Aiguilles personnalisées pour Microinjections dans le cerveau des rongeur

L'objectif général de cette méthodologie est d'affiner un protocole d'injection cérébrale utilisant une aiguille en quartz personnalisée et réutilisable, qui ne provoque aucun dommage tissulaire détectable et assure une administration fiable, même dans les régions profondes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la physiopathologie des maladies neurodégénératives et psychiatriques, ainsi que les effets de la thérapie génique et cellulaire par vecteurs viraux et greffes cellulaires. Le principal avantage est que ces aiguilles n'entraînent aucun dommage tissulaire détectable, ce qui garantit une administration fiable dans les régions profondes du cerveau.

Ils sont économiques car ils peuvent être nettoyés et réutilisés. Pour commencer cette procédure, nettoyez et stérilisez les capillaires en quartz en les plongeant pendant cinq minutes dans de l'eau distillée, puis pendant cinq minutes dans de l'éthanol à 99 %, suivis de cinq minutes dans de l'éther diéthylique.

Ensuite, laissez les capillaires sous la hotte pendant au moins une heure pour qu'ils sèchent complètement. Pendant ce temps, préparez les aiguilles longues et fines à l’aide d’un tireur laser. Puis placez les aiguilles dans une boîte de Pétri préalablement nettoyée avec de l’éthanol à 70 %.

Couvrez la boîte avec un film plastique en paraffine. Ensuite, coupez les capillaires au micro-dissecteur. Fixez fermement l'aiguille sur la table du microscope et positionnez sa pointe au centre de l'écran d'ordinateur.

Dans la barre de menu, cliquez sur l'icône du crayon et utilisez-la pour dessiner une marque indiquant l'endroit où l'aiguille doit être coupée. Dans la fonction située dans la barre latérale, sélectionnez le drapeau contenant le bouton Start Cut afin de permettre au laser de couper l'emplacement précédemment marqué. Si nécessaire, coupez les trous latéraux en dessinant une marque et en répétant les procédures de découpe sans repositionner l'aiguille.

Après avoir coupé l'aiguille, reliez-la à une pompe à vide au moyen d'un tube en plastique. Ensuite, mettez la pompe en marche et réglez manuellement le débit d'écoulement à trois microlitres par minute. Aspirez ensuite l'éthanol à 99 %, puis l'eau distillée afin d'éliminer les impuretés dues à la découpe.

Ensuite, aspirez de nouveau l’éthanol à 99 % pour faciliter le séchage. Puis, conservez les aiguilles dans une boîte de Pétri correctement couverte jusqu’au jour de la chirurgie. Pour réutiliser les aiguilles, à la fin de l’expérience, nettoyez-les avec des détergents appropriés et de l’éthanol à 70 % afin d’éliminer la solution injectée et tout résidu tissulaire éventuel.

Si nécessaire, ces aiguilles peuvent même être bouillies dans des flacons en verre dédiés remplis d'eau distillée. Dans cette étape, sélectionnez le menu des paramètres pour étalonner la pompe en fonction du diamètre par volume de la seringue de microinjection. Et réglez le débit à 0,3 microlitre par minute.

Ensuite, remplir une seringue de 10 millilitres avec de l'eau stérile. Puis s'en servir pour remplir la seringue de microinjection et les pièces du kit d'assemblage pour la pompe de microinjection manuelle. Après cela, connecter l'aiguille au kit de la pompe de microinjection manuelle.

Déconnectez la seringue de 10 millilitres de la seringue de microinjection tout en poussant lentement le piston, afin de laisser une goutte d'eau au sommet de la seringue de microinjection. Ensuite, insérez le piston dans la seringue de microinjection. Connectez maintenant la seringue de microinjection à la pompe et réglez le débit à 0,3 microlitre par minute.

Ensuite, réglez le débit à 0,1 microlitre par minute et commencez la procédure chirurgicale. Pour réaliser l'intervention, rasez la tête de l'animal et nettoyez-la avec un tampon d'alcool. Puis, positionnez le rat dans le cadre stéréotaxique.

