Name: Tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Apprenez à préparer des tranches ventriculaires viables chez la souris pour des enregistrements électrophysiologiques. Cette technique permet d'étudier l'intégration électrique des cardiomyocytes transplantés et les effets de médicaments cardiaques.

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Nous reconnaissons le soutien fourni par les ateliers et l&#39;établissement animal de l&#39;Institut de neurophysiologie. Ce travail a été soutenu par Walter und Marga Boll-Stiftung, Köln Fortune et Deutsche Stiftung für Herzforschung.

La manipulation des animaux doit être conforme aux directives du comité local du bien-être animal et à la Directive 2010/63 / UE du Parlement européen. 1. Préparer des solutions <ol><li> Préparer la solution de Tyrode sans Ca 2+ (composition en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Ajuster le pH à 7,4 Avec NaOH à 4 ° C. </li><li> Préparer la solution de Tyrode avec Ca 2+ (composition en mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl 2 1, glucose 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0,9. Ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH à 4 ° C. </li><li> Préparer 4% d&#39;agarose à faible teneur en fusion: Mettre 0,6 g d&#39;agarose à bas point de fusion dans 15 ml de solution de Tyrode sans Ca 2+ . Chauffer le mélange dans un four à micro-ondes deux fois à 750 W pendant 10-15 s jusqu&#39;à dissolution de l&#39;agarose. Maintenir la solution à une température constante de 37 ° C &amp;# 176; C et remuer en continu. </li><li> Gardez le milieu d&#39;Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) sans sérum à 37 ° C avec du carbogène (5% de CO 2 , 95% d&#39;O 2 ). </li></ol> 2. Préparez le Microtome <ol><li> Allumez le microtome. </li><li> Remplissez la chambre externe du microtome avec de la glace. </li><li> Remplissez la chambre de microtome interne avec une solution de Tyrode glacée sans Ca 2+ et oxygènez en continu la solution avec 100% de O 2 . </li><li> Placez une lame d&#39;acier dans le porte-lame du microtome. </li></ol> 3. Isolation cardiaque de la souris <ol><li> Injecter par voie sous-cutanée 2,500 U d&#39;héparine. Attendre 15 min. </li><li> Sacrifiez l&#39;animal par dislocation cervicale. </li><li> Ouvrez la poitrine par sternotomie. </li><li> Disique soigneusement le péricarde à l&#39;aide de petits ciseaux et une pince # 5. </li><li> Insérer une canule dans l&#39;aorte ascendante et perfuser les artères coronaires sur place avec des Tyrode glacésSolution sans Ca 2+ jusqu&#39;à ce que le sang restant soit enlevé. </li><li> Ressusciter doucement le cœur avec une pince et des ciseaux et transférer le cœur dans la solution glacée de Tyrode roulée sans Ca 2+ . </li><li> Séparez les oreillettes des ventricules avec un scalpel ou des ciseaux. </li></ol> 4. Incorporation des ventricules dans 4% d&#39;agarose à bas point de fusion <ol><li> Placez les ventricules avec le sommet vers le haut dans le moule d&#39;agarose ( Figure 1 ). Placez la broche au milieu du moule dans la chambre ventriculaire gauche. </li><li> Remplir le moule avec 4% d&#39;agarose à faible teneur en fusion à 37 ° C, jusqu&#39;à ce que le cœur soit complètement recouvert. </li><li> Placez le moule sur de la glace pour un durcissement plus rapide de l&#39;agarose empêchant le flottement du tissu. </li><li> Retirez le bloc d&#39;agarose contenant les ventricules du moule avec un scalpel. </li><li> Tournez le bloc à l&#39;envers et remplissez les chambres ventriculaires et l&#39;espace à l&#39;arrière du bloc d&#39;agarose, que j&#39;aiS laissé par la broche de la mue, avec 4% d&#39;agarose à bas point de fusion en utilisant une seringue avec une aiguille de 20 G. </li><li> Couper le bloc d&#39;agarose avec un scalpel pour obtenir un fond plat du bloc et la position verticale de l&#39;apex cardiaque. </li></ol> 5. Tranchage du tissu ventriculaire <ol><li> Fixez le bloc sur le porte-échantillon du microtome avec une goutte de colle de cyanoacrylate. Faites face au sommet cardiaque vers le haut. </li><li> Placez le porte-échantillon dans la chambre d&#39;échantillon interne du microtome, qui est rempli de Tyrode glacé sans Ca 2+ . Recouvrir complètement le bloc d&#39;agarose avec la solution de Tyrode. </li><li> Préparez des tranches d&#39;axe court à une épaisseur de 150 à 400 μm, en fonction de l&#39;application supplémentaire (pour les enregistrements d&#39;électrode nette 150-200 μm), maintenez la fréquence de vibration de la lame à 60-70 Hz et déplacez la lame vers l&#39;avant aussi lentement que possible . </li><li> Utilisez une brosse fine pour retirer soigneusement l&#39;agarose restant des tranches. </li><li> Transfère doucementR avec une pipette Pasteur dans la solution de Tyrode avec 0,2 mM de Ca 2+ aéré ​​avec 100% de O 2 et les stocker pendant au moins 30 minutes sur de la glace pour récupérer à partir du processus de tranchage. </li><li> Ensuite, maintenez les tranches pendant 30 minutes dans le DMEM à 37 ° C, aérées avec du carbogène, pour laver le BDM avant de l&#39;utiliser. </li></ol> 6. Préparation de l&#39;installation de l&#39;électrode Sharp <ol><li> Pour préchauffer, allumez tous les appareils électriques 30 min avant le début des enregistrements. </li><li> Mettez un plat de culture cellulaire de 3 cm sur la plaque chauffante placée sur le microscope inversé. </li><li> Placez l&#39;électrode en anneau sur mesure ( Figure 2 ) dans le plat et connectez les fils de mise à la terre du préamplificateur et de l&#39;électrode de stimulation. </li><li> Raccorder les tubes flexibles du système de perfusion au plat. </li><li> Remplir le réservoir du système de perfusion avec DMEM, aéré avec du carbogène. </li><li> Allume la pompe à perfusion et réglez la perfusionTe à 2-3 mL / min. </li><li> Réglez la température du DMEM dans le plat à 37 ° C en régulant le chauffe-circuit et la plaque chauffante. </li></ol> 7. Enregistrements potentiels d&#39;action <ol><li> Placez une tranche ventriculaire dans le plat rempli de DMEM. </li><li> Vérifier l&#39;intégrité structurale et la viabilité (basée sur la fonction contractile) du tissu avec le microscope inversé. </li><li> Remplissez une électrode en verre d&#39;enregistrement avec KCL 3 M. </li><li> Remplir une électrode de stimulation avec DMEM. </li><li> Placez l&#39;électrode d&#39;enregistrement et l&#39;électrode de stimulation sur les supports d&#39;électrode. </li><li> Placez soigneusement l&#39;électrode de stimulation sur la tranche et allumez le stimulateur électrique. Commencez avec une fréquence de stimulation de 1-2 Hz. </li><li> Déplacez l&#39;électrode d&#39;enregistrement avec le micromanipulateur sur la position d&#39;enregistrement prévue. </li><li> Abaissez lentement l&#39;électrode d&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce que la pointe touche le tissu. </li><li> Appliquer une courte impulsion électrique rectangulaire à travers leEnregistrement de l&#39;électrode pour pénétrer dans la membrane cellulaire. </li><li> Réinitialisez soigneusement l&#39;électrode d&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce qu&#39;un signal stable soit assuré. </li><li> Commencez l&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action. </li></ol>

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<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à déclarer.

Les tranches ventriculaires permettent des études électrophysiologiques, pharmacologiques et mécaniques avec une structure tissulaire in vivo préservée et un accès direct de la technologie de mesure à toutes les régions du cœur. Les propriétés potentielles d&#39;action physiologique ont été démontrées dans les tranches embryonnaires, néonatales et adultes 9 , 10 , 11 . La vitalité des tranches, à l&#39;exception des co...

Des tranches de tissus minces ont été utilisées fréquemment dans la science fondamentale puisque Yamamot et Mcllwain ont montré en 1966 que l&#39;activité électrique des tranches de cerveau est maintenue in vitro 1 . Depuis lors, des études électrophysiologiques et pharmacologiques ont été effectuées sur tranches de cerveau 2 , foie 3 , poumon 4 et tissu myocardique 5 , 6 , 7 . Les premiers enregistrements de pince-patch dans les tranches ventriculaires à partir de coeurs de rat néonataux ont été décrits en 1990 8 , mais cette technique est tombée dans l&#39;oubli pendant un certain temps. Plus d&#39;une décennie plus tard, notre groupe a mis au point une nouvelle méthode pour préparer des morceaux de coeur 11 embryonnaires murins, néonatals 10 et adultes. Ces tranches de tissus viables peuvent être utilisées pour des expériences aiguës (tranche pour adultesS peut être cultivé pendant plusieurs heures) ou des expériences culturelles à court terme (les tranches embryonnaires et néonatales peuvent être cultivées pendant quelques jours). Les tranches montrent in vivo, comme les caractéristiques électrophysiologiques et une propagation d&#39;excitation homogène, comme l&#39;ont évalué par un fort potentiel d&#39;action des électrodes et des enregistrements de micro-électrodes 11 . En raison de leur morphologie «bidimensionnelle», ils permettent l&#39;accès direct des électrodes d&#39;enregistrement à toutes les régions du ventricule, ce qui en fait un outil intéressant pour les recherches électrophysiologiques et soulève de nouvelles options expérimentales par rapport aux coeurs entiers perfusés de Langendorff. La réponse médicamenteuse des tranches aux bloqueurs des canaux ioniques comme le verapamil (bloqueur de canal Ca 2+ ), le lidocain (bloqueur de canal Na + ), la 4-aminopyridine (inhibiteur de canal K + non sélectif dépendant de la tension) et la linopirdine (KCNQ K + -channel blocker) 9 , 11 </suP&gt; correspond à des effets connus sur les cardiomyocytes dissociés. Les mesures de force isométrique ont révélé une relation de force fréquente positive et ont fortement suggéré une fonction contractile intacte 10 . Ces résultats ont démontré que les tranches ventriculaires murines conviennent comme un modèle tissulaire in vitro pour des études physiologiques et pharmacologiques. En outre, les tranches ventriculaires de coeurs récepteurs en combinaison avec des enregistrements d&#39;électrodes pointues se sont révélées être un outil très utile pour caractériser l&#39;intégration électrique et mécanique ainsi que la maturation des 12 cardiomyocytes dérivés de cellules 12 , 13 et 14 transplantés. En résumé, les tranches ventriculaires sont un modèle de tissu multicellulaire précieux et bien établi et devraient être considérées comme complémentaires de cardiomyocytes dissociés et de coeurs perfusés de LangendorffDans la recherche cardiovasculaire, avec l&#39;avantage majeur de fournir une structure tissulaire in vivo (contrairement aux cellules dissociées) ainsi que l&#39;accès direct aux technologies de mesure, comme les enregistrements d&#39;électrodes nettes à toutes les régions du cœur (contrairement aux préparations de coeur entier).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne</td><td></td><td>Microtome avec lame vibrante.</td></tr><tr><td>Lames en acier inoxydable</td><td>Campden Instruments, Loughborough, Angleterre</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes Pasteur</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau fin, par exemple taille 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Table</td><td></td><td></td> de préparation <td>Mue</td></tr><tr><td>pour l’enrobage des ventricules dans agarose</td><td></td><td></td><td>fait maison</td></tr><tr><td>1 mL Seringue</td><td>Becton, Dickinson ; Franklin Lakes, États-Unis</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4'' Aiguilles</td><td>Braun, Melsungen, Allemagne</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2'' Aiguilles</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petite ciseau</td><td>WPI, Sarasota, États-Unis</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler #5, pointe 0,1 x 0,06 mm</td><td>WPI, Sarasota, États-Unis</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Oxygène gazeux (qualité médicale O2)</td><td>Linde, Munich, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gaz carbogen (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, Munich, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise,</td><td>États-Unis 7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, États-Unis</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Henkel, D&uuml ; sseldorf, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose à bas point de fusion</td><td>Roth, Karlsruhe, Allemagne</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Héparine-sodium-25000 E.-I./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevée, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, États-Unis</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplificateur</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Allemagne</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur à faible grossissement</td><td>Narashige, Tokyo, Japon</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur à trois axes à fort grossissement</td><td>Narashige, Tokyo, Japon</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Pompe</td> <td>à perfusion péristaltiqueMulti Channel Systems, Reutlingen, Allemagne</td> Contrôleur de température <td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>2 canaux</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Allemagne</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur d’impulsions carrées</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Allemagne</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Les cardiomyocytes murins ont été largement utilisés pour des études in vitro de la physiologie cardiaque et de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cependant, les préparations multicellulaires de cardiomyocytes dissociés ne sont pas représentatives de la structure complexe in vivo des cardiomyocytes, des non myocytes et de la matrice extracellulaire, ce qui influence les propriétés mécaniques et électrophysiologiques du cœur. Nous décrivons ici une technique pour préparer des tranches ventriculaires viables de coeurs de souris adultes avec une structure de tissu préservée in vivo et démontrer leur aptitude à des enregistrements électrophysiologiques. Après l&#39;excision du cœur, les ventricules sont séparés des oreillettes, perfusés avec une solution exempte de Ca2 + contenant du monoxime de 2,3-butanedione et incorporés dans un bloc d&#39;agarose à faible teneur en masse fondue à 4%. Le bloc est placé sur un microtome avec une lame vibrante, et des tranches de tissu avec une épaisseur de 150 à 400 μm sont préparées en gardant la fréquence de vibrationDe la lame à 60-70 Hz et de déplacer la lame vers l&#39;avant aussi lentement que possible. L&#39;épaisseur des tranches dépend de l&#39;application supplémentaire. Les tranches sont stockées dans la solution de Tyrode glacée avec 0,2 mM Ca 2+ et 2,3-butanedione monoxime (BDM) pendant 30 minutes. Ensuite, les tranches sont transférées à 37 ° C de DMEM pendant 30 minutes pour laver le BDM. Les tranches peuvent être utilisées pour des études électrophysiologiques avec des électrodes tranchées ou des réseaux de micro-électrodes, pour des mesures de force pour analyser la fonction contractile ou pour étudier l&#39;interaction des cardiomyocytes et des tissus hôte présents dans les cellules souches transplantées. Pour les enregistrements d&#39;électrodes pointues, une tranche est placée dans un plat de culture cellulaire de 3 cm sur la plaque chauffante d&#39;un microscope inversé. La tranche est stimulée par une électrode unipolaire, et les potentiels d&#39;action intracellulaire des cardiomyocytes dans la tranche sont enregistrés avec une électrode en verre tranchant.

L&#39;infarctus du myocarde entraîne une perte pratiquement irréversible des cardiomyocytes. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pour la régénération cardiaque exogène est une approche thérapeutique prometteuse. L&#39;intégration électrique et la maturation des cellules transplantées sont essentielles pour la sécurité et l&#39;efficacité de la thérapie de remplacement cellulaire. <p class="jove_content" fo:keep-together.with...

Ici, nous décrivons la préparation de tranches ventriculaires viables à partir de souris adultes et leur utilisation pour des enregistrements de potentiel d&#39;action des électrodes pointues. Ces préparations multicellulaires fournissent une structure tissulaire similaire in vivo , ce qui en fait un modèle précieux pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques in vitro .

Tranches de coeur ventriculaire à courte aiguille murine pour études électrophysiologiques

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

L'objectif général de cette technique est d'obtenir des tranches cardiaques ventriculaires viables, adaptées aux enregistrements électrophysiologiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'électrophysiologie cardiaque au niveau tissulaire, telles que l'intégration électrique de cardiomyocytes transplantés ou les effets de médicaments cardioactifs. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les tranches de tissu ventriculaire viables conservent une structure tissulaire proche de celle in vivo, ce qui permet des mesures directes dans toutes les régions du cœur.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'électrophysiologie cardiaque murine, elle peut également être appliquée à d'autres animaux, comme le lapin ou le cobaye. Pour commencer cette procédure, essuyez d'abord la peau de l'animal avec de l'éthanol à 70 %. Après ouverture du thorax, disséquez soigneusement le péricarde du cœur à l'aide de petites ciseaux et de pinces.Insérez une canule dans le ventricule gauche et perfusez le cœur in situ avec une solution de Tyrode glacée sans calcium, jusqu'à l'élimination du sang résiduel. Ensuite, résectionnez délicatement le cœur et transférez-le dans la solution de Tyrode glacée sans calcium. Séparez les oreillettes des ventricules à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux.Ensuite, placez les ventricules avec l'apex orienté vers le haut dans le moule en agarose. Puis, insérez l'épingle au centre du moule et dans la chambre du ventricule gauche. Remplissez le moule avec de l'agarose à faible point de fusion à 4 % à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que le cœur soit entièrement recouvert.Ensuite, placez le moule sur de la glace pour accélérer la prise de l'agarose et empêcher le tissu de flotter. Après une minute, retirez le bloc d'agarose contenant les ventricules du moule à l'aide d'un scalpel. Puis, retournez le bloc à l'envers et remplissez les cavités ventriculaires ainsi que l'espace situé à l'arrière du bloc d'agarose avec de l'agarose à bas point de fusion à 4 % à l'aide d'une seringue.Ensuite, aplatir le bloc d'agarose à l'aide d'un scalpel afin d'obtenir une base plane et une position verticale de l'apex cardiaque. Lors de cette étape, fixer le bloc sur le porte-échantillon du microtome à l'aide d'une goutte de colle cyanoacrylate, l'apex cardiaque étant orienté vers le haut. Puis, placer le porte-échantillon dans la chambre interne du microtome destinée aux échantillons, remplie de solution de Tyrode glacée sans calcium.Veillez à ce que le bloc d'agarose soit entièrement recouvert de solution de Tyrode. Préparez les tranches avec une épaisseur de 150 à 400 micromètres, selon l'application ultérieure. Maintenez la fréquence de vibration de la lame entre 60 et 70 hertz, et déplacez la lame vers l'avant aussi lentement que possible.Ensuite, utilisez un pinceau fin pour retirer soigneusement l'agarose restante des tranches. Puis, transférez délicatement les tranches à l'aide d'une pipette Pasteur dans la solution de Tyrode, contenant 0,9 millimolaire de calcium, saturée avec de l'oxygène à 100 %. Conservez-les pendant au moins 30 minutes sur de la glace afin qu'elles se remettent de la procédure de découpage.Placer les tranches sur un filet permet de les maintenir à plat. Ensuite, utiliser du papier filtre et un deuxième filet pour transférer les tranches dans du DMEM à 37 degrés Celsius, saturé avec du carbogène, afin d'éliminer le BDM avant une utilisation ultérieure. Pour le préchauffage, allumer tous les appareils électriques 30 minutes avant les enregistrements.Placez une boîte de culture cellulaire de trois centimètres avec la plaque chauffante sur le microscope inversé. Ensuite, placez l'électrode annulaire sur mesure dans la boîte et connectez les fils de mise à la terre du préamplificateur et de l'électrode de stimulation. Après cela, connectez les tubes flexibles du système de perfusion à la boîte.Remplissez le réservoir du système de perfusion avec du DMEM et aérez-le au carbogène. Ensuite, allumez la pompe de perfusion et réglez le débit de perfusion à deux à trois millilitres par minute. Ajustez la température du DMEM dans la boîte à 37 degrés Celsius en régulant le chauffage du flux et la plaque chauffante.Maintenant, placez une coupe ventriculaire dans la boîte contenant le DMEM. À l’aide du microscope inversé, vérifiez l’intégrité structurale et la viabilité du tissu. Ensuite, remplissez une électrode de enregistrement en verre avec du chlorure de potassium à trois molaire et une électrode de stimulation avec du DMEM.Ensuite, placez l'électrode d'enregistrement sur l'électrode de stimulation située sur les supports d'électrodes. Puis, placez délicatement l'électrode de stimulation sur la tranche. Allumez le stimulateur électrique et commencez avec une fréquence de stimulation d'un à deux hertz.Ensuite, déplacez l'électrode d'enregistrement à l'aide d'un micromanipulateur jusqu'à la position d'enregistrement prévue. Abaissez lentement l'électrode d'enregistrement jusqu'à ce que sa pointe touche le tissu. Une fois que l'enregistrement détecte le contact, appliquez une courte impulsion électrique rectangulaire à travers l'électrode d'enregistrement pour pénétrer la membrane cellulaire.Ensuite, repositionnez soigneusement l'électrode d'enregistrement jusqu'à l'obtention d'un signal stable. Puis, commencez l'enregistrement des potentiels d'action. Pour évaluer l'intégration et la maturation, des cardiomyocytes issus de CMiPSc exprimant l'eGFP ont été transplantés dans les cœurs sains de souris adultes.On voit ici une coupe cardiaque ventriculaire contenant les iPSCM transplantées, qui ont été stimulées de manière focale par une électrode unipolaire placée dans le tissu hôte. Les potentiels d'action intracellulaires ont été enregistrés à l'aide de microélectrodes en verre effilées remplies de chlorure de potassium à trois molarités, sur les iPSCM transplantées positives pour l'eGFP et sur le tissu hôte voisin au sein des tranches. Voici les enregistrements des potentiels d'action, dans le tissu hôte sain et dans les iPSCM transplantées.La tranche a été stimulée de manière focale à l’aide d’une électrode de stimulation placée dans le tissu hôte, à environ deux hertz et cinq hertz. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une à deux heures, si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l’esprit de maintenir la vitesse d’avancement de la lame du microtome aussi lente que possible.Après cette procédure, d'autres méthodes, telles que les premières mesures, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires. Après son développement, cette technique a permis aux chercheurs dans le domaine de la thérapie cellulaire d'explorer l'activité électrique, l'intégration et la maturation des cardiomyocytes transplantés dans les cœurs receveurs. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation de tranches vitales d'axe court ventriculaire, à l'aide d'un microtome à lame vibrante.Ces tranches sont particulièrement adaptées aux enregistrements électrophysiologiques à l'aide d'électrodes en verre effilées.

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Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

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