Un dosage de point à 5 mC Quantification du niveau de méthylation d'ADN de la Dedifférenciation des chondrocytes In Vitro

L’objectif global de cette expérience est de déterminer les niveaux de 5-méthylcytosine pendant la dédifférenciation des chondrocytes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le traitement des défauts du cartilage à base cellulaire, tels que l’implantation de chondrocytes autologues. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode fiable, simple et rapide pour détecter le niveau général de méthylation de l’ADN afin d’évaluer le phénotype des chondrocytes.

L’implication de cette technologie est standard pour notre part d’implantation de chondrocytes autologues, car la méthylation de l’ADN pendant la dédifférenciation des chondrocytes est un obstacle majeur pour le traitement de l’implantation de chondrocytes autologues pour les défauts du cartilage. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des niveaux de méthylation de l’ADN dans la dédifférenciation des chondrocytes, elle peut également être appliquée à d’autres études de maladies, telles que l’arthrose. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode en lisant les protocoles dans les références d’une méthode dot blot.

S’il vous plaît montrer que la démonstration de cette méthode est critique car les états d’un tache de point sont difficiles à nommer. L’ADN génomique doit être dénaturé puis dilué en série. Ensuite, il est soutenu par une membrane en nylon chargée positivement.

La démonstration des procédures sera faite par Zhaofeng Jia, un étudiant diplômé de notre laboratoire. Les tissus cartilagineux articulaires utilisés dans cette étude ont été isolés des articulations du genou de patients donneurs après un traumatisme. À l’aide d’un scalpel stérile, coupez le cartilage en morceaux d’un à deux millimètres cubes.

Ajoutez ensuite un milligramme par millilitre de collagénase II et de DMEM au cartilage haché. Et incubez à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures pour digérer les chondrocytes. Le lendemain, filtrez la suspension cellulaire résultante à travers une crépine de 40 micromètres.

Faites tourner les cellules. Jetez le surnageant, ajoutez PBS et tournez à nouveau. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Et des graines à une densité de 20 000 à 30 000 cellules par centimètre carré et du DMEM complété par 10 % de FBS et 1 % de pénicilline streptomycine. Culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Récoltez des cellules subconfluentes à l’aide de 0,25 % de trypsine EDTA.

Et replaquez à une densité de 6 600 cellules par centimètre carré. Cultivez les chondrocytes en monocouches sur un maximum de six passages et évaluez-les aux passages un, deux, trois, quatre et cinq. Pour commencer cette procédure, prélever des cellules par trypsinisation et centrifugation.

Ensuite, remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon de lyse pour 10 millions de cellules par pipetage et inversion rapide. Incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ajouter la protéinase K à une concentration de 160 microgrammes par millilitre de lysat cellulaire et inverser vigoureusement le mélange.

Incuber pendant six heures à 55 degrés Celsius. Ajouter à chaque échantillon un volume de phénol saturé Tris pH 7,9 pour du chloroforme pour de l’alcool isoamylique. Agitez soigneusement l’échantillon à la main pendant environ 20 secondes.

Centrifugez les échantillons à température ambiante à 13 000 fois G pendant cinq minutes. Retirez la phase aqueuse supérieure et transférez-la dans un tube frais. Pour éliminer le phénol, ajoutez un volume égal de chloroforme dans chaque tube.

Secouez à la main et tournez. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un tube frais. Ajouter 0,1 volume d’échantillon de trois molaires d’acétate de sodium pH huit et deux volumes d’éthanol à 100 %.

Stockez les tubes à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit pour précipiter l’ADN génomique. Le lendemain, centrifugez les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 16 000 fois G pour granuler l’ADN génomique. Lavez les échantillons avec de l’éthanol à 70 %.

Et centrifugez à quatre degrés Celsius pendant deux minutes à 13 000 fois G. Retirez le surnageant avec précaution et séchez la pastille d’ADN à l’air. Remettez l’ADN en suspension dans un tris de 10 millimolaires à un pH de huit 0,1 millimolaire. Commencez cette procédure en dénaturant l’ADN isolé dans de l’hydroxyde de sodium de 0,1 molaire pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius.

Neutralisez l’ADN avec une molaire d’acétate d’ammonium sur de la glace. Et puis diluez deux fois avec de l’eau distillée doublement. L’étape la plus critique des tests de transfert de points est le repérage des échantillons, et n’oubliez pas de le faire lentement et soigneusement.

Essayez de réduire chaque réseau de points à trois ou quatre millimètres de diamètre. À l’aide d’une pointe de pipette à bouche étroite, repérez soigneusement deux microlitres d’ADN génomique dilué en série sur une membrane en nylon chargée positivement au centre de la grille. Épongez la membrane à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, bloquez les sites de liaison des anticorps non spécifiques en trempant la membrane dans 5 % de BSA dans du TBST dans une boîte de Pétri de 10 centimètres pendant une heure à température ambiante en secouant doucement. Au bout d’une heure, lavez la membrane trois fois dans du TBST pendant cinq minutes à chaque fois. Incuber la membrane avec un anticorps monoclonal anti-5-méthylcytosine de souris dans du TBST à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, lavez la membrane trois fois dans du TBST pendant cinq minutes à chaque fois. Incuber ensuite avec un anticorps secondaire, de la peroxydase de raifort, conjugué de mouton, d’immunoglobuline G de mouton dans du TBST pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé la membrane dans le TBST comme précédemment, ajoutez le substrat enzymatique à la membrane et incubez pendant cinq à 10 minutes.

Enfin, visualisez le signal de l’anticorps secondaire à l’aide d’un kit de chimiluminescence selon les instructions du fabricant. Les chondrocytes cultivés en monocouche jusqu’au passage six ont montré des changements phénotypiques progressifs, devenant fortement pincés et aplatis au fil des passages successifs. Ce changement de morphologie est typique du processus de dédifférenciation des chondrocytes.

L’ADN génomique a été isolé des chondrocytes après un nombre variable de passages et les niveaux de méthylation de l’ADN ont été évalués par un test de transfert de points spécifique à la 5-méthylcytosine. L’intensité des points a ensuite été analysée par l’image J.Des taux progressivement élevés de cinq taux de méthylcytosine ont été observés avec une sous-culture prolongée, suggérant une association entre des niveaux de méthylation généralement accrus et la dédifférenciation des chondrocytes. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 24 heures si elle est exécutée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de maximiser la concentration et la pureté de l’ADN génomique. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que le profilage de l’ADN génomique peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les chondrocytes de dédifférenciation en monoculture. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’implantation de chondrocytes autologues pour évaluer la machination de l’ADN des chondrocytes et déterminer le phénotype des chondrocytes dans le traitement des défauts cartilagineux.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser le 5-Methylcytosine dot blot pour détecter le levier de machination dégénéré afin d’évaluer le phénotype des chondrocytes. N’oubliez pas que travailler avec du phénol peut être extrêmement dangereux et que des gants doivent toujours être portés lors de cette procédure.