Flash et Gel: Une nouvelle technique pour capturer la membrane dynamique avec la microscopie électronique

L’objectif global de cette procédure est de capturer la dynamique membranaire par microscopie électronique après l’induction de l’activité neuronale à l’aide de l’optogénétique, puis de geler les cellules à des moments définis après la stimulation. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences et en biologie cellulaire sur les mécanismes de recyclage des vésicules synaptiques et peut-être aussi sur la modélisation à une échelle de temps très rapide. Le principal avantage de cette technique est de pouvoir visualiser les changements morphologiques au sein d’une cellule à l’aide de la microscopie électronique à l’échelle de la milliseconde.

La procédure sera démontrée par Shuo Li, un étudiant diplômé et Sumana Raychaudhuri, une associée de recherche. Les deux proviennent de mon laboratoire. Avant de préparer le fixateur, étiquetez deux limes cryogéniques d’un millilitre avec un crayon en fonction de leur numéro d’échantillon.

Combinez ensuite tous les réactifs fixateurs et aliquote un millilitre de volumes de fixateur dans chaque flacon. Après avoir bouché les tubes, immergez immédiatement les fixateurs dans de l’azote liquide et stockez les flacons dans une boîte fermée en polystyrène. Ensuite, remplissez une unité de substitution libre automatisée et un congélateur à haute pression avec de l’azote liquide.

Placez ensuite un petit récipient d’acétone dans la chambre d’échantillon de l’unité de substitution libre et attendez que la température de l’unité de substitution atteigne moins 90 degrés Celsius. Pour programmer le protocole de stimulation lumineuse, cliquez sur Modifier dans la fenêtre de stimulation lumineuse du moniteur à écran tactile. Une autre fenêtre s’ouvrira.

Entrez 15 secondes pour la phase d’obscurité, 100 millisecondes pour la période, 10 millisecondes pour l’impulsion et une pour le nombre de périodes pour un seul stimulus de 10 millisecondes.

Sur l’écran principal, vérifiez que la case de stimulation lumineuse est cochée, puis cliquez sur Stockage des échantillons, puis sur Modifier. Dans la nouvelle fenêtre, utilisez le bouton plus ou moins pour sélectionner deux échantillons afin de stocker deux échantillons dans chaque canal et confirmez que l’option Stockage de l’azote liquide activé est sélectionnée. Maintenant, sous un stéréomicroscope, placez un disque de saphir côté cellule vers le haut dans le puits d’une plaque noire centrale.

Suivi d’un anneau d’espacement de 100 microns. Trempez un côté d’un disque de saphir vierge dans une solution saline préchauffée et placez le disque sur l’anneau d’espacement, côté salin vers le bas. Placez un autre anneau d’espacement de 100 microns.

Et un anneau d’espacement de 400 microns sur le dernier disque de saphir, et utilisez du papier filtre pour éliminer tout excès de liquide. Lorsque vous tenez les échantillons, assurez-vous de ne pas piéger de bulles d’air entre les disques de saphir. Placez ensuite l’ensemble entre les deux demi-cylindres transparents et fermez le couvercle rouge supérieur pour lancer le processus de congélation.

Le couvercle rouge se rallumera automatiquement une fois le processus de congélation terminé. Lorsque tous les échantillons ont été congelés, ouvrez la porte du dewar de stockage et transférez-le sur la paillasse. Transférez la chambre d’échantillonnage du dewar de stockage vers un plateau d’échantillonnage spécialisé rempli d’azote liquide.

Et déverrouillez le bouton pour libérer la tasse de l’échantillon. Ensuite, utilisez une pince à épiler avec des pointes refroidies à l’azote liquide pour retirer les demi-cylindres transparents du gobelet de l’échantillon. Et transférez soigneusement les plaques noires du milieu dans une petite tasse contenant de l’azote liquide.

Veillez à conserver les échantillons congelés sous azote liquide à tout moment et à toujours manipuler les échantillons avec une pince à épiler pré-refroidie. Prérefroidissez à nouveau la pince à épiler et transférez rapidement la première plaque centrale sur l’acétone pré-refroidie. Secouez et tapotant doucement la plaque pour séparer le disque de saphir de la plaque.

