Glycoprotéomique de la matrice: Une extracellulaires Méthode d'analyse Intact glycopeptides En utilisant la spectrométrie de masse

L'objectif général de ce protocole est d'analyser la composition en protéines de la matrice extracellulaire, y compris l'identification des sites de glycosylation et la caractérisation compositionnelle des formes de glycannes dans les tissus cardiovasculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le processus de fibrose tissulaire, telles que la manière dont la glycostylation d'une matrice structurelle influence la fibrose tissulaire au cours des maladies cardiovasculaires. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle permet, contrairement aux protocoles antérieurs qui analysent les modifications globales de glycosylation, de caractériser la glycosylation au niveau de sites spécifiques des protéines de la matrice structurelle, offrant ainsi un outil pour des études mécanistiques ciblées ultérieures.

Les procédures seront démontrées par le Dr Marika Fava et Mme Ferheen Baig de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez tous les tampons d'extraction conformément au protocole décrit dans le texte. Ensuite, utilisez un scalpel pour découper de 20 à 50 milligrammes de tissu en trois ou quatre morceaux plus petits d'environ deux millimètres de taille.

Placer le tissu haché dans un tube de 1,5 millilitre et ajouter 500 microlitres de PBS glacé. Laver le tissu cinq fois en utilisant 500 microlitres de PBS pour chaque lavage afin de minimiser la contamination par le sang. Transférer les échantillons lavés dans un tube de 1,5 millilitre à bouchon vissé et ajouter un volume de tampon de chlorure de sodium équivalent à 10 fois le poids du tissu.

Vortexer à vitesse minimale pendant une heure à température ambiante. Ensuite, transférer l'extrait dans de nouveaux tubes de centrifugation et centrifuger à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Laver brièvement les culots tissulaires obtenus avec un tampon frais de chlorure de sodium.

Après cela, ajouter un volume de tampon SDS équivalent à 10 fois le poids du tissu et vortexer à une vitesse minimale pendant 16 heures à température ambiante. Transférer l'extrait dans de nouveaux tubes de centrifugation et centrifuger à 16 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Laver les culots obtenus avec de l'eau doublement distillée.

Ajouter un volume de tampon chlorhydrate de guanidine équivalant à cinq fois le poids du tissu et vortexer à vitesse maximale pendant 72 heures à température ambiante. Transférer l'extrait obtenu dans de nouveaux tubes et centrifuger à 16 000 ×g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après quantification des protéines, aliquoter 10 microgrammes dans un nouveau tube pour chaque échantillon, destiné à l'évaluation de l'occupation des sites de glycosylation, et 50 microgrammes dans un tube distinct pour l'analyse directe des glycopeptides.

Ajouter 10 fois le volume d'éthanol à chacun et incuber toute la nuit à 20 degrés Celsius. Le lendemain, centrifuger les échantillons à 16 000 ×g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot précipité.

Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher les pastilles pendant 15 minutes à température ambiante. Ajoutez 10 microlitres de tampon de déglycosylation préparé à chaque échantillon. Placez les tubes d'échantillons à l'intérieur d'un tube conique de 50 millilitres et incubez-les à un angle de 45 degrés pendant deux heures à 25 degrés Celsius.

Après cela, augmentez la température à 37 degrés Celsius et incubez pendant 36 heures avec agitation douce. Après centrifugation à 16 000 ×g pendant une minute, utilisez un concentrateur sous vide à température ambiante pendant 45 minutes pour évaporer l'eau. Resuspendez les échantillons séchés avec 10 microlitres d'eau marquée à l'O-18 contenant 50 unités par millilitre de PNGase F. Incubez pendant 36 heures à 37 degrés Celsius sous agitation constante, puis effectuez une digestion en solution par la trypsine pour tous les échantillons et procédez à la purification sur colonne C-18.

Pour commencer, ajoutez 200 microlitres de méthanol dans chaque puits de la plaque à rotation C-18 afin d'activer la résine. Faites centrifuger à 1 000 × g pendant une minute. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d'ACN 80 % contenant 0,1 % de TFA dans l'eau dans chaque puits et centrifugez à 1 000 × g pendant une minute.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres d'une solution contenant 1 % ACN et 0,1 % TFA dans l'eau dans chaque puits, puis centrifugez pendant une minute à 1 000 × g. Répétez l'ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Après cela, chargez les échantillons dans les puits de la plaque à centrifuger et centrifugez à 1 500 × g pendant une minute. Rechargez le filtrat et répétez la centrifugation.

Ensuite, ajouter 200 microlitres d'une solution contenant 1 % ACN et 0,1 % TFA dans de l'eau dans chaque puits, puis centrifuger à 1500 × g pendant une minute. Répéter l'ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Ensuite, ajouter 170 microlitres d'une solution contenant 50 % ACN et 0,1 % TFA dans de l'eau dans chaque puits et centrifuger à 1500 × g pendant une minute.

