Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array

L’objectif global de cette méthode est l’analyse parallèle à haut débit de communautés microbiennes à plusieurs membres dans des environnements confinés à l’aide de réseaux de micro-puits en silicium. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un criblage parallèle à haut débit d’interactions microbiennes finement localisées qui sont importantes pour l’industrie, la médecine et l’environnement. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de l’écologie biomédicale et microbienne, telles que : comment les contraintes spatiales inhérentes à des échelles fines influencent-elles les paramètres déterministes et stochastiques du développement communautaire et quels sont-ils leurs effets clés sur l’abondance et l’organisation des membres microbiens ?

Commencez par préparer les réseaux de micro-puits. Tout d’abord, découpez des puces individuelles à micro-puits dans des plaquettes de silicium imprimées avec plusieurs matrices à l’aide d’un scribe en diamant. Chaque puce individuelle contient des sous-réseaux de puits d’un diamètre allant de cinq à 100 microns à trois densités d’espacement différentes.

Sur chaque puce, le motif complet des puits est également répété quatre fois. Ensuite, fabriquez une chambre humidifiée à l’aide d’une boîte à pointes de pipette et d’une lingette imbibée de PBS. Appliquez ensuite une gouttelette de 150 microlitres de solution BSA sur chaque puce et incubez les puces dans la boîte pendant une heure à température ambiante.

Pendant ce temps, préparez les bactéries. Faites tourner une culture et mettez-la en suspension dans 500 microlitres de milieu R2A frais avec deux pour cent de glycérol. Mesurez ensuite la densité de culture à 600 nanomètres et ajustez la concentration à une densité optique de 0,02.

Après l’incubation des puces, retirez la solution BSA et rincez les puces trois fois avec du PBS. Après les rinçages, séchez les copeaux avec de l’azote gazeux et renvoyez-les dans la chambre humidifiée. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de suspension de culture à chaque puce sèche et incubez les puces pendant une heure à quatre degrés Celsius afin que les bactéries aient le temps d’adhérer aux puits, mais que la division cellulaire de tout contaminant possible soit lente.

Pour préparer une puce pour l’imagerie, faites d’abord une lamelle recouverte d’agarose pour chaque puce. Liquéfier un petit volume d’agarose, environ cinq millilitres sont nécessaires pour chaque lamelle. Ensuite, lavez un côté d’une lamelle avec de l’éthanol et centrez-le sur une lame de verre avec le côté lavé vers le haut.

Positionnez ensuite deux entretoises PDMS d’un millimètre d’épaisseur le long des bords longs de la lamelle et décalez la lamelle de manière à ce qu’un millimètre pende de la glissière. Maintenant, versez suffisamment d’agarose sur la lamelle pour la recouvrir complètement. Ensuite, utilisez une deuxième lame de verre pour aplatir l’agarose en une épaisseur uniforme.

Préparez plusieurs ensembles de lames de ce type en parallèle. Lorsque l’agarose commence à se solidifier, transférez les assemblages à quatre degrés Celsius. Après 15 minutes de refroidissement, coupez l’excès d’agarose autour des lamelles.

Ensuite, mettez les assemblages dans des boîtes de Pétri et conservez-les à quatre degrés Celsius. Une fois que les copeaux ont incubé avec les bactéries, trempez-les dans de l’eau ultra pure une à la fois pendant 10 secondes chacune. Placez ensuite les copeaux humides sur leurs bords sur un mouchoir en papier jusqu’à ce que la majeure partie du liquide se soit écoulée.

Maintenant, retirez les bactéries qui ne se sont pas déposées dans les puits. Coupez un morceau de ruban adhésif de la longueur de la puce de silicium et collez-le à la couche de parylène sur le silicium. Ensuite, décollez le ruban adhésif pour enlever la couche de parylène et préparez-vous immédiatement à inverser la puce.

Maintenant, placez la puce sur un ensemble de lames de sorte que les micro-puits soient en contact avec l’agarose. Faites très attention à ne pas déplacer ou déplacer la puce une fois en contact avec l’agarose. Maintenant, transférez l’ensemble complet dans le support de diapositive d’une chambre de contrôle environnemental sur scène et acquérez des images en accéléré au cours des prochaines 24 heures à l’intervalle souhaité et sous un grossissement de 10x.

Traitez les piles d’images à l’aide d’un logiciel conventionnel disponible gratuitement. Tout d’abord, importez la séquence d’images. Pour calculer la moyenne, chargez les images de correction ou les images en fond noir.

Effectuez ensuite une soustraction d’arrière-plan. Indiquez une valeur de rayon telle que 135 pixels et sélectionnez paraboloïde coulissant. Ensuite, supprimez l’image moyenne du champ sombre de l’image du champ d’éclairage moyen en sélectionnant les deux images et en utilisant l’opération de soustraction.

Maintenant, appliquez une correction d’éclairage comme suit. Réglez l’opération sur diviser, définissez i1 sur l’image du puits, définissez i2 sur l’image de correction, définissez k1 sur la moyenne de l’image de correction et mettez k2 sur zéro. Cliquez ensuite sur Créer une nouvelle fenêtre.

Pour quantifier la croissance bactérienne dans les micro-puits, sélectionnez d’abord les régions d’intérêt à l’aide de la puce à micro-réseau. Dans le menu de la carte, cliquez sur réinitialiser la grille et spécifiez les lignes, les colonnes et les diamètres des puits. Ensuite, dans le menu de forme ROI, sélectionnez cercle.

Pour ajuster le tableau de ROI à l’image, vous pouvez le déplacer en appuyant sur la touche ALT ou ALT+MAJ et en sélectionnant le ROI en haut à gauche avec la souris. Pour redimensionner les zones d’intérêt, appuyez sur la touche Maj tout en sélectionnant en bas à droite du tableau des ROI. Pour ajuster l’espacement entre les zones d’intérêt, appuyez sur la touche Maj tout en faisant glisser le haut ou le bas du tableau.

Une fois que le tableau de retour d’intérêt s’ajuste sur les puits de l’image, cliquez sur Mesurer RT. Ensuite, un tableau avec toutes les mesures pour chaque image ou point temporel sera généré et pourra être copié dans une feuille de calcul pour analyse. La croissance de deux souches de Pseudomonas aeruginosa a été comparée. Une souche exprime constitutivement des protéines effectrices toxiques associées aux sécrétions de type six.

L’autre est sensible à la pathogenèse de type six en raison de la perte de fonction. Les deux expriment une protéine fluorescente différente. Les co-cultures ont été étudiées longitudinalement et dans différentes tailles de puits.

Les bactéries ont été cultivées individuellement et en co-culture. 20 heures de croissance ont été imagées à des intervalles de 30 minutes. Après que des corrections logicielles aient été effectuées sur les données d’imagerie, des trajectoires de croissance quantitatives ont été tracées.

Dans la co-culture, les données ne suggèrent pas trop de changement dans la croissance. Pour faire avancer l’analyse, chaque trajectoire a été ajustée à une fonction logistique modifiée avec trois paramètres, le signal maximum, la vitesse maximale et le temps de latence. Cette analyse suggère que la coculture de ces espèces a eu un effet négligeable sur leur croissance globale et que leur variabilité observée dans les courbes de croissance est très probablement due à des facteurs environnementaux.

Une fois maîtrisé, le set up peut être exécuté en quelques heures seulement s’il est effectué correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’avoir des cellules à croissance robuste pour ajuster correctement les valeurs finales de diamètre extérieur des cellules afin d’avoir des couches de tarière uniformes dans les assemblages de puces et d’être attentif pendant l’étape de décollement du parylène. À la suite de cette procédure, des questions telles que la façon dont l’expression des gènes au sein de chaque communauté change en fonction de la composition et de l’organisation de la communauté, peuvent être abordées par l’analyse du matériel génétique.

N’oubliez pas que travailler avec Pseudomonas aeruginosa peut être potentiellement dangereux, et que des précautions telles que des gants, une veste, des lunettes de protection et des techniques d’asepsie appropriées doivent toujours être utilisées lors de l’exécution de cette procédure.