Immunoprécipitation de la chromatine

Immunoprécipitation de la chromatine, ou « ChIP », est une technique utilisée par les chercheurs à évaluer les interactions protéine-ADN. Facteurs protéiques jouent un rôle important dans la régulation des gènes ; non seulement ils organisent l’ADN dans les chromosomes, mais ils se lient également à des séquences d’ADN spécifiques — appelés sites réglementaires — pour activer ou réprimer l’expression. Au cours de la puce, la chromatine — qui se compose de l’ADN et les protéines associées — « immunoprecipitated, » ce qui signifie qu’il est isolé par l’utilisation d’anticorps. Avec cette méthode, les chercheurs peuvent évaluer quelles protéines associent avec les séquences d’ADN.

Dans cette vidéo, nous examinerons les modifications de la chromatine et leurs rôles dans la régulation épigénétique, et comment la puce peut doser ces modifications. Nous puis décrire une procédure généralisée pour cette technique et nous discuterons finalement comment les scientifiques utilisent ChIP dans la recherche aujourd'hui.

Commençons par examiner quelles sont les modifications de la chromatine et la façon de les étudier avec puce.

Chez les eucaryotes, l’ADN est stockée dans les noyaux par « enveloppée » autour de complexes protéiques. Ces protéines sont les histones, et chaque histone gainé d’ADN complexe est dénommé un « nucléosome. » L’expression des gènes est réglementée par la « occupation nucléosome », ou si un tronçon de l’ADN est emballé dans des nucléosomes. ADN transcrit a tendance à être situées dans les régions « nucléosome-libre », qui permettent des protéines à associer les sites réglementaire d’un gène et permettent d’effectuer la transcription de l’ARN polymérase.

Données actuelles suggèrent que les changements dans la structure de la chromatine qui régulent l’expression des gènes sont médiés par chimiques modifications apportées aux histones, habituellement dans leur « queues » librement mobiles. Sont les plus courantes de ces acétyl, méthyle et groupes phosphates qui sont ajoutés, ou retirés, des acides aminés, et ces modifications d’histone différents sont observées pour être associé à différents niveaux ou modes d’expression de gène.

Par exemple, l’ajout de trois groupes méthyles du résidu lysine 27 dans la sous-unité de l’histone H3 — une modification appelée H3K27me3 — a été liée à silençage génique. Par ailleurs, la modification de H3K9ac, où un groupe acétyle est ajouté à la 9e résidu lysine sur l’histone H3, a été associée par activation de gènes.

Modifications d’histone sont hypothétiquement jouent un rôle dans la régulation épigénétique de l’expression génique en marquant des régions de chromatine comme « actifs » ou « silencieuse ». Un mécanisme par lequel histone modifications sont censées exercer leurs effets est de recruter les facteurs de transcription ou de la chromatine « remodelage » enzymes, laquelle déplacer physiquement les positions des nucléosomes.

Avec puce, modifications d’histone spécifique peuvent être ciblées par des anticorps, qui peuvent être « démolis » ainsi que de l’ADN environnante. Chercheurs peuvent alors employer PCR, microarrays, ou séquençage pour identifier des régions d’ADN associé avec des modifications d’histone d’intérêt. En faisant varier les anticorps utilisés au cours de la puce, cette technique peut aussi aider identifier les régions de l’ADN liées par des facteurs de transcription et autres protéines régulatrices.

Maintenant que vous connaissez les principes qui sous-tendent la puce, Let ' s go grâce à une procédure généralisée pour cette technique.

Pour commencer, les cellules d’intérêt sont collectées et traitées avec des produits chimiques comme le formaldéhyde, qui agissent comme « réticulation » réactifs et aident à fixer les protéines pour les séquences d’ADN qu’ils associent à en facilitant la formation de liaisons covalentes entre eux. Il faut pas « au régal » cellules avec du formaldéhyde, car cela peut avoir des répercussions la capacité des anticorps à reconnaître leurs modifications d’histone de cible à des stades ultérieurs de puce. Pour arrêter le processus de réticulation, glycine est ajouté à la solution de formaldéhyde avec lequel les cellules sont traitées. Les cellules sont ensuite recueillies et lysées pour libérer la chromatine.

