Name: Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez une méthode complète pour identifier et caractériser les granulés de stress dans les cellules U-2 OS humaines en combinant immunofluorescence et hybridation in situ fluorescente.

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Nous remercions les membres des laboratoires Ivanov et Anderson pour leur discussion utile et leurs commentaires sur ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les instituts nationaux de santé [GM111700 et CA168872 à PA, NS094918 à PI], le Centre national des sciences en Pologne [accorder UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 à WS]. WS reconnaît également le ministère de la Science et de l&#39;Enseignement supérieur en Pologne (Programme Mobility Plus) et la Commission Fulbright polonaise-américaine pour leur soutien financier à ses recherches aux États-Unis.

1. Préparation cellulaire <ol><li> Ajouter des lamelles autoclavées à 12 puits d&#39;une plaque à 24 puits, comme indiqué sur la figure 1A ; Cela peut se faire en utilisant une pipette Pasteur stérile attachée à un vide pour retirer chaque lamelle. Tapotez délicatement le lamelle sur le côté du puits pour relâcher l&#39;aspiration, ce qui permet à la lamelle de couler de tomber dans le puits. </li><li> Plaque 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) cellules d&#39;ostéosarcome par puits à un volume final de 500 μL de milieu. Déplacez la plaque de côté à côté et de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément. </li><li> Appuyez délicatement sur les lamelles vers le bas avec une pointe propre P1000 pour s&#39;assurer que la lamelle se trouve au fond du puits et qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles sous la lamelle. </li></ol> 2. Stressing Cells <ol><li> Le lendemain, vérifiez visuellement la plaque pour s&#39;assurer que les cellules sont uniformément dispersées et confluent uniformément à travers le lamelle, car les variations entre la saLes robots peuvent avoir un impact négatif sur la reproductibilité des résultats. Utilisez un objectif 10X sur un microscope à culture tissulaire inversée. </li><li> Préchauffer le milieu à 37 ° C. Évitez d&#39;appliquer des fluides froids ou chauds sur les cellules, car elles provoquent un choc thermique ou un choc thermique, respectivement. </li><li> Diluer les médicaments dans les milieux préchauffés. Pour chaque concentration de médicament différente, préparer 2 puits contenant 500 μL de milieu. Préparez 500 μL supplémentaires pour permettre une perte pendant le pipetage. Aliquot 4 tubes contenant chacun 1,5 mL. <ol><li> Pour l&#39;arsénite de sodium: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 1,5 μl d&#39;arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 100 μM) ou ajouter 0,75 μl d&#39;arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 50 μM). </li><li> Pour la vinorelbine: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 22,5 μL de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 150 μM) ou ajouter 18,75 μl de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 100 μM). NOTE: arsénite de sodium<html> Est un inducteur de granulés de contrainte bien caractérisé et couramment utilisé et est donc classiquement utilisé comme témoin positif. </li></ol></li><li> Retirer et jeter le support des puits B1 - 4 et C1 - 4. Ajouter les médias avec des médicaments et attendre 60 minutes (Figure 1A). <ol><li> Ajouter 500 μL de milieu avec de l&#39;arsénite de sodium 100 μM aux puits B1 et B2. Ajouter 500 μL de milieu avec de l&#39;arsénite de sodium 50 μM aux puits B3 et B4. </li><li> Ajouter 500 μL de milieu avec 150 μM de vinorelbine aux puits C1 et C2. Ajouter 500 μL de milieu avec 125 uM de vinorelbine aux puits C3 et C4. </li></ol></li><li> 30 min avant la fixation, traiter les puits dans la colonne 2 avec 5 μL de cycloheximide (1 mg / mL de stock) et les puits dans la colonne 4 avec 2 μL de puromycine (1,25 mg / ml de stock). Faites glisser doucement la plaque pour mélanger avant de remettre la plaque dans l&#39;incubateur à 37 ° C. </li></ol> 3. Fixation cellulaire et immunofluorescence Nt &quot;&gt; REMARQUE: Avant l&#39;expérience, assurez-vous que le méthanol est refroidi à -20 ° C. Effectuez des tampons, y compris la solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum de cheval normal (NHS) dans le PBS et 4% de paraformaldéhyde (PFA ) Dans PBS. <ol><li> Jeter les médias et laver les puits contenant des lamelles avec PBS. Selon les médicaments utilisés, il pourrait être important de rejeter correctement les médias contenant des médicaments; Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des instructions spécifiques. Pour laver efficacement, remplissez une bouteille de compression avec PBS, réduisez la pointe afin de permettre un écoulement doux plutôt qu&#39;un flux serré, et utilisez cette option pour ajouter du PBS à chaque puits après avoir aspiré le PBS d&#39;origine. </li><li> Fixer les cellules en utilisant ~ 250 μL de PFA à 4% pendant 15 minutes à TA sous agitation douce. Recouvrez complètement le dessus de la lamelle avec PFA; 250 μL devrait être suffisant, mais sinon, ajouter plus. Évitez toujours de pipeter directement sur les lamelles, car certaines cellules (ou traitements de stress des cellules) peuvent modifier l&#39;attachement et tIl force de pipeter peut déloger les cellules. </li><li> Retirez le PFA et lisez-le correctement. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur la façon de rejeter correctement le paraformaldéhyde. </li><li> Ajouter ~ 250 μL de methanol (-20 ° C) et incuber pendant 5 minutes à TA sous un basculement doux; Cela permette et stabilise les cellules. </li><li> Retirer et jeter le méthanol et bloquer les cellules en appliquant ~ 250 μL de NHS à 5% pendant 1 h à TA O / N à 4 ° C. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur le rejet correct du méthanol. </li><li> Pour les anticorps primaires, diluer les anticorps dans 5% de NHS. REMARQUE: L&#39;utilisation de plusieurs marqueurs SG est essentielle pour confirmer si les granulés observés sont des SG de bonne foi . Le nombre de marqueurs SG pouvant être utilisés dépend des filtres disponibles au microscope. Si des ensembles de filtres verts, rouges et lointains standard sont disponibles, utilisez G3BP1, eIF4G et eIF3b à une dilution 1/250. <ol><lI&gt; Pour cette expérience (12 comprimés à 250 μL chacun-Total: 3 mL de NHS à 5%), ajouter 12 μL de chacun des éléments suivants: anti-G3BP1, anti-eIF3b et anti-eIF4G. Incuber les anticorps primaires en agitant doucement pendant au moins 1 h à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. </li></ol></li><li> Laver les puits 3x avec du PBS et incuber chaque lavage pendant 5 min. </li><li> Pour les anticorps secondaires, diluer tous les anticorps secondaires (dilution 1/250) et le colorant Hoechst (1/1 000 de dilution) dans du NHS à 5%. <ol><li> Pour cette expérience (12 comprimés à 250 μL chacun - Total: 3 mL de NHS à 5%), ajouter 12 μL de chacun des éléments suivants: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit et Cy5-Goat (une dilution de 1/250 de chaque ) Et ajouter 3 μL de colorant Hoechst. </li><li> Incuber les lamelles avec les anticorps secondaires pendant 1 h à la température ambiante. Pendant cette étape et les étapes suivantes, protégez les échantillons de la lumière en recouvrant la plaque avec une boîte ou en plaçant du papier d&#39;aluminium sur le dessus du plat de culture de tissus. </li></ol></li><li> Lavez nousLls trois fois avec PBS pendant 5 min chacun. </li><li> Monter les lamelles sur des lames de verre marquées à l&#39;aide d&#39;un support de montage. Chauffer le milieu de montage dans un bloc de chaleur de 37 ° C pendant 10 min; Cela diminue la viscosité et facilite la pipette. Avec une pointe P200 coupée, pipettez 25 μL de support de montage par lamelle sur une glissière en verre; 4-8 lamelles couvrent une glissière en verre, en supposant que le stade du microscope le permet. À l&#39;aide de pinces fines, transférez la lamelle du puits à la glissière, en vous assurant de mettre le côté de la cellule vers le bas sur le support de montage. À l&#39;aide d&#39;une pointe P200 propre, appuyez sur la lamelle vers le bas. </li><li> Une fois que tous les lamelles ont été montées, utilisez un tissu de laboratoire plié pour nettoyer l&#39;excès de support en appuyant sur le tissu de laboratoire très fermement sur la glissière. Utilisez une bouteille de compression contenant H 2 O pour rincer le surplus de support et répétez la tache avec du tissu de laboratoire plié pour enlever l&#39;eau. </li></ol> 4. Fluorescence In Situ &lt;/ Em&gt; Hybridation (FISH) <ol><li> Placer et traiter les cellules, en utilisant les étapes 1 et 2.1-4 comme guide; Il suffit de plaquer les cellules dans la colonne 1, car seulement 3 lamelles sont nécessaires dans l&#39;expérience suivante. </li><li> Assurez-vous que tous les tampons sont préparés ( c&#39;est-à-dire 4% de PFA dans PBS, 70% d&#39;éthanol dans l&#39;eau, 2x de saline-citrate de sodium (SSC) et 5% de NHS), que le méthanol soit refroidi à -20 ° C et Le four à hybridation est chauffé jusqu&#39;à la température appropriée. </li><li> Effectuer les étapes 3.1-3.3 pour laver et réparer les cellules. </li><li> Perméabiliser les cellules en ajoutant -20 ° C de methanol pendant 10 min. </li><li> Retirer le méthanol et incuber les lamelles dans l&#39;éthanol à 70%. Placez la plaque à 4 ° C pendant la nuit. Sceller la plaque en utilisant du parafilm pour éviter l&#39;évaporation. </li><li> Le lendemain, enlever l&#39;éthanol et réhydrater les cellules en ajoutant 