Name: Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à létude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Apprenez à isoler et cultiver des cellules intestinales murines mixtes pour étudier la sécrétion de peptides intestinaux et l'imagerie de cellules entéroendocrines vivantes. Cette méthode permet l'analyse in vitro de ces cellules régulant l'homéostasie corporelle.

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les dosages immunologiques GLP-1 ont été effectuées par le laboratoire de dosage Biochimiques à l&#39;hôpital Addenbrooke. Ce travail a, au fil des ans, été pris en charge par le Wellcome Trust (actuellement des subventions actives 106262 / Z / 14 / Z et 106263 / Z / 14 / Z) et le Conseil de recherches médicales (MRC) (subventions MRC_MC_UU_12012 / 3 et MRC_MC_UU_12012 / 5).

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvées par l&#39;Université de Cambridge et du bien-être animal du corps examen éthique et conformées aux animaux (procédures scientifiques) de la Loi de 1986 Règlement Amendement (SI 2012/3039). 1. Préparation à l&#39;avance <ol><li> Placer une aliquote de la matrice de la membrane basale (BMM) (~ 200 pi) sur la glace au dégel. NOTE: Le BMM se solidifie à température ambiante (RT). </li><li> Pré-chaud 50 ml Dulbecco stérile à haute glucose Modified Eagle Medium (DMEM) (sans additifs) et ~ 40 ml de milieu de culture stérile (DMEM riche en glucose additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U de pénicilline / ml et 0,1 mg / ml de streptomycine (P / S), et 2 mM de L-glutamine) dans des tubes de centrifugation de 50 ml dans un bain d&#39;eau à 37 o C. </li><li> Pré-refroidissement du calcium et de magnésium contenant de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). </li><li> Peser 15 mg de collagénase (XI brut), ajouter à un tube de centrifugation de 50 ml et le maintenir sur de la glace. <ol><li&gt; ATTENTION: collagénase est nocif. Il provoque une irritation de la peau (H315) et irritation des yeux (H319). Il peut causer des symptômes d&#39;allergie ou d&#39;asthme ou des difficultés respiratoires par inhalation (H334). Il peut provoquer une irritation des voies respiratoires (H335). Utiliser un équipement de protection individuelle approprié, d&#39;éviter la formation de poussière et éviter de respirer les poussières. Assurer une aération suffisante. </li></ol></li></ol> 2. Collection de tissus <ol><li> Ajouter ~ 20 ml de milieu L-15 à un tube de centrifugeuse de 50 ml et placez-le sur la glace. </li><li> Euthanasier une souris par dislocation cervicale, ou toute autre méthode annexe 1 approuvé. REMARQUE: le tissu intestinal est typiquement obtenu à partir de souris sur un fond C57BL6. Cependant, d&#39; autres milieux génétiques ont également été utilisés , par exemple 129 / SvEv 15. Des expériences d&#39;imagerie nécessitent l&#39;utilisation de souris rapporteurs fluorescents par exemple Glu-Venus 1. Le tissu est obtenu à partir de souris adultes (2-6 mois) des deux sexes. Les souris sont logées dans individuacages ventilé lly avec ad libitum accès à l&#39; eau et chow régulière. Cependant, des expériences pour tester l&#39;effet d&#39;un régime alimentaire riche en matières grasses, par exemple, sur la fonction cellulaire entéroendocrine 16 peut être réalisée si elle est soutenue par une licence de projet. </li><li> Disséquer et retirer doucement l&#39;intestin de souris (de pylore et le début du rectum) à l&#39;aide des pinces et des ciseaux de dissection. Conservez-le dans milieu L-15 sur la glace jusqu&#39;à prêt à l&#39;emploi. </li></ol> 3. Préparation des tissus <ol><li> Placer le tissu intestinal dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS suffisant pour couvrir le tissu. Prendre 10 cm de tissu souhaité (par exemple , l&#39; intestin grêle supérieur, haut, 10 cm de pylore distaux). </li><li> Rincer le contenu intestinal à l&#39; aide d&#39; une pipette Pasteur en matière plastique et PBS refroidi. <ol><li> En utilisant des pinces, délicatement préhension d&#39;une extrémité du segment intestinal et placer la pointe d&#39;une pipette Pasteur en elle. Rincez le contenu avec PBS refroidi. Répétez des deux extrémités jusqu&#39;à ce que la majorité du contenu a été débusqué. Transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS propre fraîches, réfrigérées. </li></ol></li><li> En utilisant des pinces, enlever le tissu adipeux et méso, en prenant soin de ne pas retirer la couche musculaire en même temps. </li><li> Peler la couche musculaire off « comme une chaussette » sous un microscope à dissection en utilisant deux jeux de pinces fines. REMARQUE: Cette étape est pas indispensable mais est fortement recommandée. Il existe d&#39;autres façons d&#39;éliminer la couche musculaire à celle décrite ici. Par exemple, l&#39;intestin peut être coupée longitudinalement ouverte en premier, avant l&#39;enlèvement de la couche de muscle. <ol><li> Trouver un point de départ à l&#39;extrémité proximale plus du tissu où il y a un volet visible du muscle. Tirez doucement loin une petite quantité de la couche musculaire tout autour de l&#39;intestin. NOTE: Pour éviter la déchirure de la couche de muscle ou de l&#39;épithélium intestinal, de réduire la force de tension par serrage d&#39;une plus grande surface au lieu d&#39;utiliser le tips des pinces fines. </li><li> Fixer l&#39;intestin et comme une grande partie du lambeau musculaire possible, tirez doucement en dehors et commencer à décoller la couche musculaire autour de l&#39;intestin. Pour éviter de déchirer à la fois la couche musculaire et de l&#39;épithélium, maintenir la position de réajustant la pince pour les garder proches. De cette manière, éliminer la couche musculaire de la totalité de la longueur du segment intestinal et le jeter. </li></ol></li><li> Couper l&#39;intestin ouvert longitudinalement et laver par tourbillonnant dans une boîte de Pétri propre avec du PBS frais, réfrigérés. Répétez si nécessaire pour éliminer toute chyme ou de mucus restant. </li><li> Mince tissu avec une lame de scalpel chirurgical pour réaliser des carrés de 1-2 mm ~ 2 et les ajouter à ~ 20 ml de PBS refroidi dans un tube de centrifugation de 50 ml en utilisant une pipette Pasteur. Pour éviter les morceaux de tissu coller à la pipette, couper la pointe et mouiller la pipette par trituration avec du PBS. </li><li> Secouer doucement le tube pour laver davantage les morceaux de tissu. Laisser le tissu pour régler et verser ou pipette au large de la majorité du PBS et répéter avec du PBS frais jusqu&#39;à ce que le PBS semble claire. </li></ol> 4. Préparation de la plaque à revêtement BBM / Plats et Digestion moyen REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire (avec les étapes d&#39;incubation dans un bain d&#39;eau à 37 ° C). <ol><li> Préparer une solution BMM 2% dans du DMEM frais (sans additions). Tout en travaillant, maintenir la solution sur la glace. Pour une solution à 2%, ajouter 140 uL décongelé BMM à 7 ml de DMEM (suffisamment pour préparer une plaque à 24 puits). <ol><li> Ajouter 250 uL de 2% solution BMM par puits (plaque 24 puits) ou par boîte d&#39;imagerie à fond de verre. </li><li> Incuber les plaques / plats couchés pendant au moins 30 min dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une polymérisation suffisante de la BMM. </li></ol></li><li> Ajouter le DMEM (sans additions) de la collagénase 15 mg préchauffé 50 ml ( à partir étapes 1,2 et 1,4) pour former une solution à 0,3 mg / mL et inverser la dissolution. <ol><li> SurCE complètement dissous, en utilisant une seringue de 20 ml, on filtre la solution de collagénase à travers un filtre stérile de 0,2 um dans un nouveau tube de centrifugation stérile de 50 ml. Étiquette ce que le milieu de la digestion. </li></ol></li></ol> 5. La digestion des tissus <ol><li> Retirer les morceaux de tissu de la PBS en utilisant une pipette sérologique de 10 ml et ajouter à un tube de centrifugation stérile de 50 ml contenant du DMEM stérile frais (sans additions), tourbillon, puis retirer DMEM. REMARQUE: Pour éviter de coller le tissu à la pipette sérologique, humide par trituration avec DMEM avant le contact avec le tissu. </li><li> 1 et 2 « Digest »: Elimination des débris cellulaires et des cellules individuelles <ol><li> Ajouter milieu de digestion 7 ml aux morceaux de tissu et de donner le tube un tourbillon. </li><li> Incuber pendant 5 min dans un bain-marie à 37 ° C. </li><li> Secouer doucement (non tourbillonner) pour le tube ~ 3 s. </li><li> Laisser le tissu à établir et à rejeter le milieu de la digestion, réservant unepetit volume à regarder sous le microscope. REMARQUE: Surtout lors du démarrage, il est fortement recommandé d&#39;inspecter un petit volume de chaque « digérer » (~ 30 pi) sous le microscope pour évaluer les progrès du processus de digestion. Si plusieurs cryptes sont observés à ce stade, l&#39;agitation peut être trop forte. Pour des images représentatives de ce que les différentes étapes « digérer » présentera comme suit , reportez - vous à la figure 1. </li><li> Répétez les étapes 5.2.-5.2.4 (avec un milieu de digestion frais). </li></ol></li><li> &#39; Les résumés de 3 à 5: Collection de fragments cryptiques <ol><li> Ajouter milieu de digestion 7 ml au tissu. </li><li> Incuber pendant 10 min à 37 ° C. <ol><li> Au cours de l&#39;incubation, agiter toutes les 5 min pour 10-12 s. NOTE: L&#39;agitation est plus vigoureuse que l&#39;agitation pendant « » digestions 1 et 2. </li></ol></li><li> Laisser les tissus non digérés de régler et de recueillir le milieu de la digestion dans un tube de centrifugation de 15 ml. Sile tissu est accidentellement recueilli avec le milieu, le laisser décanter, éliminer à l&#39;aide d&#39;une pipette sérologique de 10 ml et le transférer vers le tube de centrifugeuse de 50 ml contenant le tissu non digéré. </li><li> Centrifugeuse moyen / surnageant recueilli à la température ambiante pendant 3 min à 100 x g. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 milieu de culture préchauffée ml par trituration douce et mettre de côté. </li><li> Inspecter un petit volume de la suspension cellulaire au microscope (voir note de l&#39;étape 5.2.4). NOTE: Dans l&#39;idéal, des fragments crypte commencent à apparaître dans « digérer » 3 ainsi que des débris cellulaires et des cellules individuelles. « » Les résumés 4 et 5 contiennent un nombre significativement plus élevé de fragments cryptiques avec les débris cellulaires réduite (Figure 1). Régler secouer l&#39; intensité nécessaire à savoir si le tissu ne digère et des fragments de la crypte n&#39;apparaissent pas, secouez plus vigoureusement. </li><li> Répétez les étapes 5.3.1-5.3.6 jusqu&#39;à 5 « » ont été DIGESTSterminé ou jusqu&#39;à ce que la majorité du tissu a été digéré (un peut être nécessaire digest 6 e). </li><li> Une fois que tous les surnageants de 3-5 &#39;de digestion de (ou 6.3) ont été recueillies, centrifuger le produit de digestion surnageants à température ambiante pendant 3 minutes à 100 x g. </li><li> Pour les expériences de sécrétion, combiner les surnageants de « digestions » 3-5 (ou 3-6) avant la centrifugation. REMARQUE: moins de tissu est nécessaire pour des expériences d&#39;imagerie, donc choisir le surnageant de digestion qui est la plus propre (absence de débris cellulaires et des cellules individuelles) avec le plus grand nombre de fragments de la crypte. Ceci est généralement « digérer » 4 ou 5. </li><li> Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot en triturant jusqu&#39;à ce qu&#39;aucun amas sont visibles. Remettre en suspension le culot dans du milieu de culture préchauffé additionné de 10 uM Y-27632 dichlorhydrate (pour empêcher anoikis 17). Utilisez 5 ml pour les expériences de sécrétion et 2 ml de milieu de culture pour des expériences d&#39;imagerie. </li><li> Filtresuspension de cellules à travers un filtre de 100 um (pour éliminer tout tissu non digéré). Exécuter un supplément de 2 ml de milieu de culture préchauffé à travers le filtre de lavage (volume total: 7 ml et 4 ml pour la sécrétion et l&#39;imagerie, respectivement). NOTE: Le filtrage est pas essentiel, cependant, des fragments de tissus plus grands tendent à ne pas adhérer à la plaque / plats. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig1.jpg" /> Figure 1: Des images représentatives de « digestion » de la méthode de culture primaire petit intestin. (A) un matériau contenant typique de « digestion » 1 et 2 principalement des cellules individuelles et les débris cellulaires. (B) Un exemple de produits de « digérer » 3. Les flèches noires indiquent des fragments cryptiques apparaissant dans le matériau à digérer. (C) de type &#39;digest&#39; 4 ou 5. Panneau (D) représente rassemblées digérer la matière à partir de« digestions » 3-5 passé à travers un filtre de 100 um pour éliminer les fragments de tissus indésirables observés dans les grandes (C). Toutes les images ont été prises à l&#39;aide d&#39;un microscope inversé numérique avec un objectif 20X. Les barres d&#39;échelle = 100 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> 6. Revêtement Cultures intestinales (enrichie pour les cellules des cryptes) <ol><li> Retirer l&#39;excès de solution BMM de la plaque ou de la vaisselle, et ajouter 250 pi de milieu de culture préchauffée par sécrétion bien. REMARQUE: Les plats imagerie sont laissés sans moyen donc passer à l&#39;étape suivante rapidement pour empêcher le plat de sécher. </li><li> Plate suspension de cellules 250 pl par puits (plaque 24 puits) ou par boîte à fond de verre. <ol><li> goutte à goutte plaque dans un mouvement « zig-zag » lent à travers le puits. Permettre aux fragments cryptiques de se déposer pendant environ 5 min avant de déplacer la plaque de thincubateur e. NOTE: Cela devrait encourager une répartition équitable des cryptes / cellules dans le puits. </li></ol></li><li> Incuber la plaque ou de la vaisselle pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Une monocouche « parcellaire » aurait dû faire. Pour une image représentative des cultures suivantes trois lavages, voir la figure 2A. </li><li> plats d&#39;imagerie « inondation » avec 2 ml de milieu de culture préchauffé par boîte. NOTE: Ces plats seront adaptés pour l&#39;imagerie jusqu&#39;à ~ 72 heures après placage. cultures durent généralement plus longtemps colique, jusqu&#39;à 7 jours. Les cellules qui n&#39;ont pas adhéré peuvent être éliminés par une étape de lavage. Les cultures primaires sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

Ce protocole décrit l&#39;isolement et la culture des cellules intestinales petites murins mixtes pour permettre l&#39;étude de la sécrétion de peptide intestinal et l&#39;imagerie cellulaire unique de cellules entéro-endocrines marqués. Pour augmenter la probabilité que les petites cultures intestinales être couronnée de succès, il est important que le protocole est effectué aussi rapidement que possible (idéalement, à moins de 3 h de récolte du tissu) et en ce que le tissu est conservé dans un milieu glacé ou tampon avant au processus de digestion, de limiter la mort cellulaire. Bien qu&#39;il ne soit pas essentiel, en particulier pour les cultures du côlon, l&#39;élimination de la couche musculaire de l&#39;intestin grêle est fortement encouragée. Le petit protocole de culture intestinale a été normalisée, autant que possible. Cependant, il est important de noter qu&#39;aucun processus de digestion est identique. Il y a beaucoup d&#39; étapes au cours de ce protocole où la variabilité peut être introduit au jour le jour , par exemple le degré d&#39;élimination des muscles, la taille de til morceaux de tissu « émincé », la force de la secousse, la puissance d&#39;un lot particulier de collagénase etc. Il est donc d&#39;une importance capitale pour inspecter aliquotes de chacun des différents « digère » au microscope pour évaluer les progrès du processus de digestion et d&#39;adapter la secousse et le nombre de « digests » en conséquence. Il est recommandé de secouer plus doucement pour commencer et, si des fragments de la crypte ne sont pas évidents à partir de « digérer » 3 partir, pour commencer à secouer plus vigoureusement. D&#39;après notre expérience, les cellules endocrines ne prolifèrent pas dans la culture et sont généralement de petites cultures perdues intestinales dans les 4 jours. Néanmoins, cela permet amplement le temps d&#39;effectuer des expériences de sécrétion de peptide intestinal (généralement réalisé plus de 2 h, 18-24 h plaquage post) pour tester des stimuli physiologiques et / ou d&#39;agents pharmacologiques. Des expériences nécessitant une incubation d&#39;une nuit avant l&#39;expérience de sécrétion sont également possibles , par exempledans le cas du pré-traitement par la toxine de pertussis 15. La technique de culture primaire présentée ici est une méthode bien établie, comme en témoigne le volume de la production de la recherche, il a produit au fil des ans. Le modèle de culture primaire a été utilisée pour étudier la sécrétion d&#39;une variété de peptides intestinaux, y compris le GLP-1 1, GIP et 18 PYY 19, en réponse à divers éléments nutritifs et non nutritifs 14, 20 stimuli et des inhibiteurs. En outre, a été appliquée avec succès la même technique à la culture des cellules intestinales humaines 21. Souvent, une combinaison de la première méthode de culture de cellules avec un exemple de modèle expérimental supplémentaire. ex vivo ou in vivo peuvent fournir un aperçu plus 6. En particulier et contrairement à d&#39;autres méthodes, cette technique a imapplications portantes au-delà de la mesure de la libération du peptide intestinal. Nous avons démontré que les cultures de petits intestinales primaires dérivées de souris rapporteurs transgéniques sont de puissants outils pour l&#39;interrogation des voies de signalisation intracellulaire couplé à vider la sécrétion de peptide, en utilisant par exemple le Ca 2+ et des capteurs d&#39;AMPc, GCaMP3 11, 13 et Epac2camps 14, respectivement, ainsi que des techniques électrophysiologiques 12. Comme avec tous les modèles in vitro, les cultures intestinales primaires ont certaines limites inhérentes , notamment la perte de la polarité des cellules épithéliales en culture, ainsi que la perte de l&#39; approvisionnement en sang et innervation. Il est difficile d&#39;estimer les impacts potentiels de ces conditions artificielles sur la fonction cellulaire entéroendocrine. Toutefois, les données obtenues à partir de cultures primaires ont souvent été translaté dans la in vivo setting (par exemple les effets des acides gras à chaîne courte sur la sécrétion de GLP-1 15). Les cultures primaires intestinales sont une technique polyvalente avec de nombreuses applications potentielles. Ils ont déjà fourni d&#39;importants aperçu mécaniste dans la régulation de la sécrétion de peptide intestinal.

L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;isoler les cellules intestinales murins mixtes et de culture pour permettre l&#39;étude de la sécrétion de peptide intestinal et l&#39;imagerie des cellules vivantes des cellules endocrines. Une première version de cette procédure a été publiée en 2008 par Reimann et al. 1 et a depuis constitué la base de 20 autres publications de notre groupe. Pour ce manuscrit, nous avons choisi de mettre l&#39;accent sur les petites cultures intestinales car ils sont plus difficiles à établir que les cultures du côlon. Des cellules entéro - endocrines sécrètent une matrice de peptides intestinaux , y compris le peptide de type glucagon 1 (GLP-1), insulinotrope dépendant du glucose peptide (GIP), la cholécystokinine (CCK) et le peptide YY (PYY) 2. Ces peptides intestinaux ont un rôle physiologique important dans l&#39;organisation des réponses postprandiale telles que le ralentissement du transit intestinal, potentialisation de la libération d&#39;insuline stimulée par le glucose et l&#39;induction de la satiété. GLP-1 a mimétiquesnd médicaments qui inhibent la dégradation sont actuellement homologués pour le traitement du diabète de type 2 et il est en cours d&#39; évaluation du potentiel thérapeutique de stimuler la sécrétion endogène de ce peptide 3. Une meilleure compréhension de la physiologie entéroendocrine et les mécanismes par lesquels la sécrétion est soit stimulée ou inhibée est donc d&#39;une importance capitale. Gut sécrétion de peptide peut être étudiée en utilisant une variété de modèles in vitro et ex vivo expérimentaux, chacun des avantages et des inconvénients (pour une revue récente complète qui couvre également l&#39;utilisation de modèles in vivo voir Svendsen et al. 4). Techniques ex vivo , tels que les intestins perfuses isolés 5 et 6 des chambres de Ussing sont actuellement utilisés pour explorer la sécrétion de peptide de l&#39; intestin en réponse à diverses substances. Le principal avantage de ces méthodes,par rapport à des cultures primaires, est que l&#39;environnement immédiat des cellules entéro-endocrines reste largement intact et, surtout, la polarité des cellules est préservée. Par conséquent, il est possible d&#39;obtenir des informations au sujet de laquelle la surface cellulaire un sécrétagogue agit sur 6. Cependant, ceux-ci sont généralement des techniques à faible débit et la qualité des données qui en découlent repose en grande partie sur l&#39;intégrité et la viabilité du tissu intestinal, qui diminuent inévitablement au fil du temps. Organites sont maintenant de plus en plus Intestinal utilisés comme modèles in vitro pour l&#39;étude de la fonction des cellules entéroendocrine et le développement 7. Organites, qui peuvent être dérivées à la fois de souris et les tissus humains, ont l&#39;avantage de former des structures « cryptiques-like » 3D qui maintiennent la polarité des cellules en culture. Cependant, les cellules endocrines organoïdes dérivées doivent encore être pleinement caractérisés et leur ressemblance avec natif L cells reste largement inconnu. Les cultures primaires ont l&#39;avantage d&#39;être un pas de plus vers la mise physiologique, que les cellules endocrines ne sont pas maintenues et différenciées dans des conditions artificielles pour des périodes de temps prolongées. Procédé de culture primaire de remplacement qui a été utilisée pour l&#39;évaluation de la sécrétion de peptide intestinal est l&#39;isolement des cellules intestinales de rat foetal (8) de FRICS. Cependant, la culture du tissu intestinal adulte a rencontré moins de succès et quelques différences ont été observées dans la réactivité des FRICS contre les cellules intestinales de souris adultes (par exemple de glucose 8). Des lignées de cellules entéro - endocrines de type (par exemple GLUTag, SC-1 et NCI-H716) ont traditionnellement été utilisés pour distinguer directe vs. des effets indirects sur les cellules entéro-endocrines et pour disséquer mécanismes moléculaires sous-jacents stimulus couplage à la sécrétion; voir Kuhre et al </em&gt;. 9 pour la production de peptide et de la sécrétion par les cellules en forme de L &#39;lignées cellulaires immortalisées. Cela a été nécessaire que les cellules endocrines, disséminées le long du tractus gastro - intestinal, constituent un peu moins de 1% des cellules épithéliales intestinales 10 et cellules triées, entre nos mains, ne survivent pas dans la culture 1. Les lignées cellulaires restent des outils utiles en raison du fait qu&#39;ils sont une population cellulaire largement homogène qui est propice à des manipulations génétiques telles que la neutralisation des gènes. Par conséquent, il est facile d&#39;étudier le rôle des protéines qui ne peuvent pas être ciblés sur le plan pharmacologique, lorsque des souris transgéniques ne sont pas disponibles. Cependant, les lignées cellulaires ne sont pas toujours des modèles valides de cellules primaires. Bien qu&#39;il existe de nombreuses similitudes, les résultats des cultures primaires ont parfois mis en évidence des différences dans les voies de signalisation activées par certains nutriments dans les cellules primaires L par rapport aux cellules GLUTag, par exemple (par exemple. Peptones &lt;classe sup = &quot;xref&quot;&gt; 11). Fondamentalement, en combinaison avec des souris transgéniques reporter fluorescentes, le modèle de culture primaire permet un examen détaillé de cellules entéro-endocrines primaires individuels au niveau intracellulaire. Les cellules L par fluorescence marqués au sein de cultures primaires ont été utilisés par notre groupe pour le patch de serrage 1, 12 études et de calcium des cellules individuelles 11, 13 et de l&#39; adénosine cyclique imagerie monophosphate-FRET 14 études, qui ont donné des avancées significatives dans le domaine de entéroendocrine physiologie. Le protocole suivant est optimisée pour réaliser des expériences de sécrétion, en utilisant une plaque à 24 puits ou pour la préparation d&#39;un maximum de 16 plats d&#39;imagerie, à partir d&#39;une section de 10 cm de l&#39;intestin grêle à partir d&#39;une seule souris adulte. Le protocole peut être facilement modifié pour l&#39;étude des cellules du côlon en augmentant les temps de digestion et coconcentration llagenase.

<table><tbody><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3524</td><td>Pour les expériences de sécrétion</td></tr><tr><td>Bombesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4272</td><td>Contrôle positif (expérience d’imagerie calcique)</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 15 mL, stériles</td><td>Greiner bio-one</td><td>188261</td><td>Pour la préparation/digestion des tissus</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger, 50 mL, stériles</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>430828</td><td>Pour la préparation/digestion tissulaire</td></tr><tr><td>Collagénase XI (brute)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td>Pour le maquillage milieu</td></tr><tr><td>de digestion Miroir dichroïque</td><td>Cairn Recherche-Pour</td><td></td> <td>les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>DMEM Glycémie élevée (4500 mg)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6546</td><td>Pour dissoudre matrigel (maintenir à 4 &deg ; C). Pour préparer le milieu de digestion, préchauffer à 37 °C.</td></tr><tr><td>Filtre d’émission (bande passante 510-560 nm)</td><td>Cairn</td> <td>Research-Pour</td> <td>les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Sérum de bovin fœtal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>Pour la préparation du milieu de culture</td></tr><tr><td>Forceps/Pinces à épiler</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT520</td><td>Pour la dissection/l’ablation de l’intestin</td></tr><tr><td>Forskoline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td>Contrôle positif (expérience de sécrétion)</td></tr><tr><td>Boîtes à fond de verre (35 mm)</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td>Pour les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Pince à épiler de haute précision (110 mm)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>3480641 (5 SA)</td><td>Pour l’élimination de la couche musculaire</td></tr><tr><td>Caméra CCD numérique haute résolution</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-ER</td><td>Pour les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>Contrôle positif (expérience de sécrétion)</td></tr><tr><td>L-15 Milieu (Leibovitz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1518</td><td>Pour le prélèvement de tissus, conserver sur glace</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Pour la constitution d’un milieu de culture</td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrice de membrane basale, pour le revêtement de plaques et de plats</td></tr><tr><td>MetaFluor®</td><td>Dispositifs moléculaires (fournis par Cairn Research)</td><td>-</td><td>Logiciel d’imagerie du rapport de fluorescence</td></tr><tr><td>Souris (C57BL6)</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6J</td><td>Souris de fond utilisées pour la reproduction. Peut également être utilisé pour des expériences de sécrétion</td></tr><tr><td>Souris (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3)</td><td>en</td> <td>maison-Pour</td> <td>des expériences d’imagerie et de sécrétion de calcium</td></tr><tr><td>Microscope (EVOS XL Core)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Pour les photomicrographies de cultures</td></tr><tr><td>Microscope&nbsp ;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td>Microscope inversé avec objectif à huile 40X utilisé pour les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Cairn</td> <td>Research-Pour</td> <td>les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Laboratoires Alpha</td><td>LW4234</td><td>Pour le nettoyage des tissus</td></tr><tr><td>PBS contenant du Ca2+ et du Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td>Pour laver les mouchoirs, garder sur la glace</td></tr><tr><td>Pénicilline et Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Pour la préparation de milieux de culture</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td>Pour le nettoyage des tissus et l’ablation de la couche musculaire</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Fisher Scientific</td><td>P/4280/53</td><td>Contrôle positif (expérience d’imagerie calcique)</td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT554</td><td>Pour la dissection/l’ablation de l’intestin</td></tr><tr><td>Passoire à cellules stériles 100 & micro ; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363549</td><td>Pour filtrer la suspension cellulaire de la crypte avant le placage</td></tr><tr><td>Lame de scalpel chirurgical n° 22 (stérile, inoxydable)</td><td>Swann Morton</td><td>0308</td><td>Pour couper en dés les filtres de seringue</td></tr><tr><td>tissulaire, Minisart NML (0,2 & micro ; taille des pores)</td><td>Sartorius</td><td>16534-K</td><td>Pour une solution de collagénase stérilisante par filtre (milieu de digestion)</td></tr><tr><td>Seringues, 20 mL, jetables, stériles, Luer slip</td><td>BD</td><td>300613</td><td>Pour une solution de collagénase stérilisante par filtre (milieu de digestion)</td></tr><tr><td>Lampe à arc au xénon 75W</td><td>Cairn</td> <td>Research-Pour</td> <td>des expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorhydrate</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Inhibiteur de ROCK, préparer une solution mère de 10 mM dans de l’eau stérile (utiliser 1:1 000 dans le milieu de culture final)</td></tr></tbody></table>

cultures primaires mixtes de murine petit intestin destiné à l&#39;étude de la gut hormone sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

L&#39;intestin est le plus grand organe du système endocrinien du corps, avec l&#39;hormone sécrétant des cellules entéro-endocrines situées le long de la longueur de l&#39;épithélium gastro-intestinal. En dépit de leur importance physiologique, les cellules endocrines ne représentent qu&#39;une petite fraction de la population des cellules épithéliales et dans le passé, leur caractérisation a présenté un défi considérable qui entraîne une dépendance à l&#39;égard des modèles de lignées cellulaires. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l&#39;isolement et la culture de cellules intestinales petites souris mixtes. Ces cultures primaires ont été utilisées pour identifier les voies de signalisation qui sous-tendent la stimulation et l&#39;inhibition de la sécrétion de peptide intestinal en réponse à un certain nombre de nutriments et neuropeptides ainsi que des agents pharmacologiques. En outre, en combinaison avec l&#39;utilisation de souris transgéniques reporter fluorescentes, nous avons démontré que ces cultures primaires devenir un outil puissant pour l&#39;examen des cellules entéro-endocrines marqués par fluorescence dans letracellular niveau, en utilisant des procédés tels que le serrage de la pièce et le calcium-cellule unique et d&#39;imagerie cAMP-FRET.

L&#39;utilisation des étapes de digestion série permet la collecte d&#39;une préparation relativement propre des fragments de la crypte à plaquer pour des expériences. Les deux premiers digestions supprimer principalement des cellules individuelles et les débris cellulaires à partir du matériau de digestion (figure 1A). Au cours de la troisième digestion, les fragments cryptiques apparaissent dans la matière digérée (figure 1B). Digère 4 et 5 donnent un plus grand nombre de fragments cryptés avec moins de cellules simples (Figure 1C). Filtrer le matériau mis en commun à partir de digestions 3-5 élimine les gros morceaux de tissu non digéré, ce qui peut nuire à la culture, la production d&#39; une préparation de fragment de cryptage propre (Figure 1D). À la suite de 18 à 24 h de culture, des monocouches de cellules intestinales petites primaires sont observées (figure 2A). En utilisant des cultures provenant des souris transgéniques exprimant spécifiquement le calCapteur fluorescent cium, GCaMP3, sous le contrôle du promoteur du proglucagon 11, les cellules L sont faciles à identifier et entrecoupées dans la culture (figure 2B). Dans des cultures primaires de petits intestinaux, des composés ciblant le G q -Ca 2+ i et i cAMP dépendante voies ont stimulé la sécrétion de GLP-1 (pour la méthodologie de l&#39; essai de sécrétion voir Reimann et al. 1). Bombésine (BBS, 100 nM) et la co-application de forskoline et de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (F / I, 10 uM chacun) ont déclenché un 2 et 11 fois, la stimulation de la libération de GLP-1 par rapport à de base, respectivement (figure 2C). Expression spécifique des cellules L de GCaMP3 permet l&#39;identification et la surveillance en temps réel de la mobilisation du calcium dans les cellules individuelles L. Les deux 100 nM bombésine (BBS) et 30 mM de chlorure de potassium (KCl) ont stimulé des augmentations transitoires de calcium intracellulaire indicatives de la G connue q &lt;/ sub&gt; - et les voies électrogènes couplés dans des cellules primaires de L (Figure 2D). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/55687/55687fig2.jpg" /> Figure 2: Des données représentatives provenant de cultures primaires intestin grêle. Exemple images de petites cultures primaires intestinales mixtes utilisées pour (A) et la sécrétion des expériences d&#39;imagerie (B) Poste de placage 24 h. (A) Image en prise à partir d&#39; une plaque à 24 puits, en utilisant un microscope inversé numérique avec un objectif 4x. Barre d&#39;échelle = 500 um. (B) En utilisant GLU-Cre x souris ROSA26 GCamP3, les cellules L dans le champ de vision (cellules vertes) ont été identifiés par la fluorescence de GCaMP3. La barre d&#39;échelle représente 50 um. (C) la sécrétion de GLP-1 a été mesurée en réponse à la bombésine (BBS, 100 nM) et de la forskoline / 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM de chacun). Pourcentage GLP-1 a été calculé la sécrétionen mesurant les niveaux de GLP-1 dans les surnageants et les lysats cellulaires. Les données représentent les moyennes ± SEM de n = 3 pour chaque condition. (D) la fluorescence de GCaMP3 (reflétant calcium cytosolique) des deux cellules décrites en (B) suivie en temps réel en réponse à du chlorure de potassium (KCl, 30 mM) et BBS (100 nM). l&#39;imagerie de cellules individuelles a été effectuée en utilisant un microscope à fluorescence inversé avec un objectif d&#39;immersion dans l&#39;huile 40X. GCaMP3 a été excité à 475/10 nm, en utilisant une lampe à arc au xénon de 75 W et un monochromateur commandé par un logiciel d&#39;imagerie par fluorescence. Émission a été enregistrée avec une caméra à dispositif (CCD) à couplage de charge numérique à haute résolution à l&#39;aide d&#39;un miroir dichroïque et d&#39;un filtre de bande passante de 510-560 nm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55687/55687fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole décrit l&#39;isolement et la culture de cellules intestinales petites souris mixtes. Ces cultures primaires intestinales permettent l&#39;étude des voies de signalisation sous-jacents sécrétion de peptide de l&#39;intestin en utilisant un certain nombre de techniques.

Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l&#39;étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

L'objectif général de cette méthode est d'isoler et de cultiver des cellules intestinales murines mixtes afin de permettre l'étude de la sécrétion de peptides intestinaux et l'imagerie en temps réel des cellules entéroendocrines. Nous avons initialement développé cette méthode pour permettre la caractérisation in vitro des cellules entéroendocrines. Les cellules entéroendocrines surveillent le contenu intestinal et régulent l'homéostasie corporelle.Mais leur étude s'est révélée difficile car elles sont disséminées dans tout l'épithélium intestinal. Les calcis décrites ici sont particulièrement utiles lorsqu'elles sont combinées à un marquage fluorescent génétique des cellules entéroendocrines, car cela permet d'utiliser des techniques d'électrophysiologie enregistrant au niveau de la cellule unique et d'imagerie en temps réel sur cellules vivantes. La procédure sera démontrée par Cheryl Brighton, post-doctorante dans notre laboratoire.Pour commencer, transférez un duodénum de souris isolé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres remplie de PBS. À l’aide de pinces, saisissez délicatement une extrémité du fragment intestinal et introduisez la pointe d’une pipette de Pasteur dans sa lumière. Rincez ensuite le contenu intestinal avec du PBS refroidi.Répétez pour les deux extrémités intestinales jusqu'à ce que la majeure partie du contenu soit éliminée. Transférez l'intestin rincé dans une boîte de Pétri propre remplie de PBS frais refroidi. Au microscope stéréoscopique, retirez tous les tissus adipeux et le mésentère du fragment intestinal, tout en évitant d'arracher la couche musculaire.Ensuite, identifier un lambeau de la couche musculaire à l'extrémité proximale du tissu. Puis, à l'aide de deux paires de pinces fines, tirer doucement une petite quantité de cette couche tout autour de l'intestin. Saisir l'intestin ainsi que la plus grande partie possible du lambeau musculaire, puis tirer délicatement les couches l'une de l'autre et commencer à détacher la couche musculaire autour de l'intestin.Gardez les pinces rapprochées afin d'éviter de déchirer la couche musculaire et l'épithélium. Retirez la couche musculaire sur toute la longueur du fragment intestinal. Ensuite, ouvrez l'intestin en effectuant une incision longitudinale, puis transférez-le dans une boîte de Pétri propre contenant du PBS frais refroidi.Agiter le tissu pour éliminer tout résidu de chyme ou de mucus. Une fois lavé, découper le tissu à l’aide d’une lame de scalpel chirurgical afin d’obtenir des carrés d’environ un à deux millimètres carrés. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur préalablement humidifiée et munie d’une extrémité préalablement coupée, transférer les fragments obtenus dans un tube de centrifugation de 50 millilitres contenant environ 20 millilitres de PBS refroidi.Agitez doucement le tube pour rincer en outre les fragments de tissu, puis laissez le tissu se déposer. Une fois que le tissu est complètement décanté, aspirez la majeure partie du PBS et rincez l'échantillon avec du PBS frais une fois supplémentaire. Pour digérer l'intestin, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres afin de transférer les fragments de tissu dans un tube de centrifugation stérile de 50 millilitres contenant du DMEM stérile refroidi, agitez doucement la suspension, laissez le tissu se déposer, puis retirez le milieu.Ajoutez 7 millilitres du milieu de digestion aux fragments de tissu et agitez doucement la suspension. Incubez la suspension dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l'incubation, secouez doucement le tube pendant environ trois secondes.Faire sédimenter le tissu non digéré et transférer le milieu de digestion dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Laisser décanter tout tissu éventuellement prélevé par erreur, puis le retransférer à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres dans le tube de centrifugeuse de 15 millilitres contenant le tissu non digéré. Conserver un petit volume du milieu de digestion pour l’observation microscopique et éliminer le reste.Surveiller le contenu du milieu de digestion au microscope optique afin de s'assurer que la suspension ne contient pas de nombreux cryptes. Ensuite, ajouter 7 millilitres de milieu de digestion frais et répéter la procédure de digestion une fois de plus. Pour préparer la suspension de fragments de cryptes, ajouter 7 millilitres de milieu de digestion frais aux fragments d'intestin.Incuber le tissu dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant dix minutes. Agiter l'échantillon plus longtemps et plus vigoureusement cette fois-ci, toutes les cinq minutes. Sédimenter le tissu non digéré et transférer le milieu de digestion dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.Laisser décanter tout tissu éventuellement collecté par erreur, puis, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, le transférer à nouveau dans le tube à centrifuger de 50 millilitres contenant le tissu non digéré. Ajouter 7 millilitres de milieu de digestion frais aux fragments d’intestin et commencer la digestion suivante. Ensuite, centrifuger le milieu récupéré lors de la digestion précédente à 100 x g pendant 3 minutes à température ambiante.Après avoir éliminé le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 5 millilitres de milieu de culture préchauffé, en pipetant doucement. Ensuite, mettre l'échantillon de côté et prélever une petite aliquote de la suspension cellulaire. Au microscope optique, vérifier que l'échantillon contient des fragments de cryptes isolés.Répétez la digestion du tissu 2 à 3 fois supplémentaires ou jusqu’à ce que la majeure partie du tissu soit digérée. Une fois les surnageants de digestion collectés, rassemblez-les tous, puis centrifugez l’échantillon à 100 × g à température ambiante pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez en suspension le culot en pipetant doucement jusqu’à disparition de tout agrégat, dans 5 millilitres de milieu de culture préchauffé supplémenté avec 10 micromolaire de Y-27632, qui empêche l’anoïkis.Enfin, filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre de 100 microns pour éliminer tout tissu non digéré. Rincer le filtre avec 2 millilitres supplémentaires de milieu de culture préchauffé, supplémenté en Y-27632. Avant de semer les cellules, retirer la plaque revêtue de matrice de membrane basale de l'incubateur.Retirer l'excès de solution de matrice de la membrane basale de la plaque et ajouter 250 microlitres de milieu de culture préchauffé, supplémenté en 10 micromolaire de Y-27632, dans chaque puits. Ensemencer 250 microlitres de la suspension cellulaire par puits de la plaque 24 puits, en pipetant goutte à goutte selon un mouvement lent en zigzag. Incuber la plaque toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Les images au microscope des monocouches de cellules primaires de l'intestin grêle, prises 18 à 24 heures après la culture, sont présentées ici. Les cellules primaires de l'intestin grêle cultivées in vitro ont répondu à des stimuli entraînant une augmentation du calcium intracellulaire ou de l'AMP cyclique, conduisant à un doublement de la libération du peptide glucagon-like-1 lorsqu'elles étaient traitées avec de la bombésine, et à une augmentation de onze fois de la sécrétion lorsqu'elles étaient stimulées simultanément avec de la forskoline et de l'IBMX. Enfin, en utilisant des cultures provenant de souris transgéniques exprimant GCAMP 3 sous le contrôle du promoteur du pro-glucagon, il a été démontré que les cellules L primaires de l'intestin grêle réagissent à la stimulation par la bombésine et le chlorure de potassium par une augmentation du calcium cytosolique, comme en témoigne l'intensification de la fluorescence.La procédure décrite est centrée sur la culture de cellules intestinales grêles, une étape que de nombreux laboratoires ont jugée difficile. Nous utilisons également une méthode similaire pour la culture d'autres segments intestinaux, d'origine murine ou humaine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est effectuée correctement.Aucune préparation n’est identique à une autre, il est donc essentiel d’examiner au microscope des aliquotes de chaque digestion. Cela permet d’évaluer l’avancement du processus et d’ajuster en conséquence l’intensité de l’agitation ainsi que le nombre de digestions.

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Cellules entérochromaffines (EC) composent un petit sous-ensemble de cellules épithéliales gastro-intestinale. Cellules EC sont électriquement excitables et libérer la sérotonine, mais des difficultés dans la mise en culture et en identifiant les cellules EC ont limité des études physiologiques. La méthode présentée ici établit un modèle de culture primaire se prêtent à l’examen des cellules individuelles de EC en électrophysiologie.

Électrophysiologie germes entiers de cellules entérochromaffines murins cultivés primaires

Nous présentons ici un modèle puissant et physiologique pour étudier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la sécrétion de l’hormone intestinale et l’absorption intestinale, l’intestin grêle de rat isolé et perfusé.

Mécanismes sous-jacents Gut sécrétion de l’Hormone à l’aide de l’isolé perfusé intestin grêle de Rat

Dans ce protocole, nous décrivons comment générer des monocouches épithéliales primaires murines de deux points directement des cryptes intestinales. Nous fournissons des approches expérimentales pour générer des monocouches confluentes sur des filtres perméables, des monocouches confluentes pour la cicatrisation des plaies à gratter et des études biochimiques, et des monocouches clairsemés et confluentes pour l’analyse d’immunofluorescence.

Génération de monocouches épithéliales primaires murines du côlon à partir de cryptes intestinales

Cet article présente une méthode unique d’analyse des interactions hôte-microbiome à l’aide d’un nouveau système de culture d’organes intestinaux pour des expériences ex vivo.

Un système de culture d’organes intestinaux pour l’analyse des interactions hôte-microbiote

Ce protocole offre des instructions détaillées pour établir des organoïdes murins de l’intestin grêle, isoler les cellules lymphoïdes innées de type 1 de la lamina propria de l’intestin grêle murin et établir des co-cultures en 3 dimensions (3D) entre les deux types de cellules pour étudier les interactions bidirectionnelles entre les cellules épithéliales intestinales et les cellules lymphoïdes innées de type 1.

Co-culture d’organoïdes épithéliaux murins de l’intestin grêle avec des cellules lymphoïdes innées

Nous décrivons un protocole pour isoler les cryptes de l’intestin grêle murin et cultiver des organoïdes intestinaux 3D à partir des cryptes. De plus, nous décrivons une méthode pour générer des organoïdes à partir d’une seule cellule souche intestinale en l’absence d’une niche cellulaire sous-épithéliale.

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Apprenez à isoler et cultiver des cellules intestinales murines mixtes pour étudier la sécrétion de peptides intestinaux et l'imagerie de cellules entéroendocrines vivantes. Cette méthode permet l'analyse in vitro de ces cellules régulant l'homéostasie corporelle.

Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à létude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines (Vidéo) | JoVE Journal

Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l'étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

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