Pour solubiliser la chromatine et définir précisément les régions de l’ADN qui associent aux histones modifiées, la chromatine est mécaniquement « cisaillée » en petits morceaux à l’aide d’ondes sonores — un processus appelé la sonication. En général, scientifiques visent à créer la chromatine fragments 200 à 1000 paires de bases en longueur. Une fois que les fragments de la chromatine de la taille désirée sont générés, un anticorps est ajouté à la solution, et le mélange est incubé pour donner le temps d’anticorps pour reconnaître sa modification d’histone de cible.

Billes magnétiques à laquelle peuvent lier les anticorps sont ensuite introduites dans le mélange, immobiliser les complexes de chromatine associées aux anticorps. Les perles sont collectées par l’utilisation de supports magnétiques et lavé plusieurs fois à rincer toute la chromatine indépendante ou des anticorps.

Pour libérer la chromatine de leur part, les perles sont placés dans une solution contenant le détergent SDS, et après avoir recueilli les perles avec un aimant, le surnageant est maintenu. La protéinase enzyme K est ensuite ajoutée à cette solution pour dégrader les protéines, y compris les histones, afin que le composant de l’ADN de la chromatine peut être isolé. L’ADN qui en résulte est ensuite purifié et analysé.

Jetons maintenant un coup d’oeil à la façon dont les scientifiques utilisent actuellement puce dans leurs laboratoires.

De nombreux chercheurs emploient morceau pour évaluer les changements dans les modifications d’histone provoquées par des signaux extracellulaires. Ici, des cellules humaines cultivées ont été traités avec une cytokine spécifique ou une molécule de signalisation, et les changements dans la méthylation des histones ont été évalués. En testant la puce ADN par PCR en temps réel, les chercheurs ont déterminé que, en réponse à un traitement — le gène de codage de facteur de transcription IRF1 acquise une activation marque d’histone, H3K36me3. Cette modification a permis une protéine régulatrice et l’ARN polymérase II à associer à IRF1, ce qui entraîne sa transcription.

Puce permet également de mieux comprendre les changements dans l’expression des gènes qui se produisent au cours de la régénération et de lésions tissulaires. Dans cette expérience, les chercheurs endommagé un composant du système nerveux périphérique chez les souris : le nerf sciatique — puis utilisé ChIP pour chercher de nouvelles interactions ADN-protéines dans d’autres structures du système nerveux périphérique, comme les ganglions qui entourent la moelle épinière. Les chercheurs ont conclu qu’après une blessure du nerf, la protéine p53, qui est un régulateur de réparation de l’ADN, s’associée avec un gène impliqué dans la régénération des tissus, GAP43.

Enfin, certains scientifiques sont efforcent de rationaliser les procédures de la puce pour augmenter le débit et l’efficacité des expériences. Ici, les chercheurs ont pu « automatiser » ChIP, ayant une machine effectuer bon nombre des étapes dans le protocole. Cela a permis aux chercheurs d’évaluer simultanément ADN associée à plusieurs modifications d’histone différents, à l’aide d’un nombre relativement restreint de cellules — 10 000 — ce qui donne des résultats similaires à ceux observés avec le plus grand nombre de cellules, ou par des techniques puce standards « manuels ».

Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur immunoprécipitation de la chromatine. Dans cette vidéo, nous avons discuté comment l’ADN et les protéines forment ensemble la chromatine et les étapes d’un protocole, appelé puce, qui peut être utilisé pour identifier les séquences d’ADN associées à la chromatine des États ou des protéines. Nous avons également examiné comment chercheurs utilisent et modifier la puce afin de mieux comprendre le rôle des interactions ADN-protéines au cours de la régulation des gènes. Comme toujours, Merci pour regarder !