500 μL de 2x SSC. Incuber les lamelles pendant 5 minutes avec une agitation douce à la température ambiante. </li><li> Retirez le SSC 2x et ajoutez 500ΜL de 2X SSC. Incuber pendant 5 minutes sous agitation douce. </li><li> Placez un morceau de parafilm à plat au fond du four à hybridation. Pipettez 25 μL de tampon d&#39;hybridation sur le parafilm pour chaque lamelle coulissante. Retirez le lamelle du plat de 24 puits (à ce stade, les lamelles sont à la cellule vers le haut) et placez le coté de la lamelle vers le bas vers le bas sur le tampon d&#39;hybridation. Faites ceci à 42 ° C ou éventuellement à 65 ° C pendant 15 min. REMARQUE: l&#39;achèvement de cette étape à 65 ° C dénatronera les ARN cellulaires; Cela peut améliorer le signal si le polyA est masqué par des interactions avec des protéines. </li><li> Diluer la sonde Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μL) dans un tampon d&#39;hybridation à une concentration de 2 ng / μL; 25 μL par lamelle est suffisante. </li><li> Pour chaque lamelle, pipettez 25 μL de tampon d&#39;hybridation contenant Biotin-Oligo (dT) sur le parafilm. Ramassez la lamelle avec une pince et appuyez délicatement sur le bord de la lamelle sur un tissu de laboratoire pour enlever l&#39;excèsTampon d&#39;hybridation. Transférer le lamelleau au tampon d&#39;hybridation avec Biotin-Oligo (dT); N&#39;oubliez pas de garder le côté de la cellule vers le bas. </li><li> Placez les lamelles dans une boîte d&#39;hybridation pour limiter l&#39;évaporation. Incuber les lamelles avec Biotin-Oligo (dT) dans un tampon d&#39;hybridation pendant 60 min à 42 ° C. </li><li> Placez 2x SSC dans le four d&#39;hybridation pour lui permettre de s&#39;équilibrer à 42 ° C. </li><li> Ajouter ~ 500 μL de SSC 2x réchauffé dans les puits dans le plat à 24 puits et utiliser une pince pour transférer les lamelles dans le puits. Incuber pendant 10 min. </li><li> Répétez l&#39;étape de lavage ci-dessus deux fois à 42 ° C puis deux fois à la température ambiante. </li><li> Effectuez les étapes 3.5-3.10, en vous assurant d&#39;utiliser un fluorochrome de streptavidine pour détecter le Biotin-Oligo (dT) au lieu d&#39;un anticorps classique. </li></ol> 5. Ensemble de ribopuromycylation pour évaluer le statut translationnel <ol><li> Placer les cellules U2OS sur les lamelles, comme indiqué à l&#39;étape 1, mais seulement une lamelle couvre une assiette par condition (dans cetteCas, 3 lamelles: nontreated, arsénite de sodium 100 μM et 150 uM de vinorelbine) ( figure 1 A). </li><li> Cellules de stress utilisant le protocole à l&#39;étape 2, complétant les étapes 2.1-2.4. </li><li> 5 min avant la fixation, ajouter 2 μL de puromycine (stock: 1,25 mg / mL, diluer 2 μL dans 500 μL pour obtenir une concentration finale de puromycine de 5 μg / mL) et 2,9 μL d&#39;emetine (stock: 20 μg / mL, ajouter 2,9 μL à la même solution contenant déjà la puromycine) à chaque puits contenant 0,5 ml. </li><li> Effectuez les étapes 3.1-3.10 comme indiqué ci-dessus, en utilisant un anticorps anti-puromycine (dilution 1/1000) pour détecter la puromycine. Idéalement, utilisez deux autres marqueurs SG dans les canaux restants. </li><li> Lors de la quantification du signal de puromycine, prenez toutes les images en utilisant la même exposition. Choisissez cette exposition en utilisant l&#39;échantillon le plus brillant (non résolu) et en prenant une image aussi brillante que possible sans saturation. NOTE: L&#39;intensité du signal fluorescent anti-puromycine represUne traduction continue, car la puromycine se substitue à un acide aminé, incorpore la protéine naissante et applique la terminaison prématurée de la protéine. </li></ol> 6. Acquisition et analyse d&#39;images <ol><li> Quantifier les granulés de stress <ol><li> Pour quantifier les SG, acquérir 3 à 5 images totalisant 100 cellules par échantillon en utilisant un objectif 40X. Sinon, obtenez des images en utilisant d&#39;autres objectifs, mais assurez-vous que&gt; 100 cellules sont comptées par lamelle et que le grossissement est suffisamment grand pour visualiser clairement les granulés. Faites ceci en divisant la lamelle en cinq régions à peu près égales et en choisissant au hasard un champ de chaque région ( Figure 1B ); Les images du même champ devraient inclure tous les canaux pour évaluer la colocalisation des marqueurs. </li><li> Une fois que toutes les images ont été acquises, fusionnez les chaînes. Un logiciel de caméra fera automatiquement cela, tandis que d&#39;autres nécessitent une fusion manuelle; Cela peut se faire avecImageJ en ouvrant toutes les images puis en sélectionnant [Image | Couleur | Fusionner les canaux]. </li><li> Notez manuellement le nombre total de cellules en comptant le nombre de noyaux, en utilisant Hoechst comme marqueur de noyau. Comptez manuellement le nombre de cellules qui contiennent plus de deux SG par cellule. REMARQUE: par exemple, en utilisant une image fusionnée à trois canaux affichant G3BP1 (vert), eIF4G (rouge) et Hoechst (bleu), comptez les noyaux (ou nombre de cellules) à l&#39;aide de la chaîne bleue. Ensuite, comptez les cellules SG positives comme celles avec deux focus jaunes ou plus par cellule. Les granulés apparaîtront en jaune, car le vert de G3BP1 et le rouge de eIF4G apparaissent jaunes s&#39;ils sont colocalisés. </li><li> Déterminer le pourcentage de cellules SG positives en combinant les données des 3 à 5 régions indépendantes, puis calculer: Nombre de SG positif / nombre de noyaux) * 100 = pourcentage de cellules SG positives </li></ol></li><li> Évaluation de la colocalization par analyse de balayage de ligne - Méthode manuelle <ol><li> OuvrirImageJ. Téléchargez-le gratuitement depuis () </li><li> Ouvrez le gestionnaire de ROI: [Analyser | Outils | Responsable ROI ...]. </li><li> Ouvrez l&#39;image fusionnée dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir]. </li><li> À l&#39;aide de l&#39;outil de ligne situé dans la barre d&#39;outils ImageJ, ajoutez une ligne qui passe par un SG, en vous assurant d&#39;inclure avant et après le SG. Ajoutez cette ligne au gestionnaire de ROI en cliquant sur [Ajouter] dans la fenêtre du gestionnaire de ROI. </li><li> Diviser l&#39;image fusionnée en canaux séparés pour évaluer la localisation de chaque marqueur dans le granulé: [Image | Couleur | Split Channel]; Cela divise l&#39;image fusionnée en trois images en noir et blanc. </li><li> Dans l&#39;image en noir et blanc, assurez-vous que la ligne est sélectionnée; La ligne est sélectionnée si elle apparaît dans l&#39;image. Sinon, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur la ligne dans le panneau; Cela mettra en évidence la ligne en bleu dans la fenêtre du gestionnaire de ROI et rendra la ligne visible sur l&#39;image en noir et blanc. Si la ligne n&#39;apparaît toujours pas, assurez-vous que &quot;Afficher tout&quot; est chEcked dans le gestionnaire de ROI, puis cliquez sur la ligne dans l&#39;image. </li><li> Analyser l&#39;intensité de la ligne: [Analyser | Profil de traçage]; Cela affichera la fenêtre &quot;Profil de tracé&quot;, qui trace l&#39;intensité du signal sur la ligne. </li><li> Dans la fenêtre &quot;Profil de tracé&quot;, cliquez sur [Liste], qui affiche une fenêtre contenant les données brutes du graphique. Copiez toutes les données dans cette fenêtre et collez-la dans un fichier de tableur. Pour ce faire, sélectionnez toutes les données dans la fenêtre: [Modifier | Tout sélectionner]. Copiez la date: [Modifier | Copie]. Ouvrez un fichier de tableur et collez les données: [Editer | Coller]. </li><li> Effectuez les étapes 6.2.6 - 6.2.8 pour chaque canal séparément. Assurez-vous de suivre la chaîne évaluée. </li><li> Dans une feuille de calcul, générez un graphique linéaire des résultats. Sélectionnez les colonnes qui incluent des données en appuyant sur [contrôle] et en cliquant sur la lettre en haut de chaque colonne. Ensuite, sélectionnez le graphique linéaire: [Insérer | Graphique linéaire]. </li><li> Répétez cette analyse pour multIple stress granules à travers plusieurs expériences indépendantes. </li></ol></li><li> Évaluation de la localisation par analyse de balayage linéaire - Plugin ImageJ <ol><li> Téléchargez et installez l&#39;outil de profil RVB à partir du site Web ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Lorsqu&#39;il est correctement installé, une icône rouge, verte et bleue (RVB) devrait apparaître dans la barre d&#39;outils. </li><li> Ouvrez l&#39;image ( par exemple, Tiff, JPG) dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir]. </li><li> Cliquez sur l&#39;icône RVB située dans la barre d&#39;outils ImageJ. </li><li> Cliquez et faites glisser pour ajouter une ligne qui s&#39;étend à travers un SG, en vous assurant d&#39;inclure des régions adjacentes; Une image de l&#39;histogramme apparaîtra dans une fenêtre contextuelle. </li><li> Enregistrez les données sous forme d&#39;image: [Fichier | Enregistrer sous | Tiff]. Sinon, exportez, puis graphez les données dans un autre programme graphique en utilisant l&#39;étape 6.2.8 ci-dessus. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Comme en témoignent les études immunohistologiques dans de multiples maladies, le stress chronique conduit à la formation de différents foyers intracellulaires. Par exemple, la plupart des maladies neurodégénératives sont caractérisées par des agrégats intracellulaires de protéines insolubles. La présence de protéines associées à SG dans de tels agrégats est souvent la base pour conclure que ces foyers sont des SG. Une conclusion similaire est également établie lorsque des foctes cytoplasmiques positives au marqueur SG ...

