Glycoprotéomique de la matrice: Une extracellulaires Méthode d'analyse Intact glycopeptides En utilisant la spectrométrie de masse

L’objectif général de ce protocole est d’analyser la composition protéique de la matrice extracellulaire, y compris l’identification des sites de glycosylation et la caractérisation de la composition des formes de glycanes dans les tissus cardiovasculaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le processus de fibrose tissulaire, telles que la façon dont une glycostlation de la matrice structurelle affecte la fibrose tissulaire au cours d’une maladie cardiovasculaire. Le principal avantage de cette technique est que, contrairement aux protocoles précédents qui analysent les changements globaux de glycosylation, elle permet de caractériser la glycosylation à des sites particuliers d’une protéine de matrice structurelle, fournissant un outil pour des études mécanistes de suivi plus ciblées.

La démonstration des procédures sera faite par le Dr Marika Fava et Mme Ferheen Baig de notre laboratoire. Pour commencer cette procédure, préparez tous les tampons d’extraction comme indiqué dans le protocole texte. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper en dés 20 à 50 milligrammes de tissu en trois ou quatre petits morceaux d’environ deux millimètres.

Placez le mouchoir coupé en dés dans un tube de 1,5 millilitre et ajoutez 500 microlitres de PBS glacé. Lavez le mouchoir cinq fois en utilisant 500 microlitres de PBS pour chaque lavage afin de minimiser la contamination sanguine. Transférez les échantillons lavés dans un tube de 1,5 millilitre avec un bouchon à vis et ajoutez un volume de tampon de chlorure de sodium 10 fois le poids du tissu.

Vortex à vitesse minimale pendant une heure à température ambiante. Ensuite, transférez l’extrait dans de nouveaux tubes à centrifuger et centrifugez à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez brièvement les granulés de tissu obtenus avec un tampon de chlorure de sodium frais.

Après cela, ajoutez un volume de tampon SDS 10 fois le poids du tissu et vortex à une vitesse minimale pendant 16 heures à température ambiante. Transférez l’extrait dans de nouveaux tubes à centrifuger et centrifugez à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Lavez les granulés obtenus avec de l’eau distillée doublement.

Ajoutez un volume de tampon de chlorhydrate de guanidine cinq fois le poids du tissu et tourbillonnez à vitesse maximale pendant 72 heures à température ambiante. Transférez l’extrait obtenu dans de nouveaux tubes et centrifugez-le à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir quantifié la protéine, aliquote 10 microgrammes dans un nouveau tube pour chaque échantillon, afin d’évaluer l’occupation du site de glycosylation, et 50 microgrammes dans un tube séparé pour l’analyse directe des glycopeptides.

Ajoutez 10 fois le volume d’éthanol à chacun et incubez toute la nuit à 20 degrés Celsius. Le lendemain, centrifugez les échantillons à 16 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille précipitée.

Ensuite, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher les granulés pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter 10 microlitres de tampon de déglycosylation préparé à chaque échantillon. Emballez les tubes d’échantillon à l’intérieur d’un tube conique de 50 millilitres et incubez à un angle de 45 degrés pendant deux heures à 25 degrés Celsius.

Après cela, augmentez la température à 37 degrés Celsius et incubez pendant 36 heures avec une agitation douce. Après avoir centrifugé à 16 000 fois G pendant une minute, utilisez un concentrateur sous vide à température ambiante pendant 45 minutes pour évaporer l’eau. Remettre en suspension les échantillons séchés avec 10 microlitres d’eau étiquetée O-18 contenant 50 unités par millilitre de PNGase F.Incuber pendant 36 heures à 37 degrés Celsius sous agitation constante, puis effectuer une digestion à la trypsine en solution pour tous les échantillons et procéder au nettoyage au C-18.

Pour commencer, ajoutez 200 microlitres de méthanol dans chaque puits de la plaque de centrifugation C-18 pour activer la résine. Centrifuger à 1 000 fois G pendant une minute. Ajoutez ensuite 200 microlitres d’ACN à 80 % et 0,1 % d’AGZ dans de l’eau dans chaque puits et centrifugez à 1 000 fois G pendant une minute.

Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’une solution contenant 1 % d’ACN et 0,1 % d’AFT dans l’eau dans chaque puits, et centrifugez pendant une minute à 1 000 fois G. Répétez l’ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Après cela, chargez les échantillons dans les puits de la plaque de centrifugation et centrifugez à 1500 fois G pendant une minute. Rechargez le flux et répétez la centrifugation.

Ajoutez ensuite 200 microlitres d’une solution contenant 1 % d’ACN et 0,1 % d’AFT dans l’eau dans chaque puits, et centrifugez à 1500 fois G pendant une minute. Répétez l’ajout de cette solution et la centrifugation deux fois. Ensuite, ajoutez 170 microlitres d’une solution contenant 50 % d’ACN et 0,1 % d’AFT dans de l’eau dans chaque puits et centrifugez à 1500 fois G pendant une minute.

