Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l'étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

L’objectif global de cette méthode est d’isoler et de cultiver des cellules intestinales murines mixtes pour permettre l’étude de la sécrétion de peptides intestinaux et l’imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines. À l’origine, nous avons développé cette méthode pour permettre la caractérisation in vitro des cellules entéroendocrines. Les cellules entéroendocrines surveillent le contenu intestinal et régulent l’homéostasie corporelle.

Mais ils ont été difficiles à étudier car ils sont dispersés dans tout l’épithélium intestinal. Les calcis décrits ici sont particulièrement utiles lorsqu’ils sont associés au marquage génétique fluorescent des cellules entéroendocrines, car cela permet l’utilisation de techniques d’imagerie électrophysiologique et d’imagerie de cellules vivantes unicellulaires. La démonstration de la procédure sera assurée par Cheryl Brighton, une post-opératoire de notre laboratoire.

Pour commencer, transférez un duodénum de souris isolé dans une boîte de Pétri de 10 centimètres remplie de PBS. À l’aide d’une pince, saisissez soigneusement une extrémité du fragment intestinal et introduisez la pointe d’une pipette pasteure dans sa lumière. Rincez ensuite le contenu intestinal avec du PBS réfrigéré.

Répétez l’opération pour les deux extrémités intestinales jusqu’à ce que la majorité du contenu soit éliminée. Transférez l’intestin rincé dans une boîte de Pétri propre remplie de PBS frais et réfrigéré. À l’aide d’un microscope à dissection, retirez les tissus adipeux et le mésentaire du fragment intestinal, tout en empêchant la couche musculaire de se détacher.

Ensuite, identifiez un lambeau de la couche musculaire à l’extrémité proximale du tissu. Ensuite, à l’aide de deux paires de préceps fins, retirez doucement une petite quantité de la couche tout autour de l’intestin. Saisissez l’intestin et le lambeau musculaire autant que possible, puis séparez doucement les couches et commencez à décoller la couche musculaire autour de l’intestin.

Gardez les pinces rapprochées pour éviter que la couche musculaire et l’épithélium ne se déchirent. Retirez la couche musculaire sur toute la longueur du fragment intestinal. Ensuite, ouvrez l’intestin en le coupant longitudinalement et transférez-le dans une boîte de Pétri propre contenant du PBS frais et réfrigéré.

Agitez le tissu pour le laver de tout carillon ou mucus restant. Une fois lavé, coupez le tissu avec une lame de scalpel chirurgical pour obtenir des carrés d’environ un à deux millimètres carrés. Ensuite, à l’aide d’une pipette pasteure pré-humidifiée avec une pointe prédécoupée, transférez les fragments obtenus dans un tube à centrifuger de 50 millilitres rempli d’environ 20 millilitres de PBS réfrigéré.

Secouez doucement le tube pour laver davantage les fragments de tissu et laissez les tissus sédimenter. Une fois que le tissu est stabilisé, aspirez la majeure partie du PBS et lavez l’échantillon avec du PBS frais une fois de plus. Pour digérer l’intestin, utilisez une pipette sérologique de 10 millilitres pour transférer les fragments de tissu dans un tube à centrifuger stérile de 50 millilitres, contenant du DMEM stérile réfrigéré, faites tourner la suspension, laissez le tissu se déposer, puis retirez le milieu.

Ajoutez 7 millilitres de milieu de digestion aux fragments de tissu et faites tourner la suspension. Incuber la suspension dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, secouez doucement le tube pendant environ trois secondes.

Sédimentez le tissu non digéré et transférez le milieu de digestion dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Laissez tout tissu collecté accidentellement se déposer et, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, transférez-le dans le tube de centrifugation de 15 millilitres, contenant le tissu non digéré. Conservez un petit volume du milieu de digestion pour l’observation microscopique et jetez les restes.

Surveillez le contenu du milieu de digestion au microscope optique pour vous assurer que la suspension ne contient pas beaucoup de cryptes. Ensuite, ajoutez 7 millilitres de milieu de digestion frais et effectuez la procédure de digestion une fois de plus. Pour préparer la suspension de fragments de crypte, ajoutez 7 millilitres de milieu de digestion frais aux fragments d’intestin.

Incuber le tissu dans une eau à 37 degrés Celsius pendant dix minutes. Secouez l’échantillon plus longtemps et plus vigoureusement cette fois-ci, toutes les cinq minutes. Sédimentez le tissu non digéré et transférez le milieu de digestion dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Laissez tout tissu collecté accidentellement se déposer et, à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres, transférez-le dans le tube à centrifuger de 50 millilitres contenant le tissu non digéré. Ajoutez 7 millilitres de milieu de digestion frais aux fragments d’intestin et commencez la digestion suivante. Ensuite, centrifugez le milieu recueilli de la digestion précédente à 100 x g à température ambiante pendant 3 minutes.

Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans 5 millilitres du milieu de culture préchauffé, par pipetage doux. Ensuite, mettez l’échantillon de côté et prélevez une petite aliquote de la suspension cellulaire. Au microscope optique, confirmez que l’échantillon contient des fragments de crypte isolés.

Répétez la digestion des tissus 2 à 3 fois de plus ou jusqu’à ce que la majorité des tissus aient été digérés. Une fois que les surnageants de digestion ont été recueillis, combinez-les tous et centrifugez l’échantillon à 100x g à température de toom pendant trois minutes. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension en pipetant doucement, jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de grumeaux visibles et 5 millilitres de milieu de culture préchauffé complétés par 10 micromolaires de Y-27632, ce qui empêche l’anoïkis.

Enfin, filtrez la suspension cellulaire à travers un filtre de 100 microns pour éliminer tout tissu non digéré. Lavez le filtre avec 2 millilitres supplémentaires du milieu de culture préchauffé complété par du Y-27632. Avant d’ensemencer les cellules, retirez la plaque recouverte d’une matrice de membrane basale de l’incubateur.

Retirez l’excès de solution matricielle de la membrane basale de la plaque et ajoutez 250 microlitres du milieu de culture préchauffé complété par 10 micromolaires d’Y-27632 dans chaque puits. Grainez 250 microlitres de suspension cellulaire par puits de la plaque de 24 puits, par pipetage goutte à goutte effectué dans un lent mouvement en zigzag. Incuber l’assiette pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Voici les images microscopes des monocouches des cellules primaires de l’intestin grêle prises après 18 à 24 heures de culture. Les cellules primaires de l’intestin grêle qui ont été cultivées in vitro ont répondu à des stimuli qui augmentent le calcium intracellulaire, ou AMP cyclique, entraînant une augmentation de deux fois de la libération de peptide-1 de type glucagon, lorsque les cellules ont été traitées avec de la bombésine et une augmentation de la sécrétion de onze fois lorsqu’elles ont été stimulées simultanément avec de la forskoline et de l’IBMX. Enfin, en utilisant des cultures générées à partir de souris transgéniques exprimant GCAMP 3 sous le contrôle du promoteur pro-glucagon, il a été démontré que les cellules L primaires de l’intestin grêle répondent à la stimulation par la bombésine et le chlorure de potassium avec une augmentation du calcium cytosolique, comme le démontre la fluorescence améliorée.

La procédure démontrée est axée sur les cellules culturelles de l’intestin grêle, ce que de nombreux tours ont trouvé difficile. Nous utilisons également une pratique similaire pour la culture d’autres segments intestinaux, d’origine murine et humaine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures, si elle est correctement exécutée.

Il n’y a pas deux préparations identiques, il est donc important de ne pas oublier d’inspecter les aliquotes de chaque digest au microscope. Cela vous permet d’évaluer les progrès et d’adapter l’intensité de l’agitation et le nombre de digestions en conséquence.