Multi-couche Cortical Ca

L'objectif général de cette procédure est de permettre la visualisation simultanée de l'activité neuronale dans plusieurs couches de neurones corticaux à l'aide d'indicateurs calciques chez une souris libre de ses mouvements, et de comprendre le fonctionnement des circuits neuronaux en utilisant un microscope à fluorescence miniaturisé monté sur la tête. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences des systèmes, telles que : comment l'information se propage-t-elle à travers plusieurs couches du cortex ? Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de visualiser de grandes populations de neurones génétiquement codés à travers plusieurs couches corticales chez des animaux libres de leurs mouvements, de manière fiable et répétée dans le temps.

Afin de visualiser des neurones génétiquement codés provenant de plusieurs couches corticales chez un animal libre de ses mouvements, les procédures suivantes doivent être réalisées ; ce protocole met l'accent sur l'implantation de la sonde à prisme, l'installation de la platine de base et l'imagerie in vivo chez une souris libre de ses mouvements. Pour commencer cette procédure, une à deux semaines après l'injection du virus, placez l'animal dans l'appareil stéréotaxique et préparez-le à la chirurgie d'implantation de la sonde à prisme en la désinfectant avec de l'éthanol à 70 % et en la nettoyant avec du papier-lentille. Ensuite, ouvrez une craniotomie ronde à l'aide d'une microfraise équipée d'une fraise de 0,5 millimètre.

Veiller à ce que le diamètre de la craniotomie soit légèrement plus grand que celui du prisme. Ensuite, positionner la craniotomie de sorte que, lorsque le prisme est inséré dans le cortex, son bord plat soit orienté vers le site d'injection du virus et se trouve à une distance de 150 à 200 microns. Puis, retirer la dure-mère à l’aide de fines pinces.

Gardez toujours le tissu humide avec du sérum physiologique stérile, une fois que le tissu cérébral est exposé. Cela permettra également de maintenir la pression sur le tissu. Pour soulager la pression dans le tissu cérébral pendant l'insertion de la sonde à prisme, créez un trajet d'insertion en fixant un couteau de dissection à bord droit au bras du porte-électrode de l'appareil stéréotaxique.

Montez-le en oblique, de sorte que la plaque du couteau soit perpendiculaire à la courbure du crâne et dans un plan parallèle à la colonne d'injection du virus. Positionnez soigneusement le couteau au-dessus de la craniotomie, le long de son bord médian interne et à environ 200 micromètres en latéral par rapport au site d'injection du virus, le tranchant orienté vers la partie postérieure. Réglez l'axe Z à zéro lorsque la pointe du couteau touche la pie.

Ensuite, abaissez-le progressivement à une profondeur permettant l'insertion de la sonde à prisme. Puis, déplacez le couteau d'un millimètre vers l'arrière afin de créer un passage pour le bord avant du prisme. Rétirez lentement le couteau à l'aide du manipulateur micrométrique du bras stéréotaxique par incréments de 10 microns par seconde, et placez un morceau d'éponge en mousse de gel imprégnée de sérum physiologique stérile sur l'incision.

Ensuite, fixer le support de lentille au bras du manipulateur stéréotaxique selon le même angle que celui du couteau à l'étape précédente. Aligner le prisme de manière à ce que sa face plane se trouve au-dessus de l'incision et parallèlement à la colonne d'injection du virus. Une fois le prisme positionné à l'angle correct, l'abaisser progressivement dans le cerveau par incréments de 10 microns jusqu'à un niveau Z final de 1,1 millimètre par rapport à la surface du cerveau, pour cette sonde.

Couvrez tout tissu exposé autour du prisme dans la craniotomie avec une couche très fine d’adhésif élastomère protecteur, à l’aide d’une aiguille de 25 g. Pour empêcher le lentille de bouger à l’intérieur de la craniotomie, une fois l’adhésif élastomère polymérisé, utilisez une aiguille de 25 g pour appliquer un adhésif cyanoacrylate afin d’attacher le verre de la lentille du prisme au crâne adjacent par-dessus la couche d’adhésif élastomère. Une fois l’adhésif cyanoacrylate polymérisé, dévissez le porte-lentille et retirez soigneusement le microscope.

Ensuite, rétractez lentement le bras du manipulateur stéréotaxique afin de laisser la sonde à prisme solidement implantée. Appliquez une couche d'acrylique dentaire ou d'adhésif cyanoacrylate autour de l'implant, de manière à recouvrir la surface osseuse exposée sans toucher les tissus musculaires rétractés environnants. Le fait de recouvrir une grande partie du crâne avec ce capuchon crânien aidera ultérieurement à la fixation de la plaque de base.

Ensuite, mélangez le catalyseur et la base provenant d'une seringue d'adhésif au silicone et déposez une goutte d'élastomère à l'intérieur du manchon de la sonde à prisme, de manière à recouvrir la partie supérieure de la lentille de la sonde, afin d'éviter tout dommage et l'accumulation de poussière. Une semaine à dix jours après l'implantation de la sonde à prisme, vérifiez l'expression du virus dans le tissu à travers la sonde à prisme implantée. Pour ce faire, retirez le bouchon en adhésif au silicone situé au-dessus de la surface de la lentille de la sonde à prisme implantée.

Examinez la surface de l'objectif de la sonde et nettoyez délicatement tout débris à l’aide d’un papier pour objectif et d’éthanol à 70 %, afin de garantir que la surface d’imagerie soit propre. Ensuite, fixez une plaque de base au microscope et serrez la vis de fixation de la plaque pour la maintenir en place. Puis, fixez fermement le microscope dans le porte-objectif du bras du micromanipulateur stéréotaxique.

Fixer le support à une tige pouvant être montée sur le bras du micromanipulateur stéréotaxique. Ensuite, positionner le microscope au-dessus de la lentille de la sonde à prisme à l’aide du bras du micromanipulateur stéréotaxique. Vérifier visuellement l’orientation en observant la lentille du prisme depuis les côtés latéral et postérieur de la platine de l’animal.

L'axe optique de l'objectif du microscope et de la sonde à prisme doit être aligné. Ensuite, lancez le logiciel d'acquisition, sélectionnez le projet et activez la LED du microscope via le logiciel. Évaluez la qualité de l'alignement du microscope en mettant au point sur la phase supérieure de la lentille de la sonde à prisme implantée dans le logiciel d'acquisition, en déplaçant le bras manipulateur du stéréotaxique.

Lorsqu'il est correctement aligné, les bords de la lentille de la sonde en prisme doivent apparaître nets. Ajuster la distance physique du microscope au-dessus de la sonde en prisme implantée, à l'aide du bras manipulateur stéréotaxique, afin d'obtenir le plan focal souhaité à l'intérieur du tissu. Ensuite, utiliser de l'acrylique dentaire ou du cyanoacrylate pour fixer de façon permanente la plaque de base sur le capuchon en acrylique afin de combler l'espace.

Il est essentiel de ne pas appliquer d'adhésif sur une partie du corps du microscope ou sur la vis de blocage lors de la fixation de la plaque de base sur la tête de l'animal. Détachez maintenant le microscope du préhenseur et retirez le préhenseur du microscope. Si un adhésif cyanoacrylé ou un autre adhésif transparent a été utilisé, recouvrez-le de vernis à ongles noir ou d'une couche de ciment dentaire noir afin d'éviter toute fuite de lumière ambiante dans le capuchon crânien, ce qui pourrait contaminer les images futures acquises pendant les expériences.

Ensuite, protégez la sonde à prisme implantée à l’aide du couvercle de la plaque de base. Dans cette procédure, branchez le microscope à son boîtier d’acquisition de données connecté à l’ordinateur et lancez le logiciel d’acquisition. Puis, retirez le couvercle de la plaque de base en tournant la vis de réglage de la plaque de base dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et en soulevant le couvercle de la plaque de base.

Placer le microscope sur la plaque de base située sur l'animal. Le microscope doit se verrouiller en place à l'aide des aimants présents sur la plaque de base. Ensuite, avancer la vis de réglage de la plaque de base jusqu'à ressentir une légère résistance.

Ensuite, sélectionnez les paramètres d'acquisition à utiliser pour recueillir les données, notamment la fréquence d'images pour la capture des données. Vérifiez l'histogramme de l'image lors du choix des paramètres afin de garantir un bon rapport signal sur bruit. Puis, commencez l'acquisition des données.

Lorsque l'enregistrement est terminé, desserrer la vis de fixation de la plaque de base et détacher le microscope de la plaque de base en soulevant doucement le microscope. Ensuite, remettre le couvercle de la plaque de base en place et resserrer délicatement la vis de fixation de la plaque de base. Voici une démonstration d'un animal équipé du microscope, interagissant librement avec les objets dans l'arène comportementale.

Lors de l'imagerie comportementale éveillée à l'aide du système, l'activité des neurones corticaux somesthésiques a été enregistrée lorsque la souris était exposée à trois environnements différents : champ ouvert le premier jour, familiarisation avec un objet du deuxième au quatrième jour, et objet nouveau le cinquième jour. Après l'extraction des cellules à l'aide du logiciel d'analyse des données d'imagerie calcique, des filtres spatiaux correspondant aux emplacements des cellules ont été superposés à la projection de l'intensité moyenne de fluorescence des données d'enregistrement du microscope.

Une ligne pointillée blanche sépare les couches composées de deux, trois et cinq cellules. Les tracés correspondants du calcium provenant de cinq cellules de chacune des couches montrent le modèle d'activité des cellules dans deux contextes comportementaux différents : la familiarisation avec un objet et l'exposition à un objet nouveau. Les cellules des couches deux et trois étaient plus actives que les cellules de la couche cinq le jour où la souris a été exposée à un objet nouveau.

Voici le reste des tracés d'activités cellulaires provenant des entités superficielles, lorsque l'animal se trouvait en champ ouvert, lors de la familiarisation avec un objet et lors de l'exploration d'un objet nouveau. Une fois maîtrisées, chacune de ces techniques peut être réalisée en moins d'une heure si elle est correctement exécutée. Après son développement, cette technique ouvre la voie aux chercheurs en neurosciences systémiques pour explorer des types cellulaires spécifiques dans différentes régions cérébrales, tout en exploitant divers paradigmes comportementaux dans des modèles de neurophysiologie saine et pathologique.

À partir de ce protocole, on devrait avoir une bonne compréhension de la manière d'étiqueter plusieurs couches du cortex somesthésique, d'implanter une sonde à prisme et de fixer un microscope miniaturisé monté sur la tête.