Name: Linduction de mésenchymateuses-épithélial Transitions dans les cellules Sarcome (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Découvrez une méthode de culture cellulaire pour induire la transition mésenchymateuse-épithéliale dans les cellules de sarcome. Cette technique utilise les microARN-200 et GRHL2 pour étudier la plasticité phénotypique et identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

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JAS reconnaît le soutien du Duke Cancer Institute, l&#39;Université d&#39;oncologie génito Laboratoire Duke, et le duc département de chirurgie orthopédique de l&#39;Université. HL a été soutenu par la National Science Foundation (NSF) Centre de Biophysique théorique (NSF PHY-1427654) et NSF DMS-1361411, et comme CPRIT (Institut de prévention et de recherche sur le cancer du Texas) Scholar en recherche sur le cancer de l&#39;État du Texas à l&#39;Université Rice. KEW a été soutenu par le NIH F32 CA192630 MKJ et HL a bénéficié de discussions utiles avec Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta et Donald S. Coffey.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer DMEM pour la culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum bovin fœtal (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine (5000 U / ml) à 500 ml de DMEM. Ce milieu peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à six mois. </li><li> Remettre en suspension les amorces lyophilisées dans de l&#39;eau sans nuclease à une concentration finale de 10 uM. amorces remises en suspension à -20 ° C. </li><li> Préparer test de radio-immunoprécipitation (RIPA) du tampon (150 mM NaCl, 0,5% de désoxycholate de sodium, 0,1% de SDS, Tris 50 mM, pH 8,0). Supplément avec un cocktail d&#39;inhibiteur de protéase avant de les utiliser et de conserver un tampon sur de la glace lors de son utilisation. Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer 10 mg / ml de polybrène (bromure d&#39;hexadiméthrine) dans de l&#39;eau et filtrer pour stériliser la seringue en utilisant un filtre de polyéthersulfone de 0,45 pm. La solution peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à six mois. </li><li> Préparer une solution de chlorure de nitro bleu de tétrazolium de travail 1 mg / ml par dissolution de 10 mg dans 10 ml de PBS. Conserver à 4 ° C.</li></ol> 2. Lentiviral Transduction de GRHL2 jour 1 <ol><li> Planche 3 x 10 5 cellules HEK293T par puits d&#39;une plaque à 6 puits dans 2 ml de DMEM complété. Quantifier les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé. Les cellules doivent être 40 - confluentes à 60% après une culture pendant une nuit à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> Jour 2 <ol start="2"><li> Diluer 2 ug de vecteur vide (pCMV-UBC-EGFP) ou 2 pg de pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 dans 200 ul de milieu sans sérum avec 1,8 pg de pΔ8.9 et 0,2 ug de pCMV-VSV plasmides auxiliaires -G. Dans un tube séparé, on dilue 4 ul d&#39;un réactif de transfection à base de lipides dans 200 ul de milieu exempt de sérum par transfection (8 ul dans 400 ul de deux échantillons). Ajouter 200 pi de mélange de réactif de transfection pour chaque solution de plasmide et incuber pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Au cours de la incubestion, lavage des cellules HEK293T par élimination du milieu par aspiration et les cellules de rinçage avec 1 ml de PBS. Remplacer le PBS avec 800 ul de milieu exempt de sérum. Après 20 min, ajouter 200 ul de réactif de transfection: mélange plasmide de l&#39; étape 2.2 goutte à goutte à chaque puits et incuber les cellules pendant 2 h à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Retirer délicatement milieu de transfection par aspiration sous vide et la remplacer par 2 ml de DMEM complété. Remettre les cellules à l&#39;incubateur pour la culture du jour au lendemain. REMARQUE: les cellules HEK293T sont faiblement adhérentes. le remplacement des médias doit être effectuée avec précaution afin de limiter l&#39;élimination des cellules du fond du plat ou un flacon. </li></ol> jour 3 <ol start="5"><li> Actualiser multimédia sur des cellules HEK293T transfectées et la plaque 3 x 10 5 cellules RD par puits d&#39;une plaque à 6 puits dans 2 ml de DMEM complété. les cellules de culture durant la nuit. cellules RD sont une lignée cellulaire de rhabdomyosarcome humain disponible dans le commerce. </li></ol> jour 4 </p&gt; <ol start="6"><li> Recueillir les médias viral à partir de cellules HEK293T. Pipeter les médias DMEM des cellules HEK293T et le placer dans un nouveau 15 ml conique. Remettez soigneusement avec les nouveaux médias de DMEM et placer des cellules HEK293T dans l&#39;incubateur pour le lendemain. </li><li> Ajouter 2 ul de 10 mg / mL de polybrène par