Name: Mesure de labsorption de glucose et réponse à la stimulation de linsuline dans In Vitro Myotubes primaires humains cultivés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Apprenez à mesurer l'absorption de glucose stimulée par l'insuline dans des myotubes primaires humains cultivés in vitro. Cette technique quantifie les effets biologiques de l'insuline sur le métabolisme musculaire.

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Les auteurs reconnaissent Anne Charrié au service de Radiobiologie (hôpital de Lyon-Sud) et Fond National Suisse (FNS) pour leur soutien financier.

1. Préparation des supports de culture cellulaire et des solutions <ol><li> Préparation des milieux de culture <ol><li> Préparer le milieu de prolifération (PM) en complétant le milieu F-10 de jambon avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 ug / ml de finale), 2% de sérum de veau fœtal (FCS) et 2% de substitut de sérum. </li><li> Préparer le milieu de différenciation (DM) en complétant le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec de la glutamine (2 mM), de la pénicilline / streptomycine (5 μg / mL) et 2% de FCS. </li></ol></li><li> Préparation des solutions d&#39;absorption du glucose Attention: la manipulation de matières radioactives n&#39;est autorisée que dans un espace restreint et contrôlé par un personnel autorisé. Les matériaux et les déchets doivent être manipulés conformément aux procédures, directives et législation locales appropriées. <ol><li> Pour préparer la solution saline tamponnée au phosphate de X-Dulbecco (X-DPBS), faire une solution de DPBS contenant 0,2% (p / v) (concentration finale) de sérum bovin albUmin (BSA). Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm. Conserver à 4 ° C. </li><li> Pour préparer une solution froide de 2-désoxy-D-glucose (2dG), pesez 16,4 mg de 2dG et solubilisez dans 10 ml d&#39;eau distillée pour obtenir une solution 10 mM. Conserver à 4 ° C. </li><li> Ajouter 600 μl de 2dG froid et 6 μL de [ 3 H] 2dG à 5400 μL de X-DPBS radiomarqués pour obtenir la solution 2dG (2dG *) radiomarquée. NOTE: La concentration finale est 1 mM 2dG et l&#39;étiquetage est de 1 μCi / mL. <ol><li> Mettre de côté une aliquote de 20 μL (TC20) de solution 2dG * radiomarquée. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de mélanges d&#39;incubation <ol><li> Pour le mélange de cytochalasine B, ajouter 2 μL de cytochalasine B 20 mM à 2 ml de solution 2dG * radiomarquée. NOTE: La solution stockée de cytochalasine B est à 10 mg / ml dans du diméthylsulfoxyde (DMSO). </li><li> Pour le mélange de DMSO, ajouter 4 μL de DMSO aux 4 mL restants de solution 2dG * radiomarquée. </li></Ol&gt; </li></ol> 2. Culture des cellules musculaires primaires humaines <ol><li> Semis de plaques à 6 puits avec cellules satellites de muscle humain REMARQUE: Utilisez en interne (voir la référence 24 pour plus de détails) ou des cellules satellites de muscle humain disponibles dans le commerce à partir d&#39;un flacon congelé (contenant 250 000 cellules). La procédure suivante est donnée pour 250 000 cellules afin d&#39;obtenir une plaque de 6 puits nécessaire à la mesure de l&#39;absorption du glucose en une seule condition. <ol><li> Décongeler rapidement les flacons congelés de 24 ou des préparations commerciales de cellules satellites musculaires humaines dans de l&#39;eau préchauffée (37 ° C) jusqu&#39;à ce que seul un petit bloc de glace reste dans le flacon. </li><li> Verser directement dans un tube en plastique de 50 ml contenant 10 ml de pré-chauffé (37 ° C) PM. </li><li> Centrifuger pendant 5 min à 500 xg et jeter le surnageant. </li><li> Remplacer doucement le culot cellulaire avec 18 ml de PM préchauffé (pour obtenir 42 000 cellules par3 ml de milieu). Distribuer 3 mL dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits (9,6 cm 2 ). NOTE: Les six puits individuels d&#39;une plaque doivent effectuer une mesure en double de l&#39;absorption de glucose pour les conditions suivantes: inhibition du transport passif (puits 1 et 2), taux basal (puits 3 et 4) et taux stimulé par l&#39;insuline (puits 5 et 6). Répétez autant de plaques à six puits que des traitements distincts sont nécessaires. </li><li> Incuber dans des conditions de culture standard (37 ° C, 5% de CO 2 ) jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent 90% de confluence. REMARQUE: cette étape prend entre 48 et 72 h selon le lot de cellules. Ne changez pas de moyen pendant cette étape. </li></ol></li><li> Différenciation des cellules musculaires <ol><li> Retirer le PM (après 48-72 h) et le remplacer par du DM préchauffé (3 mL par puits). Incuber à 37 ° C, 5% de CO 2 . NOTE: La différenciation prend cinq jours pour atteindre un état stable où les cellules sont alignées et polynucléées. Généralement, le primaireLes myotubes sont cultivés dans un milieu glucose de 1 g / L. Par conséquent, pour éviter l&#39;appauvrissement du glucose pendant la culture, remplir la plaque avec 3 mL de milieu pour s&#39;assurer que suffisamment de substrat de glucose est disponible pour les cellules en tout temps. </li><li> Remplacer le DM moyen tous les deux jours. REMARQUE: à partir de ce point, les myotubes sont stables jusqu&#39;à 7 jours sans changement significatif et la mesure de l&#39;absorption du glucose peut être effectuée à tout