Une approche fondée Spectrométrie liquide tandem chromatographie-masse pour l'analyse des Métabolite

L'objectif général de cette méthode d'échantillonnage est de récolter des échantillons de métabolites à partir de Staphylococcus aureus en vue de leur quantification ultérieure par chromatographie liquide en tandem couplée à la spectrométrie de masse. Notre laboratoire s'intéresse à l'étude des interactions entre le métabolisme et la pathogenèse chez des bactéries pertinentes pour la santé humaine. Actuellement, nous utilisons la bactérie pathogène opportuniste humaine Staphylococcus aureus comme organisme modèle.

Une question clé à laquelle nous souhaitons répondre est de savoir comment les bactéries ajustent leur physiologie et leur pathogénicité lorsqu'elles sont confrontées à une carence en nutriments pendant l'infection de l'hôte. Cette technique présente l'avantage de fournir un aperçu de la répartition de métabolites spécifiques parmi les nombreuses voies métaboliques présentes dans des cellules en croissance active, avec une perturbation minimale de leur état physiologique. Pour commencer, réalisez un isolement par stries des souches de S.aureus d'intérêt sur gélose au soja tryptique à partir du stock glycérol congelé.

Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Le jour suivant, inoculer 4 mL de bouillon trypticase soja, ou TSB, dans des tubes d'incubation en verre stériles avec des colonies isolées de chaque souche. Incuber les cultures, inclinées avec rotation, à 37 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures.

Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la densité optique des cultures à 600 nanomètres, abrégée en OD600. À l’aide de cette mesure, diluez les cellules à une OD600 de 0,05 dans 50 mL de milieu TSB stérile, dans des flacons Delong de 250 mL. Incubez les cultures à 37 degrés Celsius dans un bain-marie avec agitation à 280 tr/min.

Toutes les 30 minutes, effectuez des mesures d'OD600. À mesure que les densités optiques augmentent, il peut devenir nécessaire de diluer les cultures avec du TSB afin de les maintenir dans la plage d'absorbance linéaire du spectrophotomètre. Pendant que les cellules se développent, préparez fraîchement les solutions tampons d'extraction en utilisant des réactifs de la pureté la plus élevée disponible, comme décrit dans le protocole écrit.

Lorsque les cultures atteignent une DO600 comprise entre 0,8 et 1,0, repiquez-les dans 50 mL de TSB frais préalablement réchauffé à une DO600 de 0,01 à 0,05, puis répétez les étapes d'incubation et de mesure. Préparez un lit de dioxyde de carbone solide broyé dans un récipient approprié, tel qu'un plat en verre, un seau à glace ou une glacière. Lorsque les densités optiques des cultures approchent le point de récolte souhaité, ajoutez 1 mL de solution d'arrêt dans une boîte de Pétri de 35 mm non traitée et prérefroidissez-la sur de la glace sèche pendant au moins 5 minutes.

Pour nos besoins, le point de récolte souhaité correspond à une densité optique d'environ 0,4 à 0,5. Toutefois, cette valeur peut varier selon les objectifs expérimentaux. Ensuite, insérez un fritté en acier inoxydable dans un bouchon en caoutchouc, puis placez-le sur un ballon à vide relié à une aspiration centrale ou à une pompe à vide.

Appliquez le vide et placez une membrane en ester de cellulose mixte par-dessus. Utilisez un filtre ayant le même diamètre que le fritté afin de s'assurer que toutes les cellules sont récupérées. Il est essentiel de recueillir les cellules et d'interrompre l'activité métabolique le plus rapidement possible, afin d'obtenir un instantané des abondances métaboliques dans une condition donnée.

Même de légers retards peuvent affecter la physiologie en état stationnaire des cellules. À une DO600 comprise entre 0,4 et 0,5, utilisez une pipette serologique pour prélever 13 mL de culture à partir du flacon. Appliquez immédiatement l'échantillon sur le filtre.

Une fois que l'échantillon entier a été filtré, laver immédiatement le filtre avec au plus 5 mL de PBS glacé afin d'éliminer les métabolites associés au milieu. Ensuite, déconnecter l'aspiration et utiliser une paire de pinces stériles pour retirer le filtre du fritté. Retourner le filtre dans la solution de trempage prérefroidie.

Incuber le filtre dans la solution d'arrêt sur de la glace sèche pendant au moins 20 minutes. À l’aide de pinces stériles, retourner le filtre dans la boîte de Pétri et utiliser une micropipette pour rincer les cellules de la membrane dans la solution d'arrêt. Resuspendre les cellules dans la solution d'arrêt, puis transférer la suspension cellulaire dans un tube stérile résistant aux chocs de 2 mL contenant environ 100 microlitres de billes de silice de 0,1 mm.

Conserver ceci sur de la glace sèche ou à 80 degrés Celsius. Pour commencer l'extraction des métabolites, décongeler d'abord les échantillons sur de la glace fondante. Ensuite, lyser les cellules dans un homogénéisateur avec quatre impulsions de 30 secondes à 6000 tr/min, en intercalant des périodes de refroidissement de deux minutes sur de la glace sèche entre chaque cycle.

Clarifier les lysats pendant 15 minutes dans un tube de microcentrifugeuse prérefroidi à vitesse maximale. Après la centrifugation, transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugeuse propre. À l’aide d’une micropipette, transférer une petite portion de l’échantillon dans un tube de microcentrifugeuse pour la quantification de la teneur résiduelle en peptides, comme décrit dans le protocole écrit.

Conserver le reste de l'échantillon à 80 degrés Celsius. Se référer au protocole écrit pour l'analyse des métabolites par chromatographie liquide et spectrométrie de masse. Le mutant nul de CodY a été utilisé pour étudier l'appauvrissement en acides aminés à chaîne ramifiée, car la protéine CodY régule l'expression de dizaines de gènes en réponse à la baisse de concentration de ces nutriments.

La mutation codY a peu d'effet sur la vitesse de croissance des cellules de S.aureus. La baisse de la densité optique au moment de 3 heures indique l'étape de redilution, qui augmente le nombre de divisions cellulaires avant la récolte et dilue diverses molécules accumulées pendant la croissance nocturne. Une analyse de séquence ARN des transcriptomes des deux souches révèle des changements significatifs dans l'expression des gènes impliqués dans la synthèse de la famille d'acides aminés dérivés de l'aspartate.

Ici, les nombres indiqués sous les noms des gènes indiquent le changement d'expression en fonction de l'expression dans un mutant nul de codY, par rapport à la souche sauvage. Après la quantification par LC-MS des métabolites extraits, les abondances entre les deux souches ont été comparées. En se concentrant sur certains composés liés à la famille d'acides aminés dérivés de l'aspartate, les abondances des précurseurs, tels que l'aspartate et l'O-acétylhomo­sérine, sont réduites chez le mutant codY.

En revanche, les produits finaux tels que la thréonine et l'isoleucine sont augmentés. Ici, la ligne pointillée indique le seuil de modification de l'abondance pour cette expérience. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment extraire des métabolites de Staphylococcus aureus afin de les quantifier par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse.

Ce protocole est également adapté, avec des modifications, à la récolte de métabolites provenant d'autres espèces bactériennes. Étant donné que les bactéries réagissent à des environnements dynamiques, il est important d'effectuer rapidement les étapes de filtration et de lavage afin de minimiser les éventuelles modifications physiologiques induites par l'échantillonnage. Ces modifications peuvent également être réduites en maintenant le fritté et le PBS au froid pendant l'échantillonnage.