ml de milieu virales en deux nouveaux tubes coniques de 50 ml (une pour la transfection du vecteur vide et l&#39;autre pour la transfection GRHL2). filtre à seringue de support viral en retirant le piston d&#39;une seringue de 3 ml et fixer un filtre de 0,45 um de polyéthersulfone à la pointe. <ol><li> Ajouter les supports viraux collectés à l&#39;étape 2.6 dans le cylindre de la seringue, et de plonger des supports dans les nouveaux tubes coniques de 50 ml contenant du polybrène. Retirez le support de cellules RD par aspiration et ajouter du contenu multimédia viral filtré aux cellules RD. </li></ol></li></ol> jour 5 <ol start="8"><li> Jour 4. Répéter les cellules HEK293T peuvent être mis au rebut après que les médias du virus a été recueilli. </li></ol> jour 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Laver les cellules RD avec 1 ml de PBS et ajouter 200 ul de 0,05% de trypsine par puits. Incuber à 37 ° C pendant 5 min, ajouter 2 ml de milieu complété, et déplacer la suspension cellulaire à un nouveau 15 ml conique. Centrifuger les cellules à 250 xg pendant 5 min à la température ambiante et des supports d&#39;aspiration. Remettre en suspension dans 1 ml de DMEM (supplémenté avec 5% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine). REMARQUE: L&#39;utilisation d&#39;un pourcentage plus élevé de FBS peut provoquer le colmatage lors de cytométrie en flux <ol><li> les cellules de filtre pour la cytométrie de flux. Utiliser une pipette pour appliquer le 1 mL de suspension de cellules RD à travers un filtre de 30 um dans des tubes de cytométrie en flux et des tubes à placer sur la glace. </li><li> Trier les cellules EGFP + 26 dans 1,5 ml contenant des tubes de microcentrifugation de 0,5 ml de DMEM additionné de 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine et placer sur de la glace. Plate EGFP + cellules triées au total de 1 ml de DMEM supplémenté en un seul puits d&#39;une plaque à 12 puits et placer dans l&#39;incubateur pour culture. ; NOTE: Le rendement des cellules EGFP + de cytométrie en flux après cette transduction est généralement faible (50,000-100,000 cellules). Les cellules peuvent avoir besoin d&#39;être cultivées pendant 10 - 14 jours avant de passer à l&#39;étape 3. </li></ol></li></ol> 3. inverse Transfection de miR-200s <ol><li> Préparer 50 uM stocks de miR-200 en utilisant imite les actions H 2 O. aliquotes sans nuclease et stocker à -20 ° C pour éviter les cycles de congélation / décongélation répétés. </li><li> Ajouter 3 pi de chaque 50 uM miR-200 mimic (miR-200a, miR-200b, et miR-200c) à 300 ul de milieu exempt de sérum ou 9 ul de 50 uM miARN témoin négatif à 300 uL de milieu sans sérum. </li><li> Ajouter 6 ul de réactif de transfection spécifique de siRNA de 600 ul de milieu exempt de sérum et de diviser 300 ul de ce mélange dans deux tubes, l&#39;un pour chacun des deux mélanges miR de l&#39;étape 3.2. On combine les 300 pi de chaque mélange de l&#39;étape miR 3,2 avec un mélange de 300 ul de réactif de transfection. Incuber pendant 20 min à la salle température. </li><li> Alors que l&#39;incubation, préparer une suspension cellulaire de 600.000 cellules EGFP + RD exprimant EV ou GRHL2 créé dans la section 2 dans 2,4 ml (250 cellules / ul) de milieu exempt de sérum par traitement. </li><li> Dans une plaque à 24 puits, ajouter 100 ul par puits de mélange miR-200 ou un mélange témoin négatif provenant de l&#39;étape 3.3 dans six puits, puis ajouter 400 ul de chaque suspension cellulaire dans trois puits de chaque mélange miR. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant une nuit et changer de support à tout complété DMEM le jour suivant. Recueillir les cellules 2 jours plus tard pour l&#39;analyse en utilisant le tampon approprié (voir ci-dessous). imagerie time-lapse des cellules de sarcome RD en cours de MET est disponible en tant que matériau supplémentaire. Image chaque puits toutes les 2 h avec un objectif 10X au moyen d&#39; un imageur de cellules vivantes automatisé 27. </li></ol> 4. Extraction de l&#39;ARN, la transcription inverse, et qPCR <ol><li> Extrait d&#39;ARN selon les instructions du fabricant en utilisant un ARN normekit d&#39;extraction 24. L&#39;ARN extrait peut être stocké à -80 ° C. </li><li> Quantifier la concentration d&#39;ARN. Décongeler et travailler avec l&#39;ARN sur la glace. Pour quantifier les concentrations d&#39;ARN, mesurer l&#39;absorbance UV à 260 nm avec un spectrophotomètre lecteur de plaque selon le protocole du fabricant. Diluer tous les échantillons à la plus faible concentration d&#39;eau sans nucléase. </li><li> Effectuer la transcription inverse de l&#39;ARN total en ADN complémentaire (ADNc). Moissonneuse pas moins de 100 ng d&#39;ARN total avec du tampon de PCR, un mélange de dNTP (100 mM), des amorces