moment. </li></ol></li><li> Traitement des cellules musculaires (facultatif) REMARQUE: Les myotubes primaires peuvent être traités pendant plusieurs jours pour induire une modification (test médicamenteux, inhibiteurs / activateurs de la voie de signalisation, etc. ) avant la stimulation de l&#39;insuline et les mesures d&#39;absorption du glucose. Les cellules musculaires peuvent être soumises à tout traitement qui peut avoir un impact sur la sensibilité à l&#39;insuline, et la mesure de l&#39;absorption du glucose quantifiera cet impact. Par exemple, l&#39;incubation des cellules musculaires avec le palmitate d&#39;acide gras saturé favorise la résistance à l&#39;insuline et les cellules affichent une réduction de iNsulin a stimulé l&#39;absorption de glucose. <ol><li> Préparer 12 mL de DM additionné de 10% de BSA (sans acides gras) et de palmitate de 0,5 mL (PALM). Préparez 12 mL de DM complété par 10% de BSA (sans acide gras) uniquement. </li><li> Préparez deux plaques de 6 puits avec des myotubes primaires humains et les cultiver comme décrit dans les sections 2.1 et 2.2 (avec 5 jours de différenciation). </li><li> Le jour 5, laver chaque puits avec 2 mL de PBS. À une assiette, ajouter 2 ml de DM contenant du PALM. À l&#39;autre plaque, ajouter 2 mL de BSA contenant seulement du DM. </li><li> Incuber pendant 48 h à 37 ° C, 5% de CO 2 . </li></ol></li></ol> 3. Stimulation de l&#39;insuline <ol><li> Laver les cellules musculaires différenciées deux fois avec 2 mL de PBS. </li><li> Retirer PBS soigneusement et incuber avec 3 mL de DM sans FCS pendant 3 h (37 ° C, 5% de CO 2 ) pour l&#39;appauvrissement du sérum. </li><li> Remplacez les médias dans tous les puits par 3 mL de DM sans FCS. Ajouter l&#39;insuline 100 nM aux puits 5 et 6. </li><li> Incuber la culture des myotubes humains pour1 h (37 ° C, 5% de CO 2 ). </li></ol> 4. Capture de glucose <ol><li> Après 1 heure de stimulation à l&#39;insuline, lavez les puits deux fois avec du X-DPBS (1 mL par lavage). </li><li> Ajouter 1 mL de mélange de cytochalasine B aux puits 1 et 2 et 1 mL de mélange de DMSO aux puits 3 à 6. Incuber pendant 15 minutes (37 ° C, 5% de CO 2 ). À la fin de l&#39;incubation, placez immédiatement la plaque sur de la glace. </li></ol> 5. Cell Lysis <ol><li> Laver les cellules deux fois avec 1 ml de PBS glacé. </li><li> Lyse les cellules dans chaque puits avec 600 μL de 50 mM de NaOH. Incuber sur de la glace pendant 5 min et mélanger doucement avec une rotation orbitale lente. REMARQUE: Si le lysat est trop visqueux, diluer avec 1,5 ml de NaOH. </li><li> À l&#39;aide d&#39;une pipette, ré-endiguer et collecter le lysat cellulaire. </li></ol> 6. Détermination du glucose radiomarqué <ol><li> Mettez 400 μL de chaque lysat cellulaire dans un flacon de comptage de scintillation liquide. Préparer un flacon de contrôle négatif avec 400ΜL de NaOH 50 mM et un flacon de contrôle positif avec 20 μL de TC20 (à partir de l&#39;étape 1.2.3.1). </li><li> Ajouter 4 mL de solution de scintillation liquide à chaque flacon. Fermez le capuchon et mélangez chaque flacon à fond (1-2 s). </li><li> Insérez chaque flacon dans un compteur de scintillation liquide et mesurez la radioactivité selon les instructions du fabricant. Enregistrez les comptes par minute (CPM) pour chaque flacon de scintillation pendant 10 min. REMARQUE: CPM = &quot;désintégrations par minute&quot; x &quot;efficacité de comptage&quot;. </li></ol> 7. Taux d&#39;absorption de glucose <ol><li> Utilisez le lysat restant (200 μL, à partir de l&#39;étape 5.2) pour mesurer la concentration en protéines. Déterminer la concentration en protéines de chaque lysat cellulaire en utilisant Bradford 25 ou une méthode équivalente. Calculez la quantité totale de protéines (Q) en mg pour chaque puits. </li><li> Pour obtenir TC1 (la valeur pour 1 μL de 2dG radiomarqué *), divisez la valeur CPM de TC20 de 20. </li><li> Pour chaque flacon, calculez tLe taux d&#39;absorption de glucose comme suit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOTE: R est mesuré en pmol / mg / min. La moyenne de R pour les puits 1 à 2 donne un taux de transport passif, R p . Moyenne de R pour les puits 3-4 donne le taux de transport total basal, R bt . La moyenne de R pour les puits 5-6 donne un taux de transport total stimulé par l&#39;insuline, R it . <ol><li> Calculer le taux de transport actif basal (R ba ) comme suit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> Calculer le taux de transport actif stimulé par l&#39;insuline (R ia ) comme suit: <img alt="Équation" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOTE: Dans les cellules sensibles à l&#39;insuline comme les myotubes, les taux d&#39;absorption de glucose sont généralement représentés par trois valeurs: R ba , R ia et la stimulation de l&#39;insuline pliante comme R ia / R ba . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;absorption de glucose est une mesure biologique clé pour tester les activateurs ou les inhibiteurs de la culture cellulaire et leur impact sur l&#39;utilisation du glucose et la capacité de la cellule à répondre à l&#39;insuline. La méthode décrite ici s&#39;est révélée rapide et fiable et a été largement utilisée dans de nombreuses études utilisant des myotubes primaires de sujets sains et / ou métaboliquement affectés 6 , 7 , <sup class="xref"...