Placez ensuite une lime cryogénique ouverte de fixateur dans une chambre d’échantillon dans l’unité de substitution. Transférez le disque de saphir dans le flacon. Et bouchez immédiatement le flacon.

Une fois que tous les échantillons ont été transférés, définissez les paramètres appropriés du programme de substitution libre et démarrez le programme. À la fin du programme de substitution libre, utilisez des gants pour transférer les fichiers cryogéniques de la chambre à échantillon vers une hotte chimique et utilisez une pipette pour ajouter de l’acétone à température ambiante à chaque flacon. Remplacez le nettoyant dans chaque flacon par de l’acétone fraîche quatre à six fois sur une période d’une à deux heures.

Ajoutez ensuite de la résine époxy à 30 % fraîchement préparée dans chaque flacon pour une incubation de deux à trois heures à température ambiante dans un agitateur orbital à 120 tr/min. À la fin de l’incubation, remplacez la résine époxy à 30 % par de la résine époxy à 70 % pour une incubation de trois à quatre heures sur l’agitateur orbital. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, chaque disque, côté cellule vers le haut, sur le capuchon d’une capsule d’enrobage et ajoutez 90 % de résine époxy aux disques pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.

Le lendemain matin, transférez chaque disque de saphir dans le capuchon d’une nouvelle capsule d’enrobage et remplissez le capuchon avec de la résine 100 % époxy fraîchement préparée. Après la dernière incubation de résine époxy à 100 %, polymérisez les échantillons dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures. Lorsque les échantillons ont polymérisé, placez le premier échantillon à l’envers sur le stéréomicroscope de sorte que le disque de saphir soit situé en haut du bloc de résine, et utilisez une lame de rasoir pour retirer une fine couche de résine du haut de l’échantillon.

Ensuite, utilisez la lame de rasoir pour couper une ligne peu profonde le long du bord du disque afin de séparer le disque de saphir de la résine époxy. Et trempez le disque dans de l’azote liquide pendant environ 10 secondes pour séparer le disque du reste de la résine. Transférez la résine sous un microscope à dissection et collez l’échantillon sur la platine du microscope.

À l’aide d’un grossissement de quatre à 10X, trouvez une zone avec des cellules et utilisez une lame de rasoir à double tranchant pour couper une zone de deux millimètres sur deux autour de la région d’intérêt. Ensuite, utilisez de la superglue pour monter les cellules sur un bloc factice cylindrique en résine époxy, et incubez le bloc à 60 degrés Celsius pendant une heure. Après coupe sur un ultra microtome, transférez les échantillons dans un microscope électronique à transmission pour une imagerie à un grossissement de 930 000X.

Sur cette image, la fusion des vésicules synaptiques par exocytose enregistrée 15 millisecondes après l’apparition de la lumière dans la zone active d’une membrane présynaptique dans un neurone de l’hippocampe d’une souris est montrée. 100 millisecondes après l’apparition de la lumière, une fosse endocytotique adjacente à la zone active peut être observée, illustrant une endocytose ultra rapide par la cellule nerveuse. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de traiter des échantillons avec des expériences flash et freeze.

N’oubliez pas que travailler avec du glutaraldéhyde, du tétroxyde d’osmium et de l’azote liquide peut être très dangereux, alors assurez-vous de porter des vêtements de protection. Une fois maîtrisée, la partie congélation de ces procédures peut être effectuée en quelques heures pour 12 échantillons, mais le reste des procédures, y compris l’imagerie et l’analyse d’images, peut prendre jusqu’à des jours, des semaines, voire des mois, et cela peut donc être une procédure très longue. Si vous localisez des protéines, ou visualisez leur dynamique, vous pouvez également utiliser différents protocoles pour préserver l’antigénicité ou la perlescence des protéines nacrées et visualiser leur dynamique à l’aide de ces techniques.