En revanche, chez les souris contrôles saines injectées avec du PBS, ainsi que chez un animal qui n'a pas développé la maladie après injection intrapéritonéale, les agrégats d'alpha-synucléine indiqués par les cercles rouges, le signal de bioluminescence est resté en dessous du seuil pendant la période d'observation. La coloration immunofluorescente de coupes cérébrales d'animaux malades à l'aide d'anticorps dirigés contre GFAP et Iba1 a confirmé une neuroinflammation associée à une microgliose et à la présence d'astrocytes réactifs dans les régions présentant des dépôts d'alpha-synucléine. Les animaux sains, qui n'ont pas accumulé de dépôts d'alpha-synucléine, présentaient une faible coloration pour GFAP et Iba1.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins d'une heure si elle est effectuée correctement. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la neurodégénérescence d'explorer de façon non invasive la neuroinflammation dans le système nerveux central de souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'injecter périphériquement des fibrilles d'alpha-synucléine chez la souris et de réaliser une imagerie par bioluminescence afin de surveiller la neuroinflammation du système nerveux central.L'objectif général de la procédure est d'induire de façon périphérique une maladie neurologique par injection intraglossole ou intrapéritonéale de fibrilles d'alpha-synucléine et d'observer de manière non invasive l'induction de la neuroinflammation au fil du temps.

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