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l&#39;homéostasie du glucose. Ce tissu sensible à l&#39;insuline est le site principal de l&#39;absorption de glucose qui est déclenchée par la stimulation de l&#39;insuline 1 . Dans le diabète de type 2, la résistance à l&#39;insuline est observée dans plusieurs tissus, y compris le muscle squelettique, et conduit à une concentration de glucose sanguin supérieure à la normale. Ainsi, il est très important de déterminer le niveau de sensibilité à l&#39;insuline de ce tissu et de ses cellules, qu&#39;il s&#39;agisse de caractériser un défaut d&#39;un sujet ou d&#39;évaluer l&#39;efficacité d&#39;un traitement visant à l&#39;améliorer. Chez les sujets humains ou animaux, la technique d&#39;étalon-or pour évaluer la sensibilité à l&#39;insuline est la pince hyperinsulinémique-euglycémique. Introduit par DeFronzo en 1979 2 et modifié depuis 3 , 4 alors, la méthode permet de quantifier tout le corps aLa capacité de réponse de l&#39;insuline aux tissus est mesurée comme le taux de glucose à perfuser sous stimulation à l&#39;insuline pour maintenir une concentration normale de glucose dans le sang. L&#39;exploration de la sensibilité à l&#39;insuline peut également être effectuée au niveau des cellules en utilisant des modèles musculaires in vitro , et la mesure des taux d&#39;absorption de glucose reste un outil efficace et fiable pour quantifier la réponse biologique de la stimulation cellulaire à l&#39;insuline 5 , 6 , 7 . En effet, la mesure de l&#39;absorption de glucose quantifie la réponse biologique cellulaire à la stimulation de l&#39;insuline, de la liaison de l&#39;insuline à son récepteur à la translocation des vésicules enrichies en GLUT4, y compris les cascades de signalisation intracellulaire et de phosphorylation 8 . Ceci est d&#39;un intérêt majeur pour les échantillons humains, car les myotubes différenciés maintiennent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris les propriétés métaboliquesIes et troubles observés chez le patient 9 , 10 , 11 , 12 . Les myotubes présentent des similitudes structurelles, métaboliques et phénotypiques avec le muscle squelettique 13 , 14 , y compris l&#39;expression des transporteurs de glucose 15 et les machines de signalisation cellulaire insuline 16 . Ainsi, la mesure de l&#39;absorption de glucose dans les myotubes primaires est pertinente pour caractériser le phénotype musculaire d&#39;un donneur ou pour étudier l&#39;effet d&#39;une intervention (médicament, nutrition ou activité physique) sur la sensibilité à l&#39;insuline dans la cellule musculaire. La mesure de l&#39;absorption de glucose sur les myotubes cultivés est également un outil fiable lors de l&#39;exécution d&#39;expériences qui modifient la sensibilité à l&#39;insuline 17 , 18 . L&#39; in vitro </Em&gt; est adapté pour le test de tout composé qui pourrait améliorer la réactivité de l&#39;insuline, ou pourrait prévenir ou inverser la résistance à l&#39;insuline acquise ou induite 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la culture et différencions les myotubes humains et mesurons les taux d&#39;absorption de glucose cellulaire. La méthode s&#39;applique à toute source de cellules précurseurs musculaires humaines, qu&#39;elles proviennent de préparations, de collaborations ou de fournisseurs commercialement disponibles dans le laboratoire. Les lignées de cellules musculaires immortalisées, comme C2C12 et L6, respectivement à partir d&#39;origine de souris et de rat, peuvent également être utilisées pour la mesure de l&#39;absorption de glucose avec ce protocole 7 . Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basaux et stimulés par l&#39;insuline en utilisant [3H] 2dG radiomarqué. TL&#39;utilisation d&#39;un analogue de glucose marqué permet une détermination précise de l&#39;entrée de glucose avec un matériau de départ réduit, une condition commune lorsque vous travaillez avec des cellules primaires. La molécule de glucose modifiée est incapable d&#39;entrer dans les voies métaboliques, et donc, s&#39;accumule dans la cellule, permettant une quantification fiable via la radioactivité cellulaire totale. Les conditions expérimentales comprennent l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur du transport du glucose (cytochalasine B), et les mesures sont effectuées avec et sans insuline. Cette combinaison permet la détermination des taux d&#39;entrée active du glucose, ainsi que le calcul du changement de pli pour l&#39;indice de réponse à l&#39;insuline. La méthode est présentée avec une dose d&#39;insuline pendant un seul temps d&#39;incubation, mais le protocole peut être facilement modifié pour des expériences de réponse à la dose ou de temps 12 .