Les cellules utilisent de nombreux mécanismes pour répondre au stress. Certaines réponses se produisent au niveau post-transcriptionnel et impliquent la régulation de la traduction et / ou de la stabilité de l&#39;ARNm 1 , 2 . L&#39;arrestation et la dégradation translationnelle de l&#39;ARNm modulée par le stress sont associées à la formation de foyers cellulaires non mémarchiques spécifiques, les plus classés étant les Granules de Stress (SG) 3 . Les SG sont des foyers cytoplasmiques qui concentrent les mRNP non traduits dans des cellules qui ont réussi à réagir au stress ( p. Ex., Oxydation, choc thermique, altération des nutriments et infection virale) 4 . En plus des mRNAs non traduits, les SG contiennent des facteurs d&#39;initiation de la traduction, des protéines de liaison à l&#39;ARN et diverses protéines de signalisation 5 . Les SG sont des biomarqueurs de la traduction inhibitrice des protéines et de l&#39;altération du métabolisme de l&#39;ARN et ont été liés à la survie cellulaire et à l&#39;apoptose, la voie de signalisationS, et les processus nucléaires 5 . Les SG sont des entités dynamiques, et leur formation est étroitement liée à l&#39;état de la traduction cellulaire 6 . En dépit de leur aspect apparemment solide, la plupart des composants de la protéine SG passent rapidement et à l&#39;extérieur, avec un temps de séjour de secondes. Alors que les SG persistent pendant des minutes, la plupart de leurs composants sont en flux rapide. L&#39;inhibition de l&#39;initiation de la traduction et le désassemblage conséquent des polysomes de traduction favorisent la formation de SG; Ainsi, les SG sont en équilibre avec la traduction des polysomes. Cet équilibre de polysome / SG est la clé pour distinguer les SG de bonne foi des autres foyers induits par le stress 6 , 7 . L&#39;initiation à la traduction d&#39;arrestation implique la conversion de complexes de pré-initiation compétents en traduction qui contiennent des ARNm, des facteurs d&#39;initiation de la traduction (EIF) et des sous-unités ribosomales 40S (s)<html> O-called complexes 48S) dans des complexes qui sont paralysés en translation (complexes appelés 48S *) qui peuvent s&#39;unir aux SG 4 , 6 . Les SG sont favorisés par l&#39;arrestation translationnelle à deux étapes différentes en amont de la formation complexe 48S: interférence avec les fonctions du complexe eIF4F de liaison de cap ( par exemple, ciblant sa sous-unité eIF4A) ou la phosphorylation de la sous-unité α du facteur d&#39;initiation de la traduction eIF2, médiée par une Ou plus des quatre kinases eIF2. La présence de complexes 48S bloqués ( c.-à-d. Sous-unités ribosomales 40S et facteurs d&#39;initiation de traduction sélectionnés) est une caractéristique des SG 8 , 9 . Les SG ont été liés à divers états pathologiques, tels que les infections virales, la neurodégénérescence, l&#39;auto-immunité et le cancer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Les formes mutées de plusieurs composants SG sont associées à des maladies neurodégénératives ( par exemple, une sclérose latérale amyotrophique) dans laquelle les neurones présentent des inclusions pathologiques intracellulaires pouvant jouer un rôle actif dans la mort neuronale 13 . Certains virus détournent les composants SG pour inhiber la formation du SG et pour améliorer la replication virale 14 . Des études récentes associent également les SG au cancer 15 et à la survie des cellules cancéreuses dans les traitements de chimiothérapie et de radiothérapie 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Bien que de tels résultats aient suscité un grand intérêt pour la biologie SG, bon nombre des rapports publiés manquent de contrôles importants pour distinguer la formation de SG d&#39; une bonne foi d&#39;autres foyers induits par le stress. Les SG ont d&#39;abord été décrits comme des foyers cytoplasmiques non mécontentés composés de protéines de liaison à l&#39;ARNm sélectionnées (RBP), y compris l&#39;antigène ntracellulaire à cellules T 1 (TIA-1) et la protéine à liaison poly-A (PABP); Facteurs d&#39;initiation de la traduction; ARNm polyadénylé; Et petites sous-unités ribosomales 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionnellement, leur composition a été déterminée par des techniques telles que l&#39;immunocoloration et l&#39;expression ectopique de protéines marquées par fluorescence 23 , 24 . En raison de leur nature très dynamique, l&#39;immunocolorisation des protéines SG et / ou des ARNm reste la méthodologie déterminante pour la détection des SG 23 , 24 . À ce jour, de nombreux RBP et autres protéines (plus de 120 protéines distinctes) sont décrits comme composants SG 11 . Autant de SLes protéines localisées G changent leur localisation à la fois de manière indépendante du stress et indépendantes et peuvent s&#39;accumuler à d&#39;autres compartiments et foyers intracellulaires, il est important de choisir des marqueurs SG corrects et d&#39;utiliser des critères fonctionnels pour distinguer les SG d&#39;autres types de stress induit Les foyers. Les SG de bonne qualité contiennent des ARNm, des facteurs d&#39;initiation de la traduction et de petites sous-unités ribosomales et sont en équilibre dynamique avec la traduction. Ce flux de travail simple est conçu pour déterminer si les foyers induits par le stress sont des SG de bonne foi . Ce flux de travail comprend plusieurs approches expérimentales utilisant des cellules U2OS, des cellules couramment utilisées pour étudier les SG. Ces cellules sont idéales, car elles ont un grand cytoplasme, sont relativement plates et s&#39;attachent fortement aux lamelles de verre. D&#39;autres types de cellules peuvent être utilisés pour étudier les SG, mais il est important de savoir que les différences de temps, de concentration de médicament et d&#39;abondance de protéines de nucléation SG peuvent modifier la cinétique et la compositionSition. En outre, certaines cellules répondent à la fixation du paraformaldehyde en formant des bulles de surface cellulaire, ce qui donne alors une apparence ruffée qui provoque la localisation ponctuelle de certains marqueurs SG; Sans analyse minutieuse, ceux-ci peuvent être mal classés en SG. Cela met en évidence la nécessité d&#39;évaluer tous les critères requis pour identifier les foyers induits par le stress en tant que SG de bonne foi . La vinorelbine (VRB), une thérapeutique contre le cancer qui favorise les SG 20 , ainsi que l&#39;arsénite de sodium (SA), un inducteur SG robuste et bien caractérisé, sont utilisés comme contraintes pour les expériences de ce protocole. Les SG canoniques contiennent de multiples marqueurs SG (à la fois des protéines et des ARNm) qui se placalisent dans les foyers cytoplasmiques. Ce protocole utilise à la fois l&#39;immunofluorescence et l&#39;hybridation in situ fluorescente (FISH) pour détecter la localisation des marqueurs de protéines et de l&#39;ARNm polyadénylé 22 , respectivement. En bref, l&#39;immunofluorescence indirecte