Effectuez une incision longitudinale sur le crâne à l’aide d’un scalpel stérilisé. Soyez délicat pour éviter un saignement excessif. Ensuite, ouvrez le cuir chevelu à l’aide d’une spatule plate et appliquez des pinces chirurgicales sur les lambeaux de peau pour les maintenir ouverts.

Retirez très délicatement le périoste afin d'exposer la bregme et la zone du crâne par laquelle l'aiguille sera insérée. Ensuite, fixez le bras sur le cadre stéréotaxique et positionnez la pointe de l'aiguille juste au-dessus de la bregme, en prenant soin de ne pas casser sa pointe. Notez les coordonnées antéropostérieure et médio-latérale de la bregme, puis déplacez l'aiguille jusqu'aux coordonnées souhaitées.

Ensuite, abaissez l'aiguille jusqu'à ce que sa pointe touche presque le crâne, en marquant l'emplacement du perçage après avoir légèrement relevé le bras stéréotaxique. Percez le crâne à l'emplacement marqué, en prenant soin de ne pas endommager les méninges ni le cerveau. Puis, découpez un petit morceau de film en paraffine plastique et placez-le sur le crâne.

À l’aide de la pipette de 10 microlitres, déposez une goutte de la solution sur le film plastique en paraffine. Arrêtez la pompe, retirez légèrement le poussoir de la pompe et créez une petite bulle d’air dans le capillaire en tirant doucement sur le piston de la seringue de microinjection. Abaissez la pointe de l’aiguille jusqu’à ce qu’elle atteigne la goutte.

Prélèvez l'échantillon en tirant très lentement le piston de la seringue de microinjection, en évitant la formation de bulles. Remettez en place le poussoir de la pompe en contact avec le piston et mettez la pompe en marche à un débit de 0,3 microlitre par minute. Attendez ensuite la formation d'une goutte avant de passer à l'étape suivante.

Ensuite, réduisez le débit à 0,1 microlitre par minute. Incisez la dure-mère à l’aide d’une aiguille en acier inoxydable à bout biseauté et abaissez lentement l’aiguille pour pénétrer le tissu cérébral. Lorsque la position souhaitée est atteinte, descendez de 0,1 millimètre supplémentaire, puis arrêtez la pompe.

Relevez le bras stéréostatique de 0,1 millimètre et remettez en marche la pompe à 0,3 microlitre par minute. Ensuite, déclenchez le chronomètre et l'injection. Surveillez le déplacement de la bulle pendant l'injection.

À la fin, arrêtez la pompe et attendez cinq minutes avant de retirer lentement l'aiguille. Lorsque l'aiguille en quartz est complètement extraite, remettez la pompe en marche et vérifiez la formation d'une goutte à l'extrémité de l'aiguille. Ensuite, scellez l'ouverture à la surface du crâne avec de la cire osseuse.

Retirez les pinces d'homéostasie et sutures le cuir chevelu. Appliquez une crème antibiotique sur la zone entourant la plaie et remettez l'animal dans sa cage d'origine. Ce sont les sections coronales de huit micromètres des cerveaux de rat au niveau du striatum.

Cette image montre les lésions provoquées par l'injection de deux microlitres de ACSF, à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable de calibre 26 à extrémité émoussée. En revanche, le striatum injecté avec une aiguille en quartz n'a montré aucune lésion détectable. Ces autres images montrent les lésions induites par les deux aiguilles au niveau de l'hippocampe dorsal.

Mais l'aiguille en quartz n'a produit aucun dommage détectable. Les injections réussies avec les deux aiguilles ont été confirmées par la distribution du bleu de trypan. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures, si elle est effectuée correctement.

Après avoir suivi ces procédures, toutes les interventions supplémentaires nécessaires, comme des chirurgies additionnelles, peuvent être réalisées afin de répondre à différentes questions, telles que l'effet induit par un médicament. Grâce à ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer l'effet des toxines et des médicaments, et plus récemment, des produits de thérapie génique et cellulaire dans des modèles animaux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer des micro-injections dans des régions cérébrales profondes sans lésions détectables, en utilisant des aiguilles en quartz personnalisées.

N'oubliez pas que l'utilisation de réactifs et/ou de pathogènes découpés au laser peut être extrêmement dangereuse. Des précautions telles que les procédures de sécurité liées au laser et l'équipement de protection individuelle doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.