<table><tbody><tr><td>Préparation</td><td>maison à partir de biopsies des muscles squelettiques humains</td><td>Préparation maison à partir de biopsies des muscles squelettiques humains</td><td>Si elle n’est pas disponible, utilisez une source commerciale</td></tr><tr><td>Cellule musculaire primaire humaine</td><td>Promocell</td><td>C-12530</td><td>Doit être cultivée avec les milieux associés C23060 et C23061</td></tr><tr><td>Plaque à 6 puits</td><td>Corning</td><td>356400</td><td>BioCoat Collagen I Plaques</td></tr> <tr><td>multipuitsHam’s F10</td><td>Dutscher</td><td>L0145-500</td><td>1 g/L de glucose</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Dutscher</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>péniciline/streptomycine 100x</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Substitut de sérum UltroserG</td><td>Pall France</td><td>15950.017</td><td>substitut de sérum dans le texte</td></tr><tr><td>DMEM faible teneur en glucose</td><td>Dutscher</td><td>L0064-500</td><td>1 g/L de glucose</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline</td><td>Dutscher</td><td>L0625-500</td><td>Contient Mg2+ (0,5 mM) et Ca2+ (0,9 mM)</td></tr><tr><td>Solution d’insuline humaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>2-désoxy-D-glucose&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>sans acides gras BSA</td><td>Roche</td><td>10,775,835,001</td><td></td></tr><tr><td>palmitate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET328A001MC</td><td>Activité spécifique : 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq</td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>c2743</td><td></td></tr><tr><td>PICO PRIAS FLACON 6 mL</td><td>PerkinElmer</td><td>6000192</td><td></td></tr><tr><td>ultima gold MW CA&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>6013159</td><td>liquide à scintillation</td></tr><tr><td>b&ecirc ; Compteur TA&nbsp ;</td><td>PerkinElmer</td><td>2900TR</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de l&#39;absorption de glucose et réponse à la stimulation de l&#39;insuline dans<em&gt; in vitro</em&gt; myotubes primaires humains cultivés