hexamères aléatoires, la transcriptase inverse et de l&#39; eau exempte de nuclease dans un volume réactionnel de 20 ul 24. Exécuter des cycles RT conformément au protocole du fabricant. ADNc peut être stocké à long terme à -20 ° C. </li><li> Diluer 20 ul de réactions à 100 ul avec 80 ul de H sans nucléase 2 O. </li><li> Mélanger 5 ul d&#39;un colorant d&#39;intercalation à base de fluorescence 2x mélange maître qPCR, 0,06 ul de chaque amorce 10 uM, unnd 2 ul de la réaction RT dilué par échantillon. </li><li> Exécutez qPCR selon le protocole du fabricant pour le mélange maître à base de fluorescence. </li><li> Quantifier les quantités relatives d&#39;ARNm par la méthode delta CT et normaliser de GAPDH. Tracer l&#39;expression d&#39;ARNm moyen de répétitions biologiques ± écart-type pour chaque groupe de traitement. NOTE: Il convient de prendre des précautions particulières lorsque l&#39;on travaille avec de l&#39;ARN pour éviter tout contact avec RNases, comme l&#39;utilisation des plastiques et des réactifs sans RNase. matériel non jetable doit être traitée avant d&#39;utiliser pour enlever RNases. </li></ol> 5. Immunofluorescence Staining <ol><li> Suite à l&#39;étape 3.6, les médias aspirés par aspiration sous vide à partir des cellules RD au format 24 puits. </li><li> Fixer les cellules par addition de 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) par puits et incuber pendant 15 min à température ambiante (RT). Après fixation, les cellules de lieu dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et stocker à 4 ° C pendant une nuit, si nécessaire. </li><li> perméabiliserles cellules en ajoutant 500 pi de PBS + 0,2% de Triton-X100 et incuber 30 min à température ambiante. Par aspiration sous vide, éliminer le tampon de perméabilisation et laver trois fois avec du PBS. </li><li> Bloc dans 500 ul d&#39;albumine de sérum bovin à 5% (BSA) / PBS et incuber les cellules pendant 30 min à température ambiante. Les cellules peuvent être stockées pendant la nuit si nécessaire à 4 ° C. </li><li> Préparer une dilution d&#39;anticorps primaire. Pipeter 200 ul de 5% de BSA / PBS par puits dans un 15 ml conique (12 puits = 2,4 ml) et ajouter 1 pi de l&#39;anticorps primaire par ml de 5% de BSA / PBS nécessaire. Retirer le tampon de blocage par aspiration et distribuer 200 ul d&#39;anticorps primaire dilué dans chaque puits. <ol><li> Incuber les cellules à 1: 1000 des anticorps primaires dilués dans 5% de BSA / PBS pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Après incubation, les cellules laver deux fois avec du PBS. </li></ol></li><li> Préparer la dilution d&#39;anticorps secondaire dans le même volume de 5% de BSA / PBS comme ci-dessus. Ajouter l&#39;anticorps secondaire conjugué à un colorant rouge lointain en utilisant une dilution à 1: 2000. En outre ajouter1 pg / ml de colorant Hoechst au mélange. Retirez le PBS et ajouter 200 ul du mélange à chaque puits. <ol><li> Incuber à température ambiante pendant 1 h dans l&#39;obscurité. Laver 3 fois avec du PBS, laisser les cellules dans du PBS, et de protéger les cellules de la lumière en utilisant une feuille. Les cellules peuvent être stockées à 4 ° C si nécessaire. </li></ol></li><li> des cellules d&#39;image à grossissement total 400x sur un microscope inversé à épifluorescence avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 594 à 650 nm. </li></ol> 6. Western Blot <ol><li> Laver les cellules deux fois de 3,6 avec du PBS glacé. Sur de la glace, les cellules lysent avec du tampon 50 ul de 1 x RIPA additionné de cocktail d&#39;inhibiteurs de protease 1x. </li><li> lysats de roche à 4 ° C pendant 15 min, recueillir les lysats dans des tubes de 1,5 ml, et on centrifuge à grande vitesse (20 000 x g) pendant 5 min afin de clarifier les échantillons. Les lysats cellulaires peuvent être stockés à long terme à -80 ° C si nécessaire. </li><li> Quantifier la protéine totale en utilisant un dosage de Bradford et aliquoter une quantité égale de protéine dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Brinles échantillons G à l&#39;aide d&#39;un volume égal du tampon RIPA et le tampon de charge de Laemmli 3x additionné de 2-mercaptoéthanol. </li><li> Incuber les échantillons dans un tampon de charge d&#39;échantillon Laemmli 1x pendant 5 min à 95 ° C et exécuter SDS-PAGE en utilisant un gel Tris-glycine 4-12% à 200 V pendant 45 min. La quantité de plages chargé de protéines en fonction de la lignée cellulaire. Dans certains cas, 50 à 100 ug de protéine totale est nécessaire pour détecter la E-cadhérine dans des lignées de cellules mésenchymateuses. </li><li> les protéines de transfert sur une membrane de nitrocellulose pendant 2 heures à 50 V dans un tampon de transfert Tris-glycine 1x. </li><li> Bloc membrane pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C dans un tampon de blocage à base de BSA. </li><li> Diluer anticorps primaires à 1: 1 000 concentration dans 5 ml de tampon de blocage, ajouter dilution à la membrane, et mettre en incubation avec doux balancement pendant 1 h à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver la membrane 3 fois dans du PBS avec 0,05% de Tween-20. </li><li> Incuber les membranes pendant 1 h à température ambiante avec SECONDAIRE couplé fluorescente infrarougey anticorps à 1: 20 000 dilution dans du tampon de blocage comme ci-dessus. </li><li> Laver deux fois la membrane dans du PBS avec 0,05% de Tween-20, puis une fois dans du PBS. </li><li> membrane image en utilisant la détection par fluorescence infrarouge standard. </li></ol> 7. Les essais de croissance indépendante de l&#39;ancrage NOTE: Pour un protocole d&#39;essai agar mou détaillée, voir 28. <ol><li> Chaud médias 2x DMEM stérile à 42 ° C dans un bain d&#39;eau chaude. Pendant ce temps, la chaleur pré-1% d&#39;agarose autoclavé au micro-ondes pendant 3 min. Micro-ondes pendant 30 s supplémentaires à la fois au besoin ou jusqu&#39;à complètement fondu. Déplacer agarose dans un bain-marie à 42 ° C. </li><li> Placer un tube conique de 50 ml dans un bêcher avec 42 ° C l&#39;eau dans une hotte stérile et mélanger agarose à 1% et 2 x milieu DMEM dans un mélange 1: 1 de comptabilité de rapport pour 1,5 mL de mélange par puits dans une plaque à 6 puits. Toujours préparer supplémentaire DMEM / agarose pour tenir compte des erreurs de pipetage et d&#39;éviter les bulles. </li><li> Ajouter au mélangeparois du puits, en veillant à l&#39;absence de bulles se forment et laisser reposer pendant 30 minutes à température ambiante. </li><li> Bien que la couche inférieure est solidification, préparer chaque groupe de cellules RD transfectées à l&#39;étape 3 par aspiration médias et un lavage une fois avec 1 ml de PBS. PBS Aspirer et ajouter 0,2 ml de trypsine à 0,05% et incuber à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Neutraliser la trypsine dans 0,8 ml de milieu et les cellules Broyez pour former une suspension à cellule unique. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml. </li><li> Compter les cellules et calculer le volume de la suspension cellulaire nécessaire pour 10.000 cellules par puits. </li><li> Chauffer 0,6% d&#39;agarose dans le micro-ondes pendant 3 min, suivie de 30 s à la fois jusqu&#39;à complètement fondu. Déplacer agarose à 42 ° C bain d&#39;eau. </li><li> Placer un tube conique de 50 ml dans un bêcher avec de l&#39;eau 42 ° C dans une hotte stérile. Mélanger 0,6% d&#39;agarose et la suspension cellulaire diluée dans un rapport 1: 1 pour préparer 1,5 ml de mélange par puits dans une plaque à 6 puits. Toujours préparer la suspension cellulaire supplémentaire / mix agarose pour tenir compte des erreurs de pipetage etpour éviter les bulles. NOTE: Il est important de travailler à 42 ° C ici. Si la température est trop faible, le mélange se solidifie avant le placage, et des températures supérieures à 42 ° C aura une incidence sur la viabilité cellulaire. </li><li> Bien mélanger les cellules par trituration à plusieurs reprises et ajouter le mélange de cellules dans les puits, en veillant à aucune forme de bulles, et laisser se solidifier pendant 20 minutes à température ambiante. </li><li> Ajouter 2 ml de milieux supplémentés à chaque puits et déplacer des plaques dans l&#39;incubateur. <ol><li> Changer les médias une fois par semaine pendant 3-4 semaines ou jusqu&#39;à ce que les colonies multicellulaires forment. Veillez à ne pas toucher la gélose lors du retrait des médias par aspiration. En variante, utiliser un P1000 pour enlever la couche supérieure du milieu liquide. </li><li> Colorer des plaques de gélose molle en ajoutant 200 ul de solution de chlorure de Nitro Bleu de tétrazolium (1 mg / mL dans du PBS) et incuber la plaque pendant une nuit à 37 ° C. Remplacer les médias le lendemain avec PBS pour l&#39;imagerie. </li><li> puits d&#39;image au grossissement 40X totale sur un microscope inversé. </li><li> Effectuer l&#39;analyse sur ImageJ pour la zone de la colonie et le nombre. Terrain nombre moyen de colonies de réplicats biologiques ± écart-type. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Les sarcomes sont des cancers rares, mais très agressifs d&#39;une lignée mésenchymateuses. En dépit de leur lignée mésenchymateuses, un sous-ensemble de sarcomes semble subir une transition phénotypiques à un état plus de type épithélial. Ce commutateur MET semblable a un intérêt pronostique, comme les patients ayant plus de tumeurs épithéliales ressemblant sont moins agressifs 24. En dépit de leur pertinence clinique, il existe peu d&#39;études portant sur les mécanismes moléculaires de conduit...

