Name: La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez la livraison sous-piale d'AAV9 pour une expression transgénique spinale puissante chez la souris adulte. Cette technique avance la recherche sur les maladies neurodégénératives de la moelle épinière.

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Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation SANPORC et ALSA (Martin Marsala); Le programme national de durabilité, numéro de projet LO1609 (Ministère tchèque de l&#39;éducation, de la jeunesse et des sports); Et RVO: 67985904 (Stefan Juhas et Jana Juhasova).

Ces études ont été réalisées dans le cadre d&#39;un protocole approuvé par le comité institutionnel pour les soins et l&#39;utilisation des animaux de l&#39;Université de Californie, à San Diego, et étaient conformes à l&#39;Association pour l&#39;évaluation des directives sur les soins de l&#39;animal de laboratoire à des fins animales. Toutes les études ont été effectuées de manière à minimiser la taille du groupe et la souffrance des animaux. 1. Préparation générale des animaux et de la chirurgie <ol><li> Avant de commencer la procédure chirurgicale, décongeler le virus (AAV9-UBI-GFP, 5 μl d&#39;aliquotes) 8 . Préparez une solution à 5% de dextrane (10 000 MW) en mélangeant de la poudre de dextrane dans de l&#39;eau distillée. Mélangez la solution de virus avec une solution de dextrane à 1% 1: 1 jusqu&#39;à une concentration finale en dextrane de 2,5%. <ol><li> Stocker la solution de virus sur de la glace (4 ° C). </li></ol></li><li> Utiliser des souris adultes C57BL / 6J (hommes et femmes, 20 à 30 g). Anesthésier les souris en utilisant 5% d&#39;isoflurane (en O 2 , 1 L / min) et les maintenir à 2-3% d&#39;isoflurane inhalé (en O 2 , 1 L / min) par le cône du nez pendant la chirurgie, selon le taux de respiration et la réponse au pincement des pattes. </li><li> Raser le dos des animaux avec des tondeuses à raser et nettoyer la peau avec 2% de chlorhexidine. </li><li> Dans les études de récupération chronique, suivre une technique stérile stricte. </li><li> Si des injections subpiales lombaires doivent être effectuées, couper la peau en recouvrant les vertèbres Th8-L1 avec un scalpel et détacher le muscle paravertébral des vertèbres rachidiennes Th10-12 à l&#39;aide de ciseaux. <ol><li> Monter l&#39;animal dans un cadre stéréotaxique standard en utilisant des pinces de la colonne vertébrale de la souris. </li><li> Raser les deux côtés de la lame de la vertèbre Th10-12 à l&#39;aide d&#39;une perceuse dentaire (foret: 0,9 mm, vitesse: 20 000 tr / min) jusqu&#39;à ce que les fissures apparaissent. </li><li> Enlevez les fragments d&#39;os craqués avec une pince et exposez la surface dorsale de la moelle épinière. </li><li> Couper l&#39;ouverture d&#39;environ 1 cm à l&#39;aide d&#39;une aiguille en acier inoxydable 30 G et d&#39;une pince. </li></ol></li><li><sTrong&gt; Si des injections subpiennes cervicales doivent être effectuées, inciser la peau du cou dorsal 1,5-2 cm à l&#39;aide de ciseaux et exposer les segments C1-C2. <ol><li> Retirez la membrane atlanto-occipitale de la cisterna magna à l&#39;aide d&#39;une aiguille en acier inoxydable 23G et d&#39;une pince. </li><li> Nettoyer le site d&#39;incision de tout débris tissulaire et osseux à l&#39;aide de coton-tige. </li><li> Couper l&#39;estrat d&#39;environ 2-3 mm à l&#39;aide d&#39;une aiguille en acier inoxydable 30 G et d&#39;une pince. </li></ol></li></ol> 2. Ouverture de la Membrane Pial et insertion de l&#39;aiguille Subpial pour livraison AAV9 <ol><li> Montez l&#39;aiguille pénétrante pia de 34 G dans le bras Z d&#39;un manipulateur XYZ à l&#39;aide d&#39;un support capillaire en verre ( Figure 1A et B ). REMARQUE: Pour fabriquer l&#39;aiguille pia-pénétrante, l&#39;extrémité chanfreinée originale de l&#39;aiguille 34G est aiguisée à l&#39;aide d&#39;un biseau capillaire en verre avec une plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) et un angle de meulage de15 - 20 °. La pointe de l&#39;aiguille (1 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite doucement pliée à environ 90 ° ( Figure 1B , insert gauche). </li><li> En utilisant une portée de dissection chirurgicale, réglée à un grossissement 8-10 X, pénétrer la pia avec l&#39;aiguille pia-pénétrant d&#39;environ 1 mm ( Figure 1C ) en utilisant le bras X. <ol><li> Garder l&#39;angle de l&#39;aiguille pénétrante sur la surface du tissu à 5-10 °. </li></ol></li><li> Après l&#39;ouverture de la pia, retirez l&#39;aiguille pia-pénétrante à l&#39;horizontale de l&#39;espace sous-espace ( Figure 1 D) à l&#39;aide du bras X. REMARQUE: Rappelez-vous le site pénétré par un repère, tel qu&#39;un vaisseau sanguin. </li><li> Chargez une aiguille d&#39;injection 36G émoussée avec le virus AAV9-UBI-GFP en utilisant une micro-jambe de 50 μL reliée à l&#39;aiguille d&#39;injection avec des tubes PE-10 ou