Répétez cette addition et cette centrifugation une fois de plus. Utilisez un concentrateur sous vide pour sécher l'éluat combiné à température ambiante pendant deux heures. Conservez les échantillons séchés à 80 degrés Celsius jusqu'à leur utilisation.

Après cela, effectuez une analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem sur les échantillons destinés à l'évaluation de l'occupation des sites de glycosylation. Pour les échantillons destinés à l'analyse directe des glycopeptides, commencez par la marquage standard avec TMT zéro, tel que décrit dans le protocole. Pour commencer, ajoutez à chaque échantillon marqué avec TMT zéro (10 µL) 50 µL du tampon de liaison fourni.

Ensuite, aliquoter 50 microlitres de suspension homogène de résine de capture des glycoconjugués dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et centrifuger pendant une minute à 2500 × g. Éliminer le surnageant et ajouter 60 microlitres de l'échantillon et de la solution tampon de liaison aux tubes contenant les pastilles de résine, en utilisant une pipette pour homogénéiser. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes sous agitation à 1200 tr/min. Après une centrifugation de deux minutes à 2 000 × g, transférer le surnageant dans de nouveaux tubes.

Après cela, ajouter 150 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube de résine à l’aide de la pipette pour mélanger et commencer le processus de lavage. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes sous agitation à 1200 tr/min. Après une centrifugation à 2500 × g pendant deux minutes, transférer chaque surnageant dans le tube de stockage de surnageant correspondant pour terminer le lavage.

Répétez ce processus de lavage deux fois supplémentaires. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de tampon d'élution et mélangez à l’aide d’une pipette. Incubez à température ambiante pendant cinq minutes en agitant à 1200 tr/min.

Centrifuger à 2500 ×g pendant deux minutes et transférer chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 75 microlitres de tampon d'élution à l'aide d'une pipette pour homogénéiser, puis répéter l'incubation et la centrifugation des échantillons. Transférer chaque éluat dans le tube correspondant.

Après centrifugation du liquide élué combiné pendant deux minutes à 2500 ×g, transférez chaque surnageant dans un nouveau tube afin d'assurer un retrait complet de la résine. Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher le liquide élué pendant deux heures à température ambiante. Resuspendez les glycopeptides séchés dans 15 µL d'une solution contenant 2 % ACN et 0,5 % TFA dans de l'eau doublement distillée.

Ensuite, réaliser l'analyse par spectrométrie de masse conformément au protocole décrit dans le texte. Dans cette étude, les protéines de la matrice extracellulaire provenant de tissu cardiovasculaire sont préparées pour une analyse en spectrométrie de masse en tandem couplée à une chromatographie liquide afin de caractériser la composition de la matrice extracellulaire ainsi que pour des analyses glycopeptidiques directes et indirectes. La stratégie principale repose sur des incubations séquentielles avec du chlorure de sodium, du SDS et du chlorure de guanidine, suivies d'une analyse glycopeptidique directe ou indirecte.

L'efficacité de l'extraction est surveillée sur des gels d'acrylamide bis-tris à l'aide d'une coloration argent pour la visualisation. Parmi les trois extraits analysés, la majorité des glycoprotéines de la matrice extracellulaire apparaît dans les aliquotes de chlorhydrate de guanidine. Les glycoprotéines de la matrice extracellulaire sont ornées de longues chaînes glucosaminoglycanes répétitives ainsi que d'oligosaccharides N-liés et O-liés courts et variés.

L'efficacité de la déglycosylation est observée grâce à l'ajout d'enzymes qui digèrent les glycanes glycosaminiques ainsi que d'enzymes ciblant les oligosaccharides N-liés et O-liés plus petits. Les glycoprotéines sont ensuite identifiées par la présence d'asparagines déaminées marquées par de l'oxygène 18 au sein des séquons NXT ou NXS. Un spectre de masse tandem HCD représentatif d'un peptide de la décorine portant une asparagine déaminée à la position deux 11 est présenté ici.

La fragmentation HCD ETD est ensuite utilisée pour analyser l'extrait de MEC enrichi en glycoprotéines. Le spectre de masse en tandem ETD permet la caractérisation de la composition des glycanes. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ deux à trois semaines.

Cette glycoprotéomique nous permet d'explorer la physiologie et la pathologie de la fonction de la fibrose, non seulement en fonction des modifications en protéomique, mais aussi selon la composition des sucres impliqués. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des échantillons pour une étude sur la glycosylation des protéines par spectrométrie de masse. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les maladies cardiovasculaires, elle peut également être appliquée à d'autres pathologies associées à la fibrose, telles que les maladies respiratoires ou le cancer.