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One of the authors&#39; names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticité phénotypique se réfère à une transition réversible entre les phénotypes cellulaires, et est généralement divisé en deux types, les transitions épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et les transitions mésenchymateuses-à-épithéliale (MET). Cette plasticité phénotypique joue un rôle important dans les processus normaux d&#39;organismes multicellulaires, tels que le développement et la cicatrisation des plaies 1; cependant, ces mêmes voies et les programmes d&#39;expression génique peuvent également conduire à des maladies, telles que la fibrose (revue dans 2, 3, 4) et les métastases de carcinome (revue dans les références 5, 6, 7, 8). Au cours de métastases, par exemple, EMT perturbe la polarité cellulaire, les interactions entre cellules et favorise l&#39; invasion 9, 10. Ensemble, EMT contribuents à un état phénotypiques qui facilite la diffusion des cellules cancéreuses. En outre, EMT conduit également à une foule d&#39;autres modifications phénotypiques qui entraînent un phénotype agressif, y compris la dérégulation du métabolisme des cellules cancéreuses 6, le développement de la résistance aux médicaments 11, 12, une augmentation de la capacité d&#39;initiation de la tumeur 13, 14 et l&#39; hôte évasion immunitaire 15. La plasticité phénotypique a été bien étudiée dans la progression du cancer; cependant, les sarcomes présentent également la plasticité phénotypique. Fait intéressant, il semble que certains des mêmes facteurs de plasticité phénotypique dans les cancers contribuent également à la plasticité du sarcome et l&#39;agressivité. Par exemple, les cellules tumorales circulantes (CTC) provenant de patients atteints de sarcome ont été montrés pour exprimer EpCAM, une protéine de surface cellulaire qui se trouve généralement sur les cellules epitheliales 16. Addinellement, 250 échantillons de sarcomes des tissus mous ont été classés comme epithelial ou mésenchymateuses comme basé sur l&#39;expression des gènes. Les patients dans la signature des marqueurs biologiques epithelial avaient un meilleur pronostic que les patients avec la signature de marqueurs biologiques mésenchymateuses comme 17. Ceci est en accord avec de nombreux cancers, où les patients ayant plus carcinomes epithelial ont de meilleurs résultats par rapport aux patients avec plus de tumeurs mésenchymateuses comme 18. Alors que certains sarcomes affichent des biomarqueurs et des voies d&#39;expression des gènes compatibles avec MET, restent mal compris les fondements moléculaires de cette plasticité phénotypique. Pour étudier les mécanismes et les conducteurs de MET sarcomes, nous avons développé un modèle d&#39;induction MET en utilisant deux facteurs spécifiques à l&#39;épithélium, la microARN (miR) -200 famille et comme grainyhead 2 (GRHL2). Les miR-200 sont une famille de petits ARN non codants qui régulent l&#39;expression des gènes en se liant à la 3&#39; UTR de MessenGer ARN et en empêchant la traduction en protéine. La famille miR-200 se compose de deux sous-groupes - contenant une miR-141 et miR-200a, et l&#39;autre comprenant miR-200b, miR-200c, et miR-429. Les membres de la famille miR-200 sont enrichis dans les tissus épithéliaux, et la perte de miR-200s est associée à des métastases dans les cancers 19. La famille miR-200 est également downregulated dans les sarcomes des tissus mous par rapport aux tissus normaux 20. Tout comme les miR-200s, GRHL2 est un régulateur clé qui est important pour le développement de l&#39; épithélium 21. Le facteur de transcription GRHL2 agit de deux manières de réguler à la hausse des gènes épithéliaux, tels que la E-cadhérine: 1) Dans les cellules epitheliales, GRHL2 refoule directement le régulateur maître EMT, ZEB1 22; et 2) GRHL2 active directement la transcription de gènes 23 epitheliales. Nos enquêtes précédentes ont montré que l&#39;expression combinée de miR-200s et GRHL2 dans les cellules de sarcomeinduit un phénotype de type 24 MET. Nous présentons ici un protocole détaillé pour créer un modèle in vitro d&#39;induction MET dans les cellules de sarcome en utilisant l&#39; expression ectopique de miR-200s et GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Compteur automatisé Countess</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Lames de chambre de comptage de cellules Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Système de PCR en temps réel</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR microplaque</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit qPCR universel rapide</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Bloc de départ (PBS) Tampon de blocage</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>Tampon de blocage à base de BSA</td></tr><tr><td>Agarose Usage général LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tampon Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Tampon de fonctionnement</td></tr><tr><td>10x Tampon Tris/Glycine</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Tampon de transfert</td></tr><tr><td>Tampon RIPA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu ; m nitrocellulose</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep Kit</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA mimic negative control #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA mimic</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>milieu sans sérum</td></tr><tr><td>anticorps anti-écadhérine</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-bêta-actine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-lapin AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Inhibiteur de protéase et de phosphate</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu ; m filtre pour l’écoulement</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCTCCGAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro bleu tétrazolium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>bromure d’hexadiméthrine</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td>polybrène</td></tr><tr><td>3 mL seringue</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Filtre pour seringue stérile</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>5mL 5mL polypropylène à fond rond</td><td>352063</td><td></td><td>tubes de cytométrie en flux</td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Thermo Fisher</td><td>4368814</td><td>kit de transcription inverse</td></tr><tr><td>4 % paraformaldyhyde</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albumine sérique bovine</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induction de mésenchymateuses-épithélial transitions dans les cellules sarcome

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

La plasticité phénotypique se réfère à un phénomène dans lequel les cellules acquièrent transitoirement les traits d&#39;une autre lignée. Au cours de la progression du cancer, la plasticité phénotypique conduit l&#39;invasion, la diffusion et les métastases. En effet, alors que la plupart des études de la plasticité phénotypique ont été dans le contexte des cancers épithéliaux, il se trouve sarcomes, qui sont mésenchymateuses d&#39;origine, présentent également la plasticité phénotypique, avec un sous-ensemble de sarcomes subissant un phénomène qui ressemble à un mesenchymal- transition épithéliale (MET). Ici, nous avons développé un procédé comprenant le miR-200 et la famille grainyhead-like 2 (GRHL2) pour simuler ce phénomène MET-comme observé chez les patients du sarcome samples.We expriment séquentiellement GRHL2 et la famille miR-200 en utilisant la transduction et de transfection cellulaire, respectivement , pour mieux comprendre les fondements moléculaires de ces transitions phénotypiques dans les cellules de sarcome. les cellules exprimant Sarcome miR-200s et GRHL2 ont démontré une meilleure épithéliale caractéristique etics dans la morphologie des cellules et l&#39;altération des marqueurs biologiques épithéliales et mésenchymateuses. Les études futures utilisant ces méthodes peuvent être utilisées pour mieux comprendre les conséquences phénotypiques des processus MET-comme sur les cellules de sarcomes, tels que la migration, l&#39;invasion, la propension métastatique, et une résistance au traitement.

Schéma pour l&#39;induction MET dans les cellules de sarcome Un calendrier général pour l&#39;induction de changements MET-comme dans les cellules de sarcome est représenté sur la Figure 1. Le protocole commence par transduction GRHL2 (figure 1A), suivie par la transfection de la famille miR-200 (figure 1B). GRHL2 ou membres de la famille miR-200 ne sont pas en mesure d&#39;influ...

Nous présentons ici une méthode de culture cellulaire pour induire des transitions mésenchymateuses-épithéliale (MET) dans les cellules de sarcome basées sur l&#39;expression ectopique combinée de microARN-200 membres de la famille et comme grainyhead 2 (GRHL2). Cette méthode est adaptée pour mieux comprendre l&#39;impact biologique de la plasticité phénotypique sur l&#39;agressivité du cancer et des traitements.