PE-20. </li><li> Montez l&#39;aiguille dans le bras Z d&#39;un deuxième manipulateur XYZ ( Figure 1A </stroNg&gt; et B ) à l&#39;aide d&#39;un support capillaire en verre ( Figure 1B , insert droit). REMARQUE: Pour fabriquer l&#39;aiguille d&#39;injection subafficelle AAV9, la pointe émoussée d&#39;une aiguille 36 G est polie à l&#39;aide d&#39;un biseau capillaire en verre avec plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) pour enlever les bords tranchants. La pointe de l&#39;aiguille (2-3 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite pliée doucement à environ 90 °. Les aiguilles d&#39;injection pia-pénétrantes et subpériales sont insérées dans un tube en acier inoxydable esclave 20G de 2 cm de long (10 mm de l&#39;extrémité de l&#39;aiguille) et collées avec de l&#39;époxy. L&#39;utilisation d&#39;un tube de 20 G (0,91 mm de diamètre) est requise pour une fixation sécurisée au support capillaire en verre. </li><li> En manipulant les bras X, Y et Z du deuxième manipulateur, positionnez l&#39;extrémité de l&#39;aiguille d&#39;injection AAV9 dans le site pia-pénétré, puis avancez-le environ 2-3 mm dans l&#39;espace sous-espace à travers l&#39;ouverture précédente de la membrane par le biais de la X-bras( Figure 1E et F ). NOTE: 1) L&#39;AAV9-UBI-GFP est préparé selon les protocoles 9 , 10 précédemment rapportés, et les titres finaux sont ajustés à 1,2 x 10 13 copies du génome par ml (gc / mL). 2) Il n&#39;est pas nécessaire de marquer le site de l&#39;ouverture du pial car il est facilement identifiable ( Figure 1D ). </li><li> Injecter l&#39;AAV9-UBI-GFP (1.5, 3 ou 5 μL) dans l&#39;espace sub-dépistage à l&#39;aide d&#39;une micro-jambage de 50 μL (voir tableau 1 pour les groupes expérimentaux). </li><li> Retirez l&#39;aiguille d&#39;injection de l&#39;espace sous-espace après l&#39;achèvement de l&#39;injection AAV9-UBI-GFP. </li><li> Fermez le muscle et la peau à l&#39;aide de sutures de monofilaments 4.0 et de clips chirurgicaux. REMARQUE: Il n&#39;est pas nécessaire de sceller la vertèbre ouverte. </li><li> Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant. </li><li> Pour le contrôle de la douleur injecter Buprénorphine 0,05 mg / kg / sc toutes les 12 h pour2-3 jours après la chirurgie. </li></ol> 3. La fixation par perfusion, la cryoprotection tissulaire et la coloration par immunofluorescence <ol><li> A un point de temps prédéterminé après les injections subatiles d&#39;AAV9, anesthésier profondément les souris avec une solution d&#39;euthanasie (voir la Table des matériaux , 0,3 mL) et les perfuser transcardialement avec 20 ml de solution salée héparinée suivie de 20 ml de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS. </li><li> Dissectionnez les cordes et le cerveau de la moelle épinière à l&#39;aide d&#39;un rongeur osseux et postez-les dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Cryoproteger les cordes épineuses et le cerveau avec 30% de saccharose dans du PBS pendant au moins 5 à 7 jours. </li><li> Couper les sections congelées coronales, transversales ou longitudinales / horizontales (30 μm d&#39;épaisseur) sur un cryostat et les stocker dans du PBS à 4 ° C. </li></ol> 4. Immunofluorescence Coloration des sections de la moelle épinière et du cerveau (voir la table des matières) <ol><li> Incuber les sections flottantes en primaireY pendant toute la nuit. </li><li> Après incubation avec des anticorps primaires, laver les sections trois fois dans du PBS et incuber avec des anticorps anti-lapin anti-lapin, anti-poulet et anti-chèvre anti-poulet et anti-poulet conjugués à la fluorescence. </li><li> Montez les sections sur les lames de microscopie, séchez-les à température ambiante et recouvrez-les avec un milieu anti-décoloré. </li><li> Capturez des images à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence à épifluorescence (objectifs: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 et 63X, NA-1.4). </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+SMA%3A+a+dose-response+study+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+fidelity+of+intrathecal+delivery+of+self-complementary+AAV9-survival+motor+neuron+1+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy.</a> Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).</li>
<li>Bell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+transduction+after+intracisternal+delivery+of+AAV9+in+a+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).</li>
<li>Miyanohara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+spinal+parenchymal+AAV9-mediated+gene+delivery+by+subpial+injection+in+adult+rats+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+knockdown+in+rat+dorsal+root+ganglia+mediated+by+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+5+following+intrathecal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 32581(2012).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
</ol>

