Optimisation et analyse comparative des méthodes d'enrichissement de l'ADN des plantes organiques Convient pour le séquençage de la prochaine génération

L’objectif global de cette expérience est de comparer deux méthodes utilisées pour isoler de l’ADN organellaire de haute qualité, à la fois de l’ADN de plaste et de mitochondrie, à partir de tissus foliaires végétaux qui conviennent au séquençage de nouvelle génération. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés en biologie végétale, telles que l’étendue de la diversité des organites entre les taxons et la façon dont les changements dans la séquence ou la structure du génome des organelles affectent le développement et la réponse au stress. Nous comparerons deux techniques, la méthode de centrifugation différentielle qui enrichit pour un type d’organellaire spécifique et la technique de méta-fractionnement qui récupère l’ADN organellaire total à partir de plus petits échantillons de tissus congelés.

La procédure standard pour la culture des semis de blé consiste à planter les graines dans de la vermiculite, dans des pots carrés avec quatre à six graines par coin. Transférez les pots dans une serre avec un cycle de lumière de 16 heures. Arrosez les plantes chaque jour.

Fertilisez les plantes avec un quart de cuillère à café d’engrais granulaire 20-20-20 MPK à la germination, et à nouveau sept jours après la germination. Pour l’adulation des plants de blé, plantez des graines et entretenez les plantes comme dans la procédure standard. Mais placez les pots dans une chambre de croissance sombre.

Une alternative à la culture de ces semis dans une chambre de croissance sombre consiste à couvrir les plantes dans la serre, mais avec une ventilation adéquate. La première étape de cette procédure consiste à isoler les organites. Récoltez cinq grammes de tissu frais et rincez-le à l’eau froide et stérile dans un bécher réfrigéré sur de la glace.

À l’aide de ciseaux, coupez le tissu foliaire en morceaux d’environ un centimètre directement dans un tube pré-refroidi de 50 millimètres contenant deux cylindres de broyage en céramique. Gardez les échantillons sur de la glace tout au long de la procédure. Pour éviter la contamination croisée, il est important de changer les ciseaux entre les échantillons.

Apportez les échantillons dans la hotte et ajoutez 20 millilitres de tampon STE dans chaque tube de 50 millilitres. Placez les échantillons dans des blocs de broyage cryogéniques pré-refroidis dans un appareil de broyage de tissus et broyez les échantillons pendant 30 secondes à 1 750 rotations par minute. Placez les échantillons sur de la glace pendant environ une minute.

Tournez les positions de l’échantillon et broyez pendant 30 secondes supplémentaires à 1 750 rotations par minute. Remettez les échantillons dans le seau à glace. Pour chaque échantillon, insérez un entonnoir dans un tube propre de 50 millilitres placé dans de la glace et placez une couche de tissu filtrant dans l’entonnoir.

Pré-mouillez le tissu filtrant avec cinq millilitres de tampon STE et enregistrez le flux. Versez le tissu homogénéisé dans l’entonnoir. Rincez le tube de broyage avec 15 millilitres de tampon STE, rebouchez et retournez le tube pour rincer les parois et le couvercle et versez son contenu dans l’entonnoir.

Retirez délicatement les pierres en céramique, puis pressez et essorez le tissu de filtration dans l’entonnoir. Pour éviter la contamination croisée, changez de gants entre les échantillons. Enveloppez les bouchons des tubes avec un film de paraffine pour éviter tout déversement.

Centrifugeuse à 2 000 x G, à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique, aspirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille et placez-le dans un tube à centrifuger à grande vitesse de 50 millilitres avec un joint d’étanchéité étanche. Placez un petit bécher de glace sur une balance, déchirez la balance et pesez chaque surnageant.

Utilisez un tampon STE pour équilibrer les tubes à 0,1 gramme près, puis centrifugez-les à 18 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Une fois la centrifugation terminée, retourner les échantillons dans la hotte et jeter le surnageant. Ajoutez un millilitre de tampon ST à la pastille et remettez doucement en suspension à l’aide d’un pinceau doux.

Ajoutez 24 millilitres de tampon ST pour obtenir un volume final de 25 millilitres. Faites tourner doucement le pinceau dans une suspension pour mélanger, puis appuyez sur le pinceau sur le côté d’un tube pour enlever tout le liquide avant de retirer le pinceau. Après avoir équilibré les tubes, centrifugez à 18 000 x G à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Au cours de cette centrifugation, préparer la solution d’ADN 1 comme décrit dans le protocole textuel et aliquote de 200 microlitres dans un tube de 1,5 millilitre par échantillon. Lorsque la centrifugation est terminée, jetez le surnageant et épongez le tube. Dans chaque tube de centrifugation à grande vitesse, ajoutez 300 microlitres de tampon STE et remettez le granulé en suspension à l’aide d’un pinceau doux.

Placez le pinceau dans le tube de 1,5 millilitre préalablement préparé contenant 200 microlitres de la solution d’ADN 1 et faites tourner le pinceau pour éliminer toute pastille résiduelle coincée dans le pinceau. Pipetez la solution d’ADN 1 dans le tube de centrifugation à grande vitesse et remuez doucement pour mélanger. Enroulez un film de paraffine autour du haut de chaque tube et incubez à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 30 minutes.

Pendant l’incubation, mélanger délicatement en remuant. À l’aide d’une pointe de pipette à large orifice, pipetez doucement le mélange de granulés hors du tube et placez-le dans un tube à faible liaison de 1,5 millilitre. Ajoutez 500 microlitres d’EDTA de 400 millimolaires, pH 8,0 dans le tube de centrifugation à grande vitesse.

Pipetez doucement pour éliminer complètement la pastille résiduelle et transférez l’EDTA dans le tube à faible liaison contenant le mélange de granulés. Mélanger délicatement par inversion. Centrifugeuse à 18 000 x G, à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.

Par la suite, jetez le surnageant, épongez chaque tube et utilisez immédiatement la pastille pour l’isolement de l’ADN. Dans cette méthode, l’ADN organellaire est enrichi à partir de l’ADN génomique total qui a été extrait à l’aide de colonnes d’extraction d’ADN commerciales. Préparez la quantité requise de billes magnétiques liées aux protéines MBD2 FC, conformément aux instructions du fabricant, et échelonnez les réactions pour utiliser entre un et deux microgrammes d’ADN d’entrée total.

Dans cette démonstration, 160 microlitres de billes sont nécessaires pour un microgramme d’ADN d’entrée total. Pour capturer de l’ADN nucléaire méthylé, ajoutez un microgramme d’ADN d’entrée dans un tube contenant 160 microlitres de billes magnétiques liées à MBD2 pour chaque échantillon individuel et pipetez doucement de haut en bas avec une pointe à large alésage. Ajoutez le volume approprié de tampon de lavage de liaison 5x pour une concentration finale de 1x et pipetez l’échantillon de haut en bas avec une pointe à large alésage, quelques fois pour mélanger.

Faites pivoter les tubes à température ambiante pendant 15 minutes. Pour le succès de la traction, il est essentiel de bien mélanger les billes pendant l’incubation, en particulier s’il y a un agglutination important des billes. Pour éviter l’agglutination des billes et pour assurer l’extraction de l’ADN méthylé, pipetez doucement les échantillons avec une pointe de pipette à large diamètre et effleurez les échantillons deux à trois fois tout au long de l’incubation.

Faites tourner brièvement les tubes contenant le mélange d’ADN et de billes magnétiques. Placez les tubes sur une grille magnétique pendant au moins cinq minutes pour recueillir les billes sur le côté des tubes. La solution doit sembler claire, elle contient de l’ADN enrichi en organellaires non méthylés.

À l’aide d’embouts à alésage large, retirez soigneusement le surnageant dégagé sans déranger les billes et transférez le surnageant dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres propre et à faible liaison. Conservez les échantillons à 20 ou 80 degrés Celsius. Un test PCR aigu a été utilisé pour évaluer les abondances relatives de trois implications spécifiques d’organites dans l’ADN génomique total et la fraction d’ADN organellaire obtenue à partir des deux méthodes.

Dans l’ensemble, les données indiquent que la méthode de centrifugation différentielle, enrichit préférentiellement les mitochondries. La fraction non méthylée de l’ADN génomique total méthylfractionné montre un enrichissement substantiel des deux implicons organellaires. Les pourcentages de lectures associées aux génomes de référence des mitochondries ou des chloroplastes chinois de printemps et de blé cultivé par Chris sont cohérents avec les résultats de la QPCR.

La centrifugation différentielle produit de l’ADN plus enrichi en ADN mitochondrial, et le fractionnement méthylique produit de l’ADN qui reflète probablement l’abondance native des deux génomes organellaires. Les étiquettes d’échantillons, y compris E, désignent les échantillons idyllés et NE désignent les échantillons non idyllés. Il est intéressant de noter que l’idyllation n’a pas changé l’abondance des organellaires.

Dans les deux méthodes, la couverture théorique des génomes référencés par les mitochondries ou les chloroplastes dépasse 100 fois, même lorsque 12 banques sont atremultiplexées. L’ADN génomique total migre sous forme de frottis diffus dans l’électrophorèse sur gel post-terrain et dépasse 50 kilobases. La fraction nucléaire après méthylfractionnement diminue en taille, mais reste centrée autour de 50 kilobases, ce qui suggère que l’ADN méthylfractioant est le plus approprié pour le séquençage à lecture longue.

Une fois maîtrisées, les deux techniques d’extraction d’ADN organellaire peuvent être effectuées en un à deux jours, de la collecte de l’échantillon à l’évaluation du produit final, si elles sont effectuées correctement. La technique de méthylfractionnement a le potentiel d’élargir considérablement la gamme des études d’ADN organellaire à des échantillons rares et difficiles, car les apports tissulaires sont extrêmement faibles. Cependant, la centrifugation différentielle peut toujours être préférable lorsque seul l’ADN des mitochondries est nécessaire pour les études en aval.

De même, les étapes de centrifugation peuvent être ajustées pour extraire préférentiellement l’ADN des plastes si nécessaire. Les deux méthodes d’extraction d’ADN organellaire produisent un ADN adapté au séquençage de nouvelle génération, mais le fractionnement par méthyle produit un ADN à haut débit moléculaire, idéal pour le séquençage à lecture longue.