utilise des anticorps ( i.E. Anticorps primaires) spécifiques d&#39;une protéine donnée pour la détecter dans la cellule. Ensuite, les anticorps secondaires (habituellement spécifiques à l&#39;espèce) attachés aux fluorochromes reconnaissent l&#39;anticorps primaire et révèlent la localisation des protéines cibles. La microscopie fluorescente est utilisée pour détecter le signal localisé dans la cellule. L&#39;utilisation d&#39;anticorps produits dans différentes espèces et leur détection avec des anticorps secondaires de couleur différente permet de détecter la localisation de multiples anticorps, ce qui indique que leurs cibles protéiques se trouvent au même endroit 23 . Il est important de sélectionner des marqueurs qui ont été vérifiés pour la colocalisation dans les SG de bonne foi . FISH utilise une sonde marquée qui se base sur une séquence d&#39;ARN ou d&#39;ADN spécifique 25 . Pour détecter l&#39;ARNm, ce protocole utilise une sonde oligo (dT) 40 biotinylée qui s&#39;hybride (ou paires de bases) à la queue polyA de l&#39;ARNm ( c&#39;est-à-dire polyA FISH). La sonde biotinylée est alors détectée en utilisant une streptavidine à conjugaison fluorescente, car la streptavidine a une forte affinité pour la biotine. Lors de l&#39;évaluation des SG, il est important de coupler PolyA FISH avec immunofluorescence détectant un marqueur SG, comme dans les SG SG de bonne foi , les deux signaux devraient être localisés. En utilisant ce protocole, la colocalisation est évaluée de multiples façons. Dans une image multi-canal ( c&#39;est-à-dire RVB: rouge, vert et bleu), la colocalisation modifie la couleur du signal superposé ( p. Ex ., Le rouge colocalisé et le vert apparaissent en jaune) 23 . En outre, la colocalisation est quantifiée graphiquement en utilisant l&#39;analyse de balayage de ligne, où l&#39;intensité de chacune des couleurs est mesurée sur une ligne donnée 8 , 20 . Ce protocole décrit deux procédures d&#39;analyse de balayage en ligne utilisant ImageJ 26 . Une procédure est manuelle et passe à travers le processus entier,L&#39;autre utilise une macro, ou un programme simple qui automatise les étapes manuelles. Il est important de passer par le programme manuel pour comprendre la procédure macro. Les SG se forment dans les cellules où la traduction est réprimée; Par conséquent, les cellules avec SG devraient afficher des niveaux réduits de traduction globale par rapport aux cellules non traitées. Expérimentalement, la ribopuromycylation est utilisée. La puromycine et l&#39;emétine sont ajoutées aux cellules pendant une courte durée avant la fixation, ce qui permet à la puromycine d&#39;incorporer dans la formation active de polypeptides, provoquant la terminaison 27 , 28 . Le traitement par emetine est nécessaire pour empêcher le redémarrage 29 . La puromycine peut ensuite être détectée en utilisant un anticorps anti-puromycine, en donnant un instantané de la traduction active. Cette méthode est utilisée car elle est rapide, ne requiert pas de pré-affamer avec un milieu dépourvu d&#39;un acide aminé particulier (et potentiellement précontrainte des cellules) et révèle leLocalisation subcellulaire de la traduction des protéines. D&#39;autres procédés, notamment l&#39;utilisation d&#39;analogues d&#39;acides aminés modifiés, tels que l&#39;analogue de la méthionine L-azidohomoalaine (AHA), couplé à la chimie 30 &quot;cliquable&quot;, ont été utilisés pour montrer que les cellules contenant des SG présentent une traduction beaucoup plus faible que les cellules voisines 31 . Cependant, cette technique nécessite une famine de méthionine suivie d&#39;un étiquetage des impulsions pendant 15 à 30 minutes. La famine de la méthionine constitue un stress supplémentaire, tandis que le temps d&#39;étiquetage long ( c&#39;est- à -dire 15-30 min) aboutit à la mesure de la traduction cumulative plutôt que continue et permet également aux protéines nouvellement synthétisées de passer de leur site de synthèse à leur destination finale cellule. En revanche, la ribopuromycylation est beaucoup plus rapide et compatible avec n&#39;importe quel milieu, comme le milieu sans glucose utilisé pour induire des SG à cause de la famine du glucose. Les SG canoniques sont en équilibre dynamiqueAvec la traduction active de polysomes. Ceci peut être évalué expérimentalement en traitant des échantillons avec les médicaments qui stabilisent ou déstabilisent les polysomes, réduisant ainsi l&#39;équilibre entre les SG et les polysomes 23 . Le cycloheximide (ou l&#39;emetine, qui se comporte de la même manière) bloque l&#39;allongement par la «congélation» des ribosomes sur l&#39;ARNm, diminuant ainsi le pool de mRNP non polysomaux disponibles pouvant former des SG. D&#39;une manière expérimentale, cela peut être utilisé de deux façons: en ajoutant du cycloheximide (ou de l&#39;emetine) avant le stress pour éviter la formation de SG ou en ajoutant du cycloheximide (ou de l&#39;emetine) après la formation des SG, même sans enlever l&#39;agent contraignant, provoquant le désassemblage du SG, comme paralysé Des complexes de préinitiation sont admis lentement dans la fraction de polysome. En revanche, la puromycine provoque une terminaison prématurée et favorise le désassemblage des polysomes, ce qui augmente le nombre d&#39;ARNm initiateurs capables de se constituer en SG. Expérimentalement, le traitement par la puromycine augmente le nombre de SG ou abaisse le thresholD à laquelle ils se forment en réponse à un stress gradué ou à un dosage médicamenteux. Lors de l&#39;évaluation de l&#39;effet de la puromycine, il est important d&#39;utiliser un niveau sous-maximal de la drogue d&#39;intérêt, car on s&#39;attend à ce que la puromycine augmente l&#39;effet du médicament et augmente le pourcentage de cellules présentant des SG - cela ne peut pas se produire si le médicament / Stress provoque des SG dans 100% des cellules initialement. Cela contraste avec le traitement par cycloheximide, qui désassemble les SG et fonctionne mieux lorsque ~ 95% des cellules présentent initialement des SG afin que la plus grande diminution possible puisse être observée et quantifiée avec précision. Ce protocole fournit un cadre pour étudier les SG dans les cellules de mammifères. Les méthodes comprennent: (1) la coloration immunofluorescente et l&#39;analyse de l&#39;imageJ pour évaluer la colocalisation des marqueurs classiques associés au SG eIF4G, eIF3b et la protéine liant les protéines activant Ras GTPase 1 (G3BP1) dans les SG putatifs; (2) l&#39;hybridation in situ par fluorescence oligo (dT) (polyA FISH) pour détecter l&#39;ARNm polyadénylé; (3) le traitement par cycloheximide et puromycine pour déterminer si les foyers induits par le stress sont en équilibre dynamique avec les polysomes; Et (4) la ribopuromycylation pour évaluer l&#39;état de translation des cellules contenant des SG putatifs. Ensemble, ces analyses peuvent déterminer si les foyers induits par le stress peuvent être classés comme SG de bonne foi .