Martin Marsala est cofondateur de Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, États-Unis).

L&#39;étude actuelle décrit une technique de délivrance de vecteur subpial (AAV9) chez des souris adultes. Comme cela a été démontré dans la vidéo qui l&#39;accompagne, cette approche et cette technique peuvent être utilisées efficacement, à condition que les instruments requis et l&#39;aiguille pia-penetrante et l&#39;aiguille d&#39;injection subpienne soient correctement fabriquées, conformément aux spécifications établies et testées. Variables techniques critiques dans la réalisat...

L&#39;utilisation de vecteurs d&#39;AAV pour traiter une variété de troubles neurodégénératifs de la moelle épinière et du SNC devient une plate-forme bien acceptée pour réguler efficacement ou faire taire l&#39;expression des gènes d&#39;intérêt. L&#39;une des principales limites à l&#39;utilisation plus efficace de cette technologie pour traiter les troubles du SNC et de la moelle épinière est la capacité limitée de délivrer un vecteur (s) d&#39;AAV au cerveau profond ou au parenchyme de la moelle épinière chez les mammifères adultes. Il a été démontré, par exemple, que la distribution systémique d&#39;AAV9 chez les rongeurs adultes, les chats ou les primates non humains n&#39;est que modérément efficace pour induire l&#39;expression du transgène dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière 1 , 2 , 3 . La délivrance intrathécale plus efficace des vecteurs AAV9 a également montré qu&#39;il ne conduisait qu&#39;à une expression limitée du transgène dans des pools de neurones anatomiquement définis. Plus précisément, ce sont des démonsQue l&#39;administration d&#39;AAV9 intracellulaire cisternal ou lumbo-sacré chez des primates, des porcs ou des rongeurs non humains conduit à un niveau élevé d&#39;expression du transgène dans les motoneurones α-spinales et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale segmentaire. Cependant, une expression minimale ou nulle des interneurones de la colonne vertébrale ou des axones ascendants ou descendants dans la matière blanche est vue 4 , 5 , 6 , 7 . Collectivement, ces données montrent qu&#39;une barrière biologique-anatomique hautement efficace existe, ce qui empêche la diffusion d&#39;AAV délivré par voie intrathécale dans un parenchyme rachidien plus profond. Dans une étude antérieure portant sur des rats adultes et des porcs, une nouvelle technique de transmission de vecteur subfaire a été développée 8 . À l&#39;aide de cette approche, une expression du transgène hautement efficace et multi-segmentaire a été démontrée après une administration de l&#39;AAV9 subpial à un seul bolus. Une expression intensive des GFP a été constamment observéeDans les neurones, les cellules gliales et les axones descendants / ascendants à travers les segments de la colonne vertébrale injectés. Cette étude a démontré pour la première fois que la pia-mère représente la principale barrière limitant la diffusion efficace d&#39;AAV9 dans le parenchyme rachidien de l&#39;espace intrathécal. Bien que cette technique développée précédemment et son dispositif d&#39;injection subpial soit relativement facile à utiliser chez les grands rongeurs (comme les rats) ou les cochons adultes, le système ne convient pas aux petits animaux, comme les souris adultes. En raison du nombre élevé de modèles de souris transgéniques disponibles d&#39;une variété de troubles neurodégénératifs, il existe un besoin évident de développement d&#39;une technique de délivrance de vecteur spinale parenchymateuse efficace chez la souris. La disponibilité d&#39;une telle technique permettrait d&#39;étudier l&#39;effet d&#39;un inhibition spécifique des gènes ( p. Ex., En utilisant l&#39;ARNm) ou une régulation positive en utilisant des cellules non spécifiques ( p. Ex. Cytomégalovirus-CMV ou ubiquitine) ou spécifiques de cellules ( p. Ex ., Synapsine ou gliale Acide fibrillaireProtéines (GFAP)) pendant le développement post-natal tôt ou dans des conditions malades. En conséquence, dans la présente étude, nous avons développé et validé un système miniature de distribution de vecteurs subtiles qui peut être utilisé efficacement chez la souris adulte. De même, comme dans les études antérieures sur le rat et le porc, ce travail démontre une expression puissante du transgène dans tout le parenchyme rachidien après une délivrance de l&#39;AAV9 subpial à bol unique chez la souris. La simplicité de cette approche, la très bonne tolérance des souris injectées à la transmission de l&#39;AAV9 subpériale et la forte puissance de l&#39;expression du transgène dans le parenchyme de la colonne vertébrale suggèrent que cette technique peut être mise en œuvre efficacement dans n&#39;importe quel milieu de laboratoire et utilisée dans des expériences ciblant l&#39;expression des gènes rachidiens.