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Le muscle squelettique est le plus grand dépôt de glucose chez les mammifères et contribue largement à l&#39;homéostasie du glucose. L&#39;évaluation de la sensibilité à l&#39;insuline des cellules musculaires est d&#39;une importance majeure pour toutes les études consacrées à l&#39;exploration du métabolisme du glucose musculaire et à la caractérisation des altérations métaboliques. Dans les cellules musculaires, les protéines de transporteur de glucose de type 4 (GLUT4) se transposent vers la membrane plasmique en réponse à l&#39;insuline, ce qui permet une entrée massive de glucose dans la cellule. La capacité des cellules musculaires à répondre à l&#39;insuline en augmentant le taux d&#39;absorption de glucose est l&#39;une des lectures standard pour quantifier la sensibilité des cellules musculaires à l&#39;insuline. Les myotubes primaires humains sont un modèle in vitro approprié, car les cellules conservent de nombreuses caractéristiques du phénotype du donneur, y compris la sensibilité à l&#39;insuline. Ce modèle in vitro convient également pour le test de tout composé susceptible d&#39;avoir une incidence sur la réactivité de l&#39;insuline. Les mesures du taux d&#39;absorption de glucose dans les myotubes différenciés reflètentSensibilité à l&#39;insuline. Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés, et les taux d&#39;absorption de glucose avec et sans stimulation par l&#39;insuline sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux de transport de glucose passifs et actifs en utilisant [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiomarqué [2H]. Des méthodes de calcul sont fournies pour quantifier les taux basiques actifs et stimulés par l&#39;insuline, ainsi que le pli de stimulation.

Le jour 3, les myoblastes atteignent la confluence ( figure 1A ). Les myoblastes à ce stade sont typiquement mononucléés. Le moyen a été changé et, au jour 8, la différenciation a été complétée ( figure 1B ) (protocole section 2). Après 5 jours de différenciation, les myotubes sont alignés et typiquement polynucléés. Les myotubes primaires humains ont été soumis à un traitement par le palmitate ou un BSA uniquement avant la mesu...

Dans cette méthode, les cellules musculaires primaires humaines sont cultivées in vitro pour obtenir des myotubes différenciés et les taux d&#39;absorption du glucose sont mesurés. Nous fournissons un protocole détaillé pour quantifier les taux dans les états basal et stimulés par l&#39;insuline en utilisant du [ 3 H] 2-désoxy-D-Glucose radiomarqué.

Mesure de l&#39;absorption de glucose et réponse à la stimulation de l&#39;insuline dans<em&gt; In Vitro</em&gt; Myotubes primaires humains cultivés