Répétez cette addition et la centrifugation une fois de plus. À l’aide d’un concentrateur sous vide, sécher l’élué combiné à température ambiante pendant deux heures. Conservez les échantillons séchés à 80 degrés Celsius jusqu’au moment de l’utiliser.

Après cela, effectuer une analyse par chromatographie liquide en tandem par spectrométrie de masse sur les échantillons destinés à l’évaluation de l’occupation des glycosites. Pour les échantillons destinés à l’analyse directe des glycopeptides, procédez d’abord à l’étiquetage zéro standard du TMT, comme indiqué dans le protocole texte. Pour commencer, ajoutez à chaque 10 microlitres d’échantillon étiqueté TMT zéro 50 microlitres de tampon de liaison fourni.

Ensuite, aliquote 50 microlitres de suspension de résine de capture de glyco homogène dans de nouveaux tubes de 1,5 millilitre et centrifuger pendant une minute à 2500 fois G.Retirez le surnageant et ajoutez 60 microlitres de l’échantillon et de la solution tampon de liaison dans les tubes contenant les pastilles de résine à l’aide d’une pipette pour mélanger. Incuber à température ambiante pendant 20 minutes en agitant à 1200 tr/min. Après une centrifugation de deux minutes à 2 000 fois G, transférez le surnageant dans de nouveaux tubes.

Après cela, ajoutez 150 microlitres de tampon de lavage dans chaque tube de résine à l’aide de la pipette pour mélanger afin de commencer le processus de lavage. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes tout en agitant à 1200 tr/min. Après une centrifugation à 2500 fois G pendant deux minutes, transférez chaque surnageant dans le tube de stockage correspondant pour terminer le lavage.

Répétez ce processus de lavage deux fois de plus. Ensuite, ajoutez 75 microlitres de tampon d’élution et mélangez avec une pipette. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes en agitant à 1200 tr/min.

Centrifugez à 2500 fois G pendant deux minutes et transférez chaque surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Ajouter 75 microlitres de tampon d’élution à l’aide d’une pipette pour mélanger puis répéter l’incubation et la centrifugation des échantillons. Transférez chaque élu dans le tube correspondant.

Après avoir centrifugé l’élu combiné pendant deux minutes à 2500 fois G, transférez chaque surnageant dans un nouveau tube pour assurer l’élimination complète de la résine. Après cela, utilisez un concentrateur sous vide pour sécher l’élué pendant deux heures à température ambiante. Remettre en suspension les glycopeptides séchés dans 15 microlitres de 2 % d’ACN et de 05 % de TFA dans de l’eau doublement distillée.

Ensuite, effectuez une analyse par spectrométrie de masse comme indiqué dans le protocole texte. Dans cette étude, les protéines ECM des tissus cardiovasculaires sont préparées pour l’analyse par chromatographie liquide, l’analyse par spectrométrie de masse en tandem de la composition ECM ainsi que l’analyse indirecte et directe des glycopeptides. La stratégie de base est basée sur des incubations séquentielles avec du chlorure de sodium, du SDS et du chlorhydrate de guanadine, suivies d’une analyse indirecte ou directe des glycopeptides.

L’efficacité de l’extraction est surveillée sur des gels d’acrylamide bis-tris avec coloration à l’argent pour la visualisation. Sur les trois extraits réalisés, la majorité des glycoprotéines ECM sont observées dans les aliquotes du chlorhydrate de guanadine. Les glycoprotéines ECM sont décorées de grandes chaînes de glycanes glycosamine répétitives ainsi que d’oligosaccharides courts et diversifiés liés à l’azote et à l’O.

L’efficacité de la déglycosylation est observée avec l’ajout d’enzymes qui digèrent les glycanes glycosaminiques et d’enzymes qui ciblent les oligosaccharides plus petits liés à l’azote et à l’O. Les glycoprotéines sont ensuite identifiées par la présence d’aspergines désamidées marquées à l’oxygène 18 au sein de séquons NXT ou NXS. Un spectre de masse en tandem HCD représentatif pour un peptide de décorine avec une asparagine désamidée à la position deux 11 est montré ici.

La fragmentation de l’ETD HCD est ensuite utilisée pour analyser l’extrait ECM enrichi en glycoprotéines. Le spectre de masse en tandem ETD permet de caractériser la composition des glycanes. Une fois maîtrisée, cette technique devrait prendre environ deux à trois semaines.

Cette glycoprotéomique nous permet d’explorer la fonction physiologique et pathologique de la fibrose non seulement sur les modifications de la protéomique mais aussi sur la composition des sucres de la pensée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des échantillons pour une étude sur la glycosylation des protéines par spectrométrie de masse. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu des maladies cardiovasculaires, elle peut également être appliquée à d’autres pathologies de la fibrose volumique telles que les maladies respiratoires ou le cancer.