L&#39;induction de mésenchymateuses-épithélial Transitions dans les cellules Sarcome

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les conséquences phénotypiques des transitions mésenchymateuses-épithéliales dans les sarcomes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant la raison pour laquelle les sarcomes de type épithélial présentent des résultats supérieurs par rapport aux sarcomes plus proches du phénotype mésenchymateux. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre un moyen simple et reproductible d'étudier les réseaux régulateurs géniques en aval et les phénotypes associés aux transitions mésenchymateuses-épithéliales dans les sarcomes.En comprenant mieux la plasticité phénotypique des sarcomes, nous espérons identifier des interventions thérapeutiques capables de faire évoluer les sarcomes vers un état épithélial plus indolent. La procédure sera démontrée par deux étudiants de premier cycle de notre laboratoire, Jackson Xu et Shivee Gilja. Le premier jour de la transduction, ensemencez trois fois dix puissance cinq cellules HEK293T dans chacun des deux puits d'une plaque de six puits, avec deux millilitres de DMEM supplémenté.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Après une culture pendant la nuit, examiner les cellules au microscope. Elles doivent être confluentes à 40 à 60 %.Ensuite, dans des tubes séparés contenant 200 microlitres de milieu sans sérum avec 1,8 microgramme de p delta 8,9 et 0,2 microgramme de plasmides auxiliaires pCMV-VSV-G, diluer deux microgrammes du vecteur vide et deux microgrammes du vecteur contenant GRHL2. Dans un autre tube, diluer quatre microlitres d’un réactif de transfection à base de lipides dans 200 microlitres de milieu sans sérum par transfection. Cela donnera un total de huit microlitres et 400 microlitres pour deux échantillons.Ajouter 200 microlitres de mélange de réactif de transfection à chaque solution de plasmide, puis incuber les échantillons pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant ce temps, utiliser un aspirateur sous vide pour éliminer le milieu des cellules HEK293T. Rincer les cellules une fois avec un millilitre de PBS, puis remplacer le PBS par 800 microlitres de milieu sans sérum.Au bout de 20 minutes, ajouter goutte à goutte 400 microlitres du mélange de plasmide et de réactif de transfection dans chaque puits des cellules en culture. Incuber la boîte pendant deux heures à 37 degrés Celsius sous 5 % de dioxyde de carbone. À l’issue de l’incubation, retirer soigneusement le milieu de transfection par aspiration sous vide.Les cellules HEK293T sont faiblement adhérentes, donc lors de l'aspiration du milieu, faites attention de ne pas détacher les cellules du fond de la boîte ou du flacon. Remplacez le milieu aspiré par deux millilitres de DMEM supplémenté. Remettez les cellules dans l'incubateur pour une culture nocturne.Le lendemain, renouvelez le milieu des cellules HEK293T transfectées, puis ensemencez trois fois dix puissance cinq cellules RD de rhabdomyosarcome humain dans chaque puits d'une plaque de six puits contenant deux millilitres par puits de DMEM supplémenté. Incubez les deux plaques toute la nuit. Au quatrième jour, utilisez une pipette pour recueillir le milieu viral des cellules HEK293T et transférez-le dans deux nouveaux tubes coniques de 15 millilitres, un pour le lentivirus contenant un vecteur vide et un autre pour le lentivirus contenant le plasmide GRHL2.Remplacer soigneusement le milieu par du DMEM frais et replacer les cellules HEK293T dans l’incubateur pendant la nuit. Ensuite, ajouter deux microlitres de polybrene à 10 milligrammes par millilitre par millilitre de milieu viral dans deux nouveaux tubes coniques de 50 millilitres, un pour la transfection avec le vecteur vide et un autre pour la transfection avec GRHL2. Retirer le piston d'une seringue de trois millilitres et fixer un filtre en polyéthersulfone de 0,45 micromètre à l'extrémité de la seringue.Ajouter le milieu viral prélevé précédemment dans le corps de la seringue et l’injecter dans l’un des nouveaux tubes coniques de 50 millilitres contenant de la polybrene. Répéter cette étape avec l’autre échantillon. Ensuite, éliminer le milieu des cellules RD par aspiration sous vide et ajouter deux millilitres de chacun des échantillons de milieu viral filtré dans des puits distincts de la plaque de cellules RD.Incuber les cellules RD à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié. Le jour suivant, répéter la collecte du milieu viral et ajouter le milieu d'infection aux mêmes puits contenant les cellules RD précédemment infectées. Les cellules HEK293T peuvent être éliminées après la collecte du milieu viral.Incuber les cellules pendant deux jours supplémentaires. Au septième jour, laver les cellules RD avec un millilitre de PBS, puis ajouter 200 microlitres de trypsine à 0,05 % dans chaque puits. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.Ajoutez deux millilitres de milieu supplémenté, puis transférez la suspension cellulaire dans de nouveaux tubes coniques de 15 millilitres. Centrifugez les cellules à 250 g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, aspirez le milieu et resuspendez les cellules dans un millilitre de DMEM supplémenté avec 5 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.Pour filtrer les cellules en vue de la cytométrie en flux, utilisez une pipette pour appliquer la suspension cellulaire RD d'un millilitre à travers un filtre stérile de 30 micromètres monté sur tube vers des tubes de cytométrie en flux. Placez les tubes sur de la glace. À l’aide d’un cytomètre en flux, triez les cellules positives pour l’EGFP dans des tubes microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 0,5 millilitre de DMEM supplémenté avec 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.Remettre les cellules triées sur de la glace. Ensemencer les cellules positives pour l'EGFP provenant des transductions avec le vecteur vide et celles avec GRHL2 dans un volume total d'un millilitre de DMEM supplémenté, dans des puits séparés d'une plaque de 12 puits. Puis placer les cellules dans l'incubateur pour la culture.Le rendement de cellules positives pour l'EGFP après cytométrie en flux est généralement assez faible, de l'ordre de 50 000 à 100 000 cellules. Pour cette raison, les cellules peuvent nécessiter une culture supplémentaire de 10 à 14 jours avant de passer à l'étape suivante. Dans un tube de microcentrifugeuse, ajouter trois microlitres de chaque mimétique de miR-200 à 50 micromolaire à 300 microlitres de milieu sans sérum.Dans un tube distinct, ajouter neuf microlitres de microARN de contrôle négatif à 50 micromolaire à 300 microlitres de milieu sans sérum. Ensuite, dans un autre tube de microcentrifugation, ajouter six microlitres de réactif de transfection spécifique à l'ARNi à 600 microlitres de milieu sans sérum. Diviser 300 microlitres de ce mélange en deux tubes, un pour chacun des deux mélanges de miARN.Combiner les 300 microlitres de chaque mélange de miR avec un mélange de 300 microlitres de réactif de transfection. Incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Pendant l'incubation, préparer une suspension cellulaire de 600 000 cellules RD positives pour EGFP exprimant le vecteur MD ou GRHL2 dans 2,4 millilitres avec 250 cellules par microlitre de milieu sans sérum par traitement.Dans une plaque 24 puits, ajouter 100 microlitres par puits du mélange miR-200 ou du contrôle négatif dans six puits. Ensuite, ajouter 400 microlitres de chaque suspension cellulaire dans trois puits de chaque mélange de miR. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en présence de 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.Le lendemain, changer le milieu par du DMEM complètement supplémenté. Récolter les cellules deux jours plus tard pour analyse en utilisant le tampon approprié. Imager chaque puits toutes les deux heures avec un objectif 10X à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes.Ces images en prise de vue instantanée montrent la transition mésenchymateuse-épithéliale, ou MET, chez des cellules RD exprimant GRHL2, EGFP et les ARNmi miR-200. Les cellules passent d'une forme allongée à une apparence en pavés, avec une augmentation des adhésions cellule-cellule et une morphologie plus arrondie. La MET n'est pas observée dans d'autres conditions de traitement.Au lieu de cela, les cellules présentent une morphologie allongée en forme de fuseau avec peu d'attachements cellule à cellule. Lors de l'induction de la MET, le changement morphologique observé dans les cellules RD suite à la surexpression de GRHL2 et de miR-200 a été accompagné d'une surexpression du marqueur épithélial E-cadhérine, mesurée par qPCR et immunotransfert. L'ajout de miR-200 a induit à lui seul la surexpression de l'E-cadhérine, mais la surexpression combinée de miR-200 et de GRHL2 a renforcé de manière synergique l'expression de l'E-cadhérine.Comme le montre la microscopie en immunofluorescence, il y a eu une augmentation, aux jonctions entre cellules, des molécules d’adhésion épithéliale EpCAM et TJP-1, indiquée par les flèches blanches. La surexpression de protéines épithéliales a été accompagnée d'une sous-expression des gènes mésenchymateux ZEB1 et Notch1, mesurée par RT-qPCR. L'induction de la transition épithélio-mésenchymateuse inverse (MET) a réduit la croissance indépendante de l’ancrage des cellules RD, évaluée par des tests de croissance en gélose molle.L'inhibition de la croissance dans l'agar mou était due uniquement aux miR-200, car la surexpression de GRHL2 a conduit à une augmentation de la croissance indépendante de l'ancrage. Ceci est conforme à des études antérieures montrant que l'expression de GRHL2 induit une croissance indépendante de l'ancrage. Après cette procédure, d'autres méthodes, notamment des tests permettant de mesurer les changements de migration cellulaire, d'invasion, de métastase et de réponse au traitement, peuvent être réalisées afin de clarifier les conséquences phénotypiques de la MET dans les sarcomes.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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