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

L'objectif général de cette procédure est de mesurer l'absorption de glucose stimulée par l'insuline dans des cellules musculaires primaires humaines. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du métabolisme musculaire, telles que la sensibilité à l'insuline des cellules musculaires. Le principal avantage de cette technique est qu'elle quantifie l'effet biologique réel des cellules musculaires en réponse à une stimulation hormonale.Pour commencer l'expérience, préparez un milieu de prolifération, ou PM, en complétant le milieu Ham's F-10 avec 2 % de sérum de veau fœtal, ou FCS, 2 % de substitut de sérum, 2 millimoles de glutamine et 5 microgrammes par millilitre de pénicilline-streptomycine. Préparez un milieu de différenciation, ou DM, en complétant le milieu de Dulbecco modifié par l'aigle, ou DMEM, avec 2 % de FCS, 2 millimoles de glutamine et 5 microgrammes par millilitre de pénicilline-streptomycine. Pour préparer le X Phosphate Buffered Saline de Dulbecco, ou XDPBS, préparez une solution de DBPS contenant 0,2 % poids par volume d'albumine de sérum bovin.Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 micromètre. Ensuite, conserver le XDPBS à 4 degrés Celsius. Pour préparer la solution froide de 2DG, peser 16,4 milligrammes de 2DG et les solubiliser dans 10 millilitres d'eau distillée afin d'obtenir une solution de 10 millimolaire.Conserver la solution à 4 degrés Celsius. Ensuite, ajouter 600 microlitres de 2DG froid et 6 microlitres de 2DG radiomarqué à 5 400 microlitres de XDPBS afin d'obtenir la solution de 2DG radiomarqué. Mettre de côté un aliquot de 20 microlitres de la solution de 2DG radiomarqué.Pour le mélange de cytochalasine B, ajouter 2 microlitres de cytochalasine B à 20 millimolaire à 2 millilitres de solution de 2DG radiomarquée. Pour le mélange de DMSO, ajouter 4 microlitres de DMSO aux 4 millilitres restants de solution de 2DG radiomarquée. Décongeler rapidement les flacons congelés de cellules satellites musculaires humaines dans de l’eau préchauffée jusqu’à ce qu’il ne reste dans le flacon qu’un petit bloc de glace.Ensuite, versez directement les cellules dans un tube en plastique de 50 millilitres contenant 10 millilitres de PM préchauffé. Centrifugez le tube pendant cinq minutes à 500 × g. Puis, éliminez le surnageant. Ajoutez 18 millilitres de PM préchauffé au culot cellulaire et remettez délicatement les cellules en suspension. Répartissez 3 millilitres dans chaque puits d'une plaque de six puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant 48 à 72 heures, jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 90 %. Après 48 à 72 heures, retirer le milieu de propagation (PM) et le remplacer par 3 millilitres de milieu de différenciation (DM) préchauffé par puits. Incuber les cellules dans des conditions standard.Remplacer le milieu DM tous les deux jours. Il est important que les cellules musculaires en culture atteignent un état complètement différencié pour obtenir une réponse optimale à l'insuline, car les cellules différenciées présenteront une augmentation inverse faible, voire nulle, de la captation du glucose en réponse à l'insuline. Laver les cellules musculaires différenciées deux fois avec 2 millilitres de PBS.Ensuite, retirez soigneusement le PBS et incubez les cellules dans 3 millilitres de DM sans FCS pour l'épuisement du sérum. Puis, remplacez le milieu dans tous les puits par 3 millilitres de DM sans FCS. Ajoutez 100 nanomoles d'insuline dans les puits cinq et six.Ensuite, incuber la culture de myotubes humains. Après une heure de stimulation par l'insuline, laver les puits deux fois avec 1 millilitre de XDPBS. Ajouter 1 millilitre de mélange de cytochalasine B dans les puits un et deux et 1 millilitre de mélange de DMSO dans les puits trois à six.Incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 %CO2. À la fin de l'incubation, placer immédiatement la plaque sur de la glace. Laver les cellules deux fois avec 1 millilitre de PBS glacé.Lyserez les cellules dans chaque puits avec 600 microlitres de soude à 50 millimolaire. Incuberez les cellules sur de la glace pendant cinq minutes et les mélangerez délicatement par rotation orbitale lente. À l’aide d’une pipette, re-suspendrez et recueillerez le lysat cellulaire.Ajouter 400 microlitres de chaque lysat cellulaire dans un flacon de comptage par scintillation liquide. Préparer un flacon témoin négatif contenant 400 microlitres d'hydroxyde de sodium 50 millimolaire et un flacon témoin positif contenant 20 microlitres de TC20. Ensuite, ajouter 4 millilitres de solution de scintillation liquide dans chaque flacon.Fermer le bouchon et mélanger chaque tube soigneusement pendant une à deux secondes. Insérer chaque tube dans un compteur à scintillation liquide et mesurer la radioactivité conformément aux instructions du fabricant. Enregistrer les comptes par minute pour chaque tube à scintillation pendant 10 minutes.Des images prises au microscope optique au troisième jour révèlent que les myoblastes atteignent la confluence et sont généralement mononucléés. Après le changement de milieu et au huitième jour, la différenciation est terminée et les myotubes sont alignés et généralement polynucléés. Le taux de captation du glucose a été calculé dans la condition témoin et dans la condition de traitement.L'insuline augmente de manière significative le transport du glucose dans la condition avec BSA. Lorsque la réponse des cellules myotubulaires humaines à l'insuline est exprimée en facteur d'augmentation, il est clair que la réponse à l'insuline diminue dans les myotubes traités avec le palmitate. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier la sensibilité à l'insuline dans les cellules musculaires en déterminant les taux d'absorption du glucose.

