Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l'ingénierie tissulaire

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux murin pour la génération d’unités de vascularisation pour l’ingénierie tissulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’ingénierie tissulaire sur la vascularisation in vivo des substituts tissulaires. L’un des avantages de cette technique est qu’elle permet d’obtenir des segments microvasculaires entièrement fonctionnels sans traitement in vitro complexe qui peuvent être ensemencés sur des échafaudages et implantés dans des défauts tissulaires.

Cette méthode peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que les tests d’angiogenèse in vitro pour démêler les mécanismes moléculaires sous-jacents à la formation et au remodelage des réseaux microvasculaires. Commencez par placer une souris mâle anesthésiée de type sauvage C57 Black Six en position couchée sous un stéréomicroscope chirurgical et confirmez une absence de réponse au pincement des orteils. Immobilisez les pattes avec du ruban adhésif et désinfectez l’abdomen.

Ensuite, utilisez des ciseaux de dissection pour séparer la couche abdominale du tissu musculaire sous-jacent et faites une laparotomie médiane. Dépliez latéralement les lambeaux de la paroi abdominale et identifiez bilatéralement les testicules, l’épididyme et les coussinets adipeux de l’épididyme. Ensuite, utilisez de petits ciseaux de préparation et des pinces fines pour récolter les coussinets adipeux, en prenant soin de ne pas prélever de tissu épididymaire et placez les coussinets adipeux dans une boîte de Pétri contenant 15 ml de DMEM à 37 degrés Celsius.

Dans une hotte à flux laminaire, lavez les coussinets de graisse dans trois boîtes de Pétri séparées contenant 15 ml de PBS et placez la graisse lavée dans un tube vide en polypropylène de 14 ml. À l’aide d’une balance à tube, déterminez le volume de graisse récoltée. Ensuite, utilisez des ciseaux fins pour hacher mécaniquement le tissu adipeux.

Lorsqu’une suspension tissulaire homogène est obtenue, à l’aide d’une pipette doseuse de 10 ml, transvaser le tissu haché avec deux volumes de collaginase NB 4G dans un erlenmeyer de 50 ml contenant une barre d’agitation de 25 millimètres. Placez le ballon dans un incubateur de culture cellulaire pendant 10 minutes en remuant vigoureusement. Ensuite, observez 10 mcL de tissu digéré au microscope.

L’étape la plus difficile de cette procédure d’isolement est d’identifier le moment approprié pour arrêter la digestion. Une digestion trop longue des coussinets adipeux donnera une suspension unicellulaire sans aucun fragment microvasculaire. Si le digestat contient des fragments microvasculaires libres dérivés du tissu adipeux à côté de cellules individuelles, neutralisez l’enzyme avec deux volumes de PBS complétés par 20 % de FCS et transférez la suspension des vaisseaux cellulaires dans de nouveaux tubes en polypropylène.

Incuber la solution pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour séparer les fragments microvasculaires de la graisse restante par gravité. Ensuite, utilisez une pipette de précision d’un mL pour prélever soigneusement un mL du surnageant de graisse principal, puis utilisez une pipette de précision de 100 mcL pour retirer le reste du surnageant jusqu’à ce que la suspension semble être exempte de gras. Lorsque toute la graisse a été éliminée, à l’aide d’une pipette doseuse de 10 ml, filtrer la suspension des vaisseaux cellulaires à travers une passoire de 50 microns sur un tube conique de 50 mL et transférer la suspension filtrée dans un nouveau tube de polypropylène de 14 mL pour chaque isolat de fragment microvasculaire

Prélever les pastilles de fragments microvasculaires par centrifugation et retirer tout le dernier ml de surnageant de chaque tube, sauf le dernier. Remettez les granulés en suspension dans les surnageants restants. Ensuite, transférez chaque suspension dans des tubes de microcentrifugation coniques individuels de 1,5 mL et granulez à nouveau les fragments microvasculaires pour les remettre en suspension dans le volume final approprié de PBS et à 20 % de FCS pour l’analyse en aval prévue.

Ici, la distribution de la longueur de fragments microvasculaires fraîchement isolés de six souris noires de type sauvage C57 âgées de sept à douze mois est montrée, avec une longueur moyenne d’environ 42 micromètres observée. Comme le démontre ce frottis représentatif de la suspension des vaisseaux cellulaires, des fragments microvasculaires de grande, moyenne et petite taille ainsi que des cellules uniques sont observés lorsque le tissu adipeux a été suffisamment digéré. Un grossissement plus élevé révèle que les fragments microvasculaires présentent une morphologie de microvaisseaux matures avec des segments de microvaisseaux hiérarchiques.

La caractérisation des fragments microvasculaires par cytométrie en flux indique qu’ils contiennent des cellules endothéliales CD31 positives, des cellules paravasculaires alpha à action musculaire lisse positive et des cellules souches mésenchymateuses CD117 positives, cellules exprimant des marqueurs. Après l’ensemencement sur un substitut cutané, des fragments microvasculaires plus gros sont principalement localisés à la surface de l’implant, certains segments de vaisseaux capillaires étant détectés dans les noyaux de l’implant. La coloration immunohystochimique des fragments microvasculaires ensemencés révèle en outre des configurations microvasculaires physiologiques avec des fragments de type artériolaire, veinulaire et capillaire.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en deux heures si elle est exécutée correctement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux murin en tant qu’unités de vascularisation pour l’ingénierie tissulaire.