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J Souris</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Stéréotaxie standard de laboratoire pour souris</td><td>Appareil de Harvard</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>Adaptateur de colonne vertébrale de</td><td>souris Appareil de Harvard</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur XYZ</td><td>Stoelting</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>Pompe à perfusion manuelle</td><td>Stoelting</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille nanofill biseautée 34G</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G Aiguille Nanofill émoussée</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso, Isoflurane</td><td>MWI Approvisionnement Vétérinaire</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Solution de Chlorhexidine</td><td>MWI Approvisionnement Vétérinaire 501027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20G Aiguille en acier inoxydable</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille en acier inoxydable 23G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Aiguille en acier inoxydable 30G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>Biseauteur capillaire en verre&nbsp ;</td><td>Narishige International</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à lames Superfrost</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu ; L Microseringue&nbsp ;</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-20 Tubing</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-10</td><td>Tubing Becton, Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0 monofilament</td><td>suture VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Beveller&nbsp ;</td><td>Narishige</td><td>Pipet Micro Grinder EG-40&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>5 min Époxy (époxy transparent)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’euthanasie</td><td>MWI Approvisionnement vétérinaire</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>Héparine Inj 1 000 U/mL</td><td>Approvisionnement vétérinaire MWI</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps</td> <td>anti NeuNAnticorps polyclonal primaire de lapin EMD-Millipore</td><td>ABN78</td>, anticorps <td></td></tr><tr><td>anti-choline acétyltransférase (CHAT)</td> 1:1000 Anticorps polyclonal primaire <td>de chèvre EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>, anticorps anti-GFP 1:100</td></tr><tr><td></td> Anticorps <td>polyclonal primaire de poulet</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td>,</tr><tr><td>anticorps secondaire anti-IgG (H+L) d’âne anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>Anticorps secondaire, 1:1000</td></tr><tr><td> Anticorps secondaire IgG anti-Rabbit Anti-Rabbit d’âne, Anticorps secondaire Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td>, Anticorps secondaire <td>IgY anti-Poulet 1:1000</td></tr>, <tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td><td>Anticorps secondaire,</td></tr><tr><td>IgG H& L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>AB150131</td><td>Anticorps secondaire, microscope à lames 1:1000</td></tr><tr><td>Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD Laboratoire</td><td></td><td></td> central de vecteurs viraux</tr></tbody></table>

la livraison de vecteur 9 (aav9) associée au virus adeno-associé subpial (aav9) chez les souris adultes

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Le développement réussi d&#39;une technique de délivrance de vecteur de virus adéno-associé subpial 9 (AAV9) chez des rats et des cochons adultes a été signalé précédemment. En utilisant des cathéters en polyéthylène (PE-10 ou PE-5) placés sous le point de vue de l&#39;AAV9, on a démontré une expression efficace du transgène à travers le parenchyme rachidien (matière blanche et grise) dans les segments de la colonne vertébrale injectés subtilement. En raison de la vaste gamme de modèles de souris transgéniques de maladies neurodégénératives, il existe un fort désir de développer une technique de transfert de vecteur cible ciblée du système nerveux central puissant (SIC) chez des souris adultes. En conséquence, la présente étude décrit le développement d&#39;un dispositