Quantifier la pigmentation abdominale dans Drosophila melanogaster

L’objectif global de cette méthodologie est de quantifier rapidement la pigmentation abdominale chez la mouche des fruits Drosophila melanogaster. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie évolutive, telles que l’identification des loci génétiques qui sous-tendent à leur tour la morphologie de la variation spécifique à la fiducie et la compréhension du développement et de l’évolution des phénotypes morphologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet aux utilisateurs de mesurer de manière non destructive divers aspects de la pigmentation abdominale, y compris l’étalement et la profondeur de la pigmentation.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster, elle peut également être appliquée à d’autres espèces de drosophiles et facilement adaptée pour mesurer les modèles de pigmentation chez d’autres insectes et taxons animaux. Avant l’imagerie, les mouches peuvent être stockées dans de l’éthanol à 70 % pour maintenir leur pigmentation. La visualisation nécessite un socle de montage.

Chargez une boîte de Pétri de 60 millimètres avec environ 10 millilitres de gélose à 1,25 % dans de l’eau. Au microscope, à l’aide d’une pince fine, creusez une tranchée de 20 millimètres de long, deux millimètres de large et un millimètre de profondeur dans le gel. Plusieurs tranchées peuvent être faites dans un seul plat.

Ensuite, enfoncez les mouches dans la tranchée avec la surface d’analyse située juste au-dessus de la surface du gel. Dans ce cas, la face dorsale est intéressante. Maintenant, remplissez le plat avec 70 % d’éthanol jusqu’à ce que les mouches soient complètement immergées.

Cela réduit les reflets de la cuticule qui peuvent obscurcir le motif de pigmentation. Maintenant, démarrez le logiciel d’imagerie et l’appareil photo numérique connectés au microscope. Pour une source lumineuse, la lumière froide d’un appareil à double col de cygne est amplement suffisante.

Dans le logiciel d’analyse d’images, définissez le type d’image sur 8 bits. Ensuite, dans le logiciel de capture d’image, basculez le paramètre Live pour ouvrir une fenêtre de vue de la caméra. Définissez le type d’image sur Niveaux de gris.

Maintenant, réglez la source lumineuse à son intensité maximale et positionnez les lumières à environ 120 millimètres de la scène. Réglez le microscope sur un grossissement de 60 fois afin que le champ de vision soit de trois millimètres de large. Placez ensuite le micromètre de la platine de deux millimètres dans le champ de vision et faites la mise au point dessus.

De retour au logiciel, ajustez le temps d’exposition pour afficher le micromètre à l’aide du champ situé dans la boîte d’exposition. Réglez ensuite l’échelle. Ouvrez l’outil de ligne droite et tracez la longueur de deux millimètres le long du micromètre de la platine.

Entrez ensuite cette longueur sous l’option Définir l’échelle. La fenêtre devrait alors afficher l’échelle en pixels par micron. Prenez note de l’échelle et OK les ajustements.

Maintenant, revenez au logiciel de capture d’image et utilisez les commandes Stop et Snap pour capturer une image du micromètre de la platine. Revenez ensuite au logiciel d’analyse d’images et enregistrez l’image en tant que fichier Tiff. Maintenant, concentrez-vous sur la ligne médiane dorsale d’une mouche montée.

La ligne médiane doit être positionnée vers le haut pour obtenir les meilleurs résultats d’imagerie. Écartez les ailes et toute autre structure gênante et ajustez l’éclairage pour éclairer au mieux la cuticule. Ensuite, réglez l’exposition dans le logiciel de capture d’image à l’aide de l’histogramme des valeurs de pixels comme guide pour capturer toute la plage de pixels de l’image sans saturation, maximisant ainsi le contraste.

Conservez cette exposition et cet éclairage tout au long de l’expérience. Maintenant, avant de capturer une image, assurez-vous que les segments abdominaux d’intérêt sont visibles. Capturez ensuite une image et enregistrez-la avec le numéro d’identification de l’échantillon dans le nom de fichier.

Utilisez le format décrit dans le protocole écrit. Cette analyse utilise une macro fournie par les auteurs. Les séries d’images à analyser doivent toutes être contenues dans le même dossier.

Maintenant, démarrez la macro et suivez les commandes demandées. Tout d’abord, identifiez l’emplacement des fichiers stockés. Identifiez ensuite l’emplacement où les données d’analyse doivent être stockées.

Ensuite, entrez le nombre de caractères qui ont été utilisés dans les noms de fichiers afin que le logiciel lise correctement la série d’images. L’invite suivante concerne la largeur de la région d’intérêt. Ici, entrez le nombre de pixels le long de la bande antéro-postérieure qui doit être analysé.

Maintenant, à l’invite, faites le choix d’analyser la première image de la série. Les autres options sont d’analyser l’image suivante de la série ou de quitter l’analyse. L’outil de ligne est automatiquement sélectionné.

Utilisez-le pour identifier la ligne médiane de l’image en traçant une ligne le long de celle-ci dans la direction de l’avant vers l’arrière. Ensuite, suivez les invites de la macro pour identifier le bord postérieur de Tergite4 à l’aide de l’outil ligne. L’outil Ligne est mis à disposition pour tracer la ligne du bord médian postérieur au bord latéral droit de sorte que le centre de la ligne soit juste postérieur au bord postérieur de la bande pigmentaire.

Définissez ensuite le bord antérieur de Tergite4 à l’aide de l’outil ligne. Tracez une ligne entre le bord médian antérieur et le bord latéral droit. Le milieu de la ligne définie par un carré blanc doit se trouver sur le bord antérieur de la cuticule légèrement pigmentée.

Avec ces informations, la macro génère maintenant un profil de pigmentation. Cependant, le profil peut être imprécis si des poils ou d’autres imperfections traversent la bande le long de laquelle le profil est mesuré. Pour corriger cela, sélectionnez l’aperçu en direct dans la fenêtre de l’histogramme et ajustez la ligne de sorte que le profil soit lisse.

Pour que la bande d’analyse d’image capture avec précision les différents aspects de la pigmentation, il est essentiel d’identifier une zone d’analyse qui aura un bruit minimal causé par les irrégularités de l’image ou de l’échantillon. Procédez maintenant à l’analyse de Tergite3 dans la même image, puis passez à l’image suivante. La procédure décrite a été utilisée pour explorer un changement connu de la pigmentation abdominale causé par la température d’élevage.

Les troisième et quatrième tergites ont été examinés à plusieurs reprises sous divers éclairages et expositions. Divers aspects de la pigmentation ont été explorés. Et plus précisément, il a été constaté que les bandes de pigmentation étaient plus larges lorsque les mouches étaient élevées à des températures plus fraîches.

Les valeurs calculées ont ensuite été comparées à des mesures subjectives générales effectuées sur les mêmes mouches par cinq observateurs différents. Dans l’évaluation de 45 mouches femelles, le classement moyen observé de la largeur de la quatrième bande de pigmentation abdominale était étroitement corrélé avec la mesure automatisée de la macro. La même bande de pigmentation a également été mesurée manuellement à l’aide d’un logiciel d’imagerie.

Ces résultats étaient également fortement corrélés avec les mesures générées à l’aide de la macro. Le logiciel a ensuite été testé pour mesurer la pigmentation chez les mutants femelles en ébène, qui sont bien connus pour avoir une pigmentation accrue dans les troisième et quatrième bandes de pigments. La méthode a également été utilisée pour mesurer les cinquième et sixième bandes abdominales des femelles de type sauvage.

La technique automatisée a toujours fourni des mesures utiles de la densité des pigments et de la taille de la bande. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale chez la drosophile. La maîtrise de la technique nécessite principalement l’utilisation en profondeur de pinces.

Une fois maîtrisée, la partie imagerie de cette technique peut être réalisée à une cadence de 50 échantillons par heure. L’extraction des mesures de pigmentation de ces images peut se faire à un rythme de 70 images par heure.