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Ce protocole décrit une technique rapide pour quantifier la translocation de GLUT4 du cytoplasme vers la membrane plasmique des cellules par cytométrie en flux.

Mesure quantitative de GLUT4 Translocation à la membrane plasmique par cytométrie en flux

Cette vidéo présente un test in vitro permettant de mesurer indirectement l’absorption intracellulaire du glucose. Le test utilise un analogue du glucose marqué par fluorescence pour établir une corrélation entre l’épuisement extracellulaire du glucose et l’absorption intracellulaire du glucose.

Dosage in vitro de l’épuisement du glucose : une méthode basée sur la fluorescence pour quantifier l’absorption cellulaire du glucose par mesure extracellulaire de l’épuisement du glucose

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique ex vivo pour mesurer l’épuisement extracellulaire des analogues du glucose dans les organes de souris prélevés. Il s’agit d’incuber le tissu de la souris dans une solution contenant du désoxyglucose marqué par fluorescence, qui est absorbé par les cellules. L’absorption des analogues du glucose peut être déterminée indirectement en mesurant la fluorescence du milieu incubé.

Mesure de la déplétion extracellulaire en analogue du glucose fluorescent : une technique de mesure de substitution pour évaluer l’absorption du glucose dans les organes de souris ex vivo

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Évaluation de l’absorption du glucose dans les motoneurones des larves de drosophile avec un métabolisme du glucose régulé à la hausse

Le but du présent protocole est de mesurer l’effet des changements induite par le glucose de la respiration mitochondriale en présence de composés naturels sur les cellules bêta intact 832/13 à l’aide de respirométrie haute résolution.

Haute résolution respirométrie pour évaluer la fonction mitochondriale des cellules bêta intactes en présence de composés naturels

Nous présentons ici homogène temps résolu vous inquiétez (HTRF) comme une méthode efficace pour la détection rapide de l’insuline sécrétée par les cellules.

Homogène Time-resolved Förster Resonance Energy axée sur le transfert test pour la détection de l’insulinosécrétion

Ce protocole décrit comment effectuer des essais rapides de luciferase à faible coût à débit moyen à l'aide d'une luciferase Gaussia liée à l'insuline comme un proxy pour la sécrétion d'insuline à partir de cellules bêta. L'analyse peut être effectuée avec la plupart des lecteurs de plaques de luminescence et des pipettes multicanaux.

Mesurer la sécrétion relative d'insuline à l'aide d'une mère porteuse co-sécrétée par Luciferase

Une régulation intacte de l’absorption du glucose musculaire est importante pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps. Ce protocole présente une évaluation de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les muscles squelettiques matures isolés et incubés lors de la délimitation de l’impact de diverses interventions physiologiques sur le métabolisme du glucose dans tout le corps.

Mesure de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans le muscle squelettique mature isolé et incubé de souris

L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

L’épuisement extracellulaire du glucose marqué par fluorescence est en corrélation avec l’absorption du glucose et pourrait être utilisé pour le dépistage à haut débit de l’absorption du glucose dans les organes excisés et les cultures cellulaires.

L’épuisement extracellulaire du glucose comme mesure indirecte de l’absorption du glucose dans les cellules et les tissus Ex Vivo

Apprenez à mesurer l'absorption de glucose stimulée par l'insuline dans des myotubes primaires humains cultivés in vitro. Cette technique quantifie les effets biologiques de l'insuline sur le métabolisme musculaire.

Mesure de l'absorption de glucose et réponse à la stimulation de l'insuline dans

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