<table><tbody><tr><td>U-2 OS</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg ; HTB-96&commerce ;</td><td>Communément écrit « U2OS" Culture à 37 &deg ; C sous 5 % de CO2 dans 10 % de FBS/DMEM</td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>Contient 4,5 g/L de glucose, de pyruvate et de rouge de phénol Complété par 10 % de FBS, 10 mM HEPES et de la pénicilline/steptomycine Préchauffage Dilution du (des) médicament(s) antérieur(s)</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442-500ml</td><td>Utilisé pour compléter le milieu</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td>Utilisé pour compléter le milieu</td></tr><tr><td>pénicilline streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ml</td><td>Utilisé pour compléter le milieu</td></tr><tr><td>Plaque à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>tissus de laboratoire (kimwipes)</td><td>KIMTECH SCIENCE</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection pour verres de croissance</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>Autoclavé avant utilisation Conserver stérile dans le capot de culture tissulaire</td></tr><tr><td>(méta)arsénite de sodium &ge ; 90 % (SA)</td><td>Sigma</td><td>S7400-100G</td><td>Dissoudre dans l’eau à une concentration de 1 M, puis diluer à 100 & micro ; M en tant que matière première</td></tr><tr><td>Vinorelbine (VRB)</td><td>TSZ CHEM</td><td>RS055</td><td>Dissoudre dans l’eau jusqu’à 10 mM</td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Sigma</td><td>P9620</td><td>Utilisé pour évaluer le niveau de traduction (ribopuromycylation) -Utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active Diluer dans l’eau à 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Dichlorhydrate d’émétine</td><td>Sigma</td><td>E2375</td><td>Utilisé en association avec la puromycine pour évaluer le niveau général de traduction Utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active -Diluer dans l’eau à 10 mg/mL</td></tr><tr><td>Cycloheximide (CHX)</td><td>Sigma</td><td>C4859</td><td>Utilisé pour évaluer la connexion SG avec la traduction active Diluer dans l’eau à 10 mg/mL</td></tr><tr><td>de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Lonza / VWR</td><td>95042-486</td><td>Tampon de lavage pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Réactif de paraformaldéhyde, cristallin (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148-500G</td><td>Préparer une solution à 4 % dans du PBS chaud dans une hotte, remuer jusqu’à ce qu’ils soient dissous Les aliquotes peuvent être stockées à -20 &deg ; C pendant plusieurs mois Dangereux, utiliser la ventilation Jeter dans les déchets spéciaux</td></tr><tr><td>Méthanol, ACS</td><td>BDH / VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Prérefroidir à -20 &deg ; C avant utilisation Jeter dans les déchets spéciaux</td></tr><tr><td>Sérum de cheval normal (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31874</td><td>Diluer à 5 % dans PBS Ajouter de l’azoture de sodium pour le stockage à 4 &deg ; C Solution bloquante pour l’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Éthanol, pur, 200 Proof (100 %),USP, KOPTEC</td><td>Decon Labs / VWR</td><td>89125-188</td><td>Diluer à 70 % avec de l’eau</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>souris anti G3BP1 anticorps (TT-Y)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-81940</td><td>Stocker à 4 &deg ; C 1/100 dilution</td></tr> lapin <tr><td>anti eIF4G anticorps (H-300)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11373</td><td>Stocker à 4 &deg ; C 1/250 dilution</td></tr><tr><td>chèvre anti eIF3&eta ; (N-20)</td> anticorps <td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>eIF3&eta ; est également connu sous le nom de eIF3b Stocker à 4 &deg ; C 1/250 dilution</td></tr><tr><td>souris anti puromycine 12D10 anticorps</td><td>Millipore</td><td>MABE343</td><td>Stocker à 4 &deg ; C 1/1 000 dilution</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>715-225-150</td><td>Reconstituer dans l’eau par fabricant' s puis stocker à 4 &deg ; C dilution 1/250</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-165-152</td><td>Reconstituer dans l’eau selon le fabricant' s puis stocker à 4&deg ; C 1/2 500 dilution</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-175-147</td><td>Reconstituer dans l’eau selon le fabricant' s puis stocker à 4&deg ; C dilution 1/250</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 solution</td><td>Sigma</td><td>94403-1ML</td><td>Incuber avec des anticorps secondaires Solution mère 0,5 mg/mL dans dH20, protéger de la lumière -Conserver à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Cy3 Streptavidin</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>016-160-084</td><td>Reconstituer dans l’eau par fabricant' , puis stocker à 4 &deg ; C dilution 1/250</td></tr><tr><td>oligo-(dT)40x sonde biotinilée</td> Integrated <td>DNA Technologies (IDT)</td><td>/</td><td>Reconstituer dans l’eau à 100 ng/mL, aliquote et stocker à -20 &deg ; C Diluer dans un tampon d’hybridation 1/50 avant utilisation </td></tr><tr><td>Boîte d’hybridation</td> sur mesure<td>/</td><td>/Fabriquer</td> <td>une chambre d’humidité avec n’importe quelle boîte de diapositives de rangement en ajoutant du papier humidifié sur le fond - préchauffer la boîte avant utilisation</td></tr><tr><td>20x tampon SSC</td><td>Thermo fisher Ambion</td><td>AM9763</td><td>Diluer à 2x SSC en utilisant de l’eau libre RNase (traitée au DEPC) Stocker chez RT Tampon de lavage pour FISH</td></tr><tr><td>PerfectHybPlus Tampon d’hybridation</td><td>Sigma</td><td>H7033-50ml</td><td>Tampon d’incubation de bloc et de sonde pour support de montage de diapositives FISH</td></tr><tr><td></td><td>fait maison</td><td>/</td><td>Mélange 5 g de " soluble à froid" poly(alcool vinylique) dans 20 mL de PBS Mélanger par sonication, suivi d’un brassage O/N à RT Ajouter 5 mL de glycérol et 0,2 mL d’azoture de sodium à 20 %, et agiter pendant 16 h à RT Centrifugation à 20 000 g pendant 20 min, jeter les grosses pastilles Aliquote liquide visqueux, Stockage longue durée à -20 &deg ; C, 1 semaine à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Parafilm « M"</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly(alcool vinylique)</td><td>Sigma</td><td>P-8136-250G</td><td>Réactif pour faire du vinol</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma</td><td>G5516-100ML</td><td>Réactif pour faire du vinol</td></tr><tr><td>azoture de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2002-5G</td><td>Agent conservateur pour solution bloquante et vinol Effectuer une dilution de 20 % dans l’eau</td></tr></tbody></table>

méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Les cellules sont souvent confrontées à des changements environnementaux soudains. Les granulés de stress (SG), les complexes de ribonucléoprotéines cytoplasmiques qui se forment dans des cellules exposées aux conditions de stress sont impliqués dans divers aspects du métabolisme et de la survie cellulaire. Les SGs modulent les voies de signalisation cellulaire, l&#39;expression génique post-transcriptionnelle et les programmes de réponse au stress. La formation de ces granules contenant des ARNm est directement liée à la traduction cellulaire. L&#39;assemblage SG est déclenché par l&#39;initiation de la traduction inhibée, et le démontage SG est favorisé par l&#39;activation de la traduction ou par un allongement de la traduction inhibé. Cette relation est encore soulignée par la composition SG. Les composants SG de base sont des complexes de pré-initiation de traduction bloqués, des ARNm et des protéines de liaison à l&#39;ARN sélectionnées (RBP). Le but de l&#39;assemblage de SG est de conserver l&#39;énergie cellulaire en séquestrant des ARNm de ménage de maintien de la traduction, ce qui permet une traduction améliorée des protéines sensibles au stress. En complémentSur les constituants de base, tels que les complexes de préinitiation de traduction bloqués, les SG contiennent une pléthore d&#39;autres protéines et des molécules de signalisation. Les défauts dans la formation de SG peuvent nuire à l&#39;adaptation cellulaire au stress et peuvent donc favoriser la mort cellulaire. Les SG et les granulés contenant de l&#39;ARN similaires ont été liés à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles neurodégénératifs et le cancer, conduisant à l&#39;intérêt récent à classer et à définir les sous-types de granules d&#39;ARN. Ce protocole décrit des analyses pour caractériser et quantifier les SG de mammifères.

Les foyers induits par le stress ne sont pas nécessairement des SG. Les SG sont classés comme des foyers cytoplasmiques qui contiennent des ARNm, des facteurs d&#39;initiation de la traduction et des protéines liées à l&#39;ARN et sont en équilibre avec la traduction active. Le protocole ci-dessus peut être utilisé comme modèle pour caractériser si un stress donné induit des SG de bonne foi . Les SG se localisent avec...

Les granules de stress (SG) sont des structures cytoplasmiques non moulues qui se forment dans des cellules exposées à une variété de contraintes. Les SG contiennent des ARNm, des protéines de liaison à l&#39;ARN, des petites sous-unités ribosomales, des facteurs liés à la traduction et diverses protéines de signalisation cellulaire. Ce protocole décrit un flux de travail qui utilise plusieurs approches expérimentales pour détecter, caractériser et quantifier les SG de bonne foi .

Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

L'objectif général de ce protocole est de déterminer si les foyers identifiés dans le cytoplasme sont de véritables granules de stress, des granules d'ARN qui jouent un rôle important dans la physiologie cellulaire. Le principal avantage de ce protocole est qu'il permet de tester l'ensemble des propriétés fondamentales des granules de stress. Bien que ce protocole soit décrit ici pour des cellules d'ostéosarcome humain U-2 OS, il peut également être appliqué à d'autres types de lignées cellulaires et à des cellules primaires.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car tous les foyers induits par le stress ne sont pas des granules de stress. Notre flux de travail comprend toutes les expérimentations nécessaires pour les distinguer. Je vais démontrer cette procédure avec Anais Aulus.Nous sommes chercheurs postdoctoraux dans le laboratoire de Paul Anderson et Pavel Ivanov. Pour commencer, ensemencez les cellules sur des lamelles placées dans des plaques de 24 puits, comme décrit dans le protocole écrit. Après une incubation nocturne, aspirez le milieu de culture des puits B1 à B4 et de C1 à C4 de la plaque de 24 puits.Ajouter 500 microlitres de milieu supplémenté avec 100 micromolaire d'arsénite de sodium dans les puits B1 et B2, puis ajouter 500 microlitres de milieu supplémenté avec 50 micromolaire d'arsénite de sodium dans les puits B3 et B4. Ensuite, ajouter 500 microlitres de milieu contenant 150 micromolaire de vinorelbine dans les puits C1 et C2. Enfin, ajouter 500 microlitres de milieu supplémenté avec 125 micromolaire de vinorelbine dans les puits C3 et C4. Incuber la plaque pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après 30 minutes d'incubation, ajouter aux cellules de la colonne deux cinq microlitres de solution de cycloheximide à un milligramme par millilitre et aux cellules de la colonne quatre, deux microlitres de puromycine à 1,25 milligramme par millilitre. Agiter doucement la plaque pour mélanger les solutions et replacer la plaque dans l'incubateur pour une incubation supplémentaire de 30 minutes.Pour fixer les cellules, retirez le milieu des puits et lavez les cellules avec environ 250 microlitres de PBS. Ajoutez environ 250 microlitres d'une solution tamponnée de paraformaldéhyde à 4 % pour fixer les cellules, en veillant à ce que la surface du lamelle soit entièrement recouverte. Incubez ensuite la plaque sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant 15 minutes.Ensuite, retirez et éliminez correctement le paraformaldéhyde. Ajoutez environ 250 microlitres de méthanol glacé pour perméabiliser et aplatir les cellules. Incubez la plaque pendant cinq minutes supplémentaires à température ambiante sur un agitateur rotatif.Une fois la perméabilisation terminée, éliminer le méthanol et bloquer les cellules en appliquant environ 250 microlitres de tampon de blocage pendant une heure à température ambiante. Ensuite, préparer la solution d'anticorps primaire en ajoutant 12 microlitres des anticorps dirigés contre G3BP1, eIF4G et eIF3B à trois millilitres de tampon de blocage. Ajouter 250 microlitres de la solution d'anticorps dans chaque puits de la plaque à 24 puits.Incuber la plaque sur un agitateur rotatif pendant au moins une heure à température ambiante. Après une heure d'incubation, retirer la solution d'anticorps et laver les cellules avec environ 250 microlitres de PBS pendant cinq minutes. Ensuite, ajouter 12 microlitres d'anticorps Anti-Souris Cy2, Anti-Lapin Cy3 et Anti-Chèvre Cy5 ainsi que trois microlitres de colorant hooks à trois millilitres de tampon de blocage pour préparer la solution d'anticorps secondaires.Ajoutez 250 microlitres de la solution d'anticorps secondaire dans chaque puits et couvrez la plaque pour protéger les échantillons de la lumière. Incubez la plaque sur un agitateur rotatif à température ambiante pendant une heure. Une fois l'incubation terminée, retirez la solution d'anticorps et lavez les cellules avec du PBS pendant cinq minutes.Chauffer le milieu de montage dans un bloc chauffant à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes afin d'en réduire la viscosité. Ensuite, à l'aide d'une pipette de 200 microlitres à embout prédécoupé, déposer 25 microlitres de milieu de montage sur une lame en verre étiquetée. À l’aide de pinces fines, transférer la lame couvre-objet depuis la cavité vers la lame, en l'inversant de sorte que les cellules soient orientées vers le milieu de montage.Utilisez une pointe P200 propre pour appuyer sur la lame. Une fois que toutes les lames ont été montées, retirez l'excès de milieu de montage en appuyant fermement un mouchoir de laboratoire contre la lame. Ensuite, rincez la lame à l'eau.Et essuyez-le immédiatement avec du papier absorbant de laboratoire une fois de plus. Perméabilisez les cellules préfixées en les incubant avec 250 microlitres de méthanol glacé à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez dans les puits vides de la plaque environ 250 microlitres d'éthanol à 70 % et scellez la plaque à l'aide de parafilm pour éviter l'évaporation.Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant toute la nuit. Après l'incubation nocturne, éliminer l'éthanol et réhydrater les cellules en ajoutant 500 microlitres de 2XSSC. Incuber les lamelles pendant cinq minutes sur un agitateur à température ambiante.Ensuite, jetez la solution et ajoutez à nouveau 500 microlitres de SSC. Incubez la plaque pendant cinq minutes supplémentaires avec une agitation douce. Ensuite, déposez une couche de parafilm sur le fond d'un four d'hybridation et ajoutez 25 microlitres de tampon d'hybridation au-dessus à l'aide d'une pipette.Transférez la lame couvre-objet depuis la plaque 24 puits, en inversant le dessus de sorte que les cellules soient orientées vers le tampon d'hybridation. Incubez les lames couvre-objets à 42 degrés Celsius pendant 15 minutes. Déposez 25 microlitres d'une solution d'oligo dT biotinylé sur le parafilm dans l'étuve d'hybridation.Ensuite, à l’aide de pinces, prendre la lame couvre-objet et essuyer son bord sur un mouchoir de laboratoire afin d’éliminer l’excès de tampon d’hybridation. Transférer la lame couvre-objet dans la solution d’oligo dT biotinylé, en veillant à ce que les cellules soient orientées vers le bas, puis incuber à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Une fois l’hybridation terminée, ajouter environ 500 microlitres de 2XSSC préchauffé dans les puits de la boîte de culture à 24 puits.Ensuite, à l’aide de pinces, transférez la lame couvre-objet dans la cavité et incubez-la à 42 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après avoir coloré davantage les cellules avec la solution d’anticorps, observez les échantillons au microscope à fluorescence. Voici des images de cellules U-2 OS non traitées qui ne contiennent ni granules ni foyers marqués par les marqueurs de granules de stress G3BP1, eIF4G et eIF3B.Dans les cellules U-2 OS traitées avec de l'arsénite de sodium ou de la vinorelbine, la formation de foyers cytoplasmiques contenant G3BP1, eIF4G et eIF3B a été induite. La co-localisation de ces marqueurs a été confirmée par une analyse de balayage linéaire effectuée pour chaque canal à un grossissement accru, suivie d'une superposition des graphiques obtenus. De plus, les foyers cytoplasmiques identifiés dans les cellules traitées contenaient de l'ARNm, comme le montre l'hybridation in situ en fluorescence poly A (FISH).Le signal d'oligo dT co-localise avec le signal de G3BP1, confirmant l'identité des granules de stress. Une fois maîtrisé, ce protocole complet peut être réalisé en trois jours s'il est effectué correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer une immunofluorescence et une hybridation fluorescente.Étapes essentielles pour la caractérisation et l'identification correctes des granules de stress. N'oubliez pas que le travail avec du paraformaldéhyde peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que l'utilisation d'équipements de protection individuelle (EPI) et une ventilation adéquate doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Source : Vonaesch, P. et al., Analyse immunofluorescence de la formation de granules de stress après un défi bactérien sur les cellules de mammifères. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre l’infection des cellules épithéliales par la bactérie pathogène Shigella flexneri et la réponse cellulaire de l’hôte qui en résulte. Les protéines effectrices bactériennes perturbent la traduction de l’hôte, déclenchant la formation d’organites sans membrane appelés granules de stress, qui reflètent la...

Formation des granules de stress lors de l’infection à Shigella des cellules épithéliales cancéreuses

Cette vidéo présente un test de caractérisation et de quantification des granules de stress chez les mammifères, qui sont constitués d’ARNm, de protéines de liaison à l’ARN (RBP) et de diverses autres protéines.

Un test d’immunofluorescence pour caractériser et quantifier les granules de stress chez les mammifères

Ici, nous décrivons une méthode pour analyser l'évolution de l'initiation de la traduction de l'ARNm de cellules eucaryotes en réponse à des conditions de stress. Cette méthode est basée sur la séparation de vitesse sur des gradients de saccharose de la traduction à partir de ribosomes ribosomes non translating.

Analyse de la traduction Initiation Pendant conditions de stress par polysome profilage

granules de stress (SG) sont des granules d'ARN cytoplasmiques contenant des particules bloquées ribonucléoprotéiques (RNP), et important dans la réponse cellulaire à différents stress. Dynamique de SG peuvent être suivies dans les cellules vivantes en visualisant la localisation d'un composant marqué de SG dans des cellules primaires transfectées après le stress.

Visualisation de G3BP stress Granules dynamique dans les cellules primaires en direct

L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

L’amibe sociale Dictyostelium discoideum a récemment été établie comme système pour étudier le mauvais repliement des protéines et la protéostasie. Ici, nous décrivons une nouvelle méthodologie basée sur l’imagerie pour étudier l’agrégation de protéines induite par la température et la réponse au stress cellulaire chez D. discoideum.

L&#39;étude de la protéine système de contrôle de la qualité des<em&gt; D. discoideum</em&gt; Utilisation de cellules vivantes d&#39;imagerie à température contrôlée

Nous décrivons une méthode pour l'analyse qualitative et quantitative de la formation de granules de stress dans des cellules de mammifères après que les cellules sont confrontées à des bactéries et à un certain nombre de contraintes différentes. Ce protocole peut être appliqué pour étudier la réponse des granules de stress cellulaire dans une large gamme d'interactions hôtes-bactéries.

Analyse d&#39;immunofluorescence de la formation de granules de stress après le dépistage bactérien des cellules de mammifères

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et à cultiver des mastocytes péritonéaux murines. Nous décrivons également deux protocoles pour leur caractérisation fonctionnelle : une imagerie fluorescente de concentration2 + Ca libre intracellulaire et un test de dégranulation issu de dosage colorimétrique de la β-hexosaminidase libéré.

Isolement des mastocytes dérivé de péritoine et leur caractérisation fonctionnelle avec Ca2 +-imagerie et des essais de dégranulation

Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.

Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

Ici, nous caractérisons les réponses de stress protéotoxiciques cellulaires dans le nématode C. elegans en mesurant l’activation des reporters transcriptionnels fluorescents et en assayant la sensibilité au stress physiologique.

Mesures des réponses physiologiques au stress à C. Elegans

Ce travail décrit un protocole pour la quantification des modifications globales des histones par cytométrie en flux intranucléaire dans des microglies cérébrales isolées. L’ouvrage contient également le protocole d’isolement de la microglie qui a été utilisé pour la collecte de données.

Quantification des modifications post-traductionnelles des histones globales à l’aide de la cytométrie en flux intranucléaire dans la microglie cérébrale isolée de souris

Découvrez une méthode complète pour identifier et caractériser les granulés de stress dans les cellules U-2 OS humaines en combinant immunofluorescence et hybridation in situ fluorescente.

Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

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