Méthode électrophysiologique pour les enregistrements de la pince à tension intégrale à partir de

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des enregistrements en blocage de tension en configuration tout-cellulaire à partir d'une cellule photoréceptrice unique afin de mesurer les courants induits par la lumière résultant de l'absorption d'un unique photon ainsi que les réponses répétées à une lumière intense. Cette méthode peut contribuer à aborder des questions clés du domaine de la transduction sensorielle, telles que la transduction visuelle, tant au niveau des mécanismes physiques que ioniques sous-jacents à la phototransduction, ainsi que les propriétés des canaux TRP. Les avantages liés à l'utilisation de cette technique incluent un contrôle complet de la tension membranaire, un rapport signal-sur-bruit extrêmement élevé, et la possibilité d'introduire des indicateurs spécifiques pour des mesures optiques.

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés face à la taille minuscule du prélèvement et à la nécessité d'effectuer la dissection rapidement en raison d'une vulnérabilité métabolique temporelle. Pour cette procédure, élever les mouches à une densité d'environ 20 par flacon. Au moment de l'expérience, disposer de quelques flacons contenant des pupes sur le point d'être scellées et ayant été maintenues en obscurité constante pendant au moins 24 heures.

Deux heures avant de collecter les adultes, retirez tous les adultes éclos. Manipulez toujours les mouches adaptées à l'obscurité avec des compresses sous une lumière rouge. Pendant l'attente des mouches fraîchement écloses, préparez la chambre d'enregistrement.

Fixez la lame couvre-objet sur le fond de la chambre à l’aide de paraffine fondue ou de graisse de silicone à haut vide afin de compléter le bain. Ensuite, fixez le bain sur la platine du microscope inversé. Placez dans le bain le tube du système de perfusion, le tube du système d’aspiration et le fil de masse pour le dispositif d’électrophysiologie.

Avant de commencer la dissection, préparez quelques solutions sur la face inférieure d'une boîte de Pétri de 60 millimètres. Déposez quatre gouttes séparées de ES sans calcium et une goutte de TS. Maintenant, à l'aide de pinces grossières, saisissez une mouche ayant récemment éclos par les ailes ou le corps. Puis, à l'aide de pinces fines, détachez la tête et transférez rapidement celle-ci dans la première goutte de ES sans calcium. Sous un stéréomicroscope, divisez la tête en deux moitiés selon le plan sagittal à l'aide d'une deuxième paire de pinces fines.

Veillez à ce que les deux yeux restent intacts. Transférez ensuite la moitié de la tête dans la deuxième goutte de solution ES sans calcium et l'autre moitié de la tête dans la troisième goutte de solution ES sans calcium. Procédez ensuite au dissection de l'un des deux yeux.

À l’aide de fines pinces, retirer autant que possible les tissus entourant l’œil afin de ne causer aucun dommage à la rétine. Ensuite, saisir fermement le bord de la cornée avec les pinces fines et extraire délicatement la rétine. Le résultat doit être une cornée vide mais intacte, séparée d’une rétine également intacte.

Les pipettes sont conservées dans de l'éthanol ; par conséquent, lors de l'utilisation d'une nouvelle pipette de trituration, rincez-la toujours d'abord avec de l'eau. Remplissez ensuite la pipette rincée avec un petit volume de milieu ES sans calcium provenant de la quatrième goutte. Puis, à l'aide d'une aspiration douce par la bouche, aspirez la rétine isolée dans la pipette.

Évitez avec une extrême prudence de piéger des bulles d'air. Déposez ensuite la rétine dans la goutte de TS. Répétez ensuite l'isolement de la rétine sur le deuxième œil afin que les deux soient désormais dans la goutte de TS. Essuyez ensuite délicatement uniquement l'ES sans calcium de la boîte de Pétri et ajoutez six gouttes supplémentaires de TS à la surface de la boîte.

Transférez les deux rétines dans de nouvelles gouttes de TS. Remplacez ensuite la pipette de trituration par une pipette présentant une ouverture de petit diamètre. Après l’avoir rincée, remplissez la pipette avec une goutte de TS. À l’aide de cette pipette, aspirez et expulsez rapidement et à plusieurs reprises les deux rétines afin de séparer certains ommatidies des cellules pigmentaires. Le TS deviendra trouble au fur et à mesure.

Ensuite, transférez les restes des deux rétines vers une autre goutte de TS. Puis, chargez la pipette avec la goutte de TS trouble contenant les ommatidies isolées. Expulsez la solution dans la chambre de bain. Répétez cette procédure à l’aide de pipettes de trituration dont le diamètre diminue progressivement jusqu’à ce que la rétine soit complètement dissoute.

Maintenant, attendez une minute. Pendant cette pause, les ommatidies isolées adhéreront au fond de la chambre. Après une minute, commencez à faire circuler du milieu ES contenant 1,5 millimolaire de calcium à l’aide du système de perfusion.

Pendant le remplissage de la chambre, veillez à ce que le fil de masse et le tube d'aspiration soient immergés. Laissez s'écouler la solution pendant 60 à 90 secondes avant de poursuivre. Commencez par utiliser l'objectif 40x pour examiner attentivement les ommatidies dans le bain.

Remarquez que les corps allongés des cellules photoréceptrices formant l'ommatidie sont détachés de leurs axones mais restent viables. Choisissez maintenant un ommatidie approprié pour l'expérience. Sélectionnez-le lorsqu'il répond aux critères suivants.

La membrane externe doit être lisse et intacte. L'axe longitudinal doit former un angle proche de l'angle droit par rapport à l'approche de l'électrode depuis le côté distal. En outre, l'ommatidie ne doit pas être entourée de tissu excédentaire.

Une fois sélectionné, centrez l'ommatidie dans le champ de vision. Remplissez maintenant une pipette avec la solution intracellulaire appropriée pour l'expérience. Et insérez la pipette dans le porte-électrode.

Ensuite, soufflez dans le tube de la pipette pour créer une pression positive, puis verrouillez cette pression en fermant la vanne du tube. Insérez ensuite la pipette dans la chambre de bain et approchez-la de la section distale de l'ommatidie jusqu'à l'apparition d'un petit affaissement dans la membrane, dû à la pression positive exercée par la pipette en place. Ouvrez maintenant le module de test de membrane dans le logiciel d'enregistrement afin d'appliquer des impulsions carrées continues de deux millivolts à une fréquence de 100 hertz.

Ensuite, à l'aide des commandes de l'amplificateur de patch clamp, réglez le potentiel de jonction à zéro afin de positionner la base de l'impulsion carrée à un courant nul. Ouvrez ensuite la vanne pour relâcher la pression dans la pipette et aspirez doucement pour créer une pression négative. La pipette doit alors s'attacher à la membrane cellulaire.

Une fois ceci effectué, fermez la vanne pour maintenir la pression. Vérifiez maintenant la résistance de l'électrode. Elle doit être élevée, comprise entre 100 et 150 mégohms.

Ensuite, relâchez la pression négative dans la pipette en ouvrant à nouveau la vanne. La résistance doit maintenant passer brusquement entre un et deux gigaohms, ce qui indique qu'un scellement a été formé entre la pipette et la cellule. Ensuite, à l'aide de l'amplificateur de patch-clamp, compensez le courant capacitif de la pipette.

Pour obtenir la configuration en cellule entière, rompez la membrane cellulaire par aspiration buccale. Appliquez de brèves impulsions rapides et fortes de pression négative dans l'électrode. Dès que la configuration en cellule entière est obtenue, une augmentation soudaine de la capacité se produit.

Ensuite, à l'aide de l'amplificateur de patch-clamp, réglez le potentiel de maintien à la tension requise et compensez les courants capacitifs en série avec la résistance. Fermez maintenant le rideau noir français de la cage de Faraday et commencez l'expérience. Après avoir obtenu la configuration en mode cellule entière à l'aide d'une micropipette contenant le colorant fluorescent, le jaune de luciférine, on observe que seul un des photorécepteurs formant l'ommatidie a été chargé avec le colorant.

Ce photorécepteur sera également isolé électriquement de ses voisins dans l'ommatidie. Des ommatidies en enregistrement en voltage en configuration tout-cellulaire provenant de mouches de type sauvage et de mouches présentant des mutations dans les gènes InaC ou InaD ont montré des « quantum bumps » en réponse à une lumière faible continue. Une terminaison lente des « bumps » a été observée chez les deux mutants par rapport aux mouches de type sauvage.

Réponses normalisées à des impulsions lumineuses de 500 millisecondes délivrées à 150 000 photons par seconde, les physiologies modifiées sont clairement illustrées. À l’aide de ce montage, il a même été possible de mesurer les réponses de quantum bump en enregistrement en tension en cellule entière à une lumière faible d’une durée d’une milliseconde. De telles réponses à un seul photon ont été comparées chez des mouches de type sauvage, des mutants de l’arrestine et des mutants ninaC.

Les deux mutants ont répondu par une série de pics. Réponses normalisées à une impulsion lumineuse de 500 millisecondes délivrée à 15 000 photons par seconde. Ainsi, la terminaison lente de la réponse macroscopique est observée chez les mutants arrestine-2 et ninaC.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser des enregistrements en configuration tout-cellule sur des cellules photoréceptrices de Drosophile. Une fois maîtrisée, cette technique peut être effectuée en une heure si elle est réalisée correctement. Cette méthode a permis aux chercheurs de mieux comprendre les canaux TRP et la signalisation par les lipides d'inositol, ainsi que le rôle des cellules ganglionnaires rétiniennes intrinsèquement photosensibles présentes chez les mammifères, qui sont impliquées dans des activités dépendantes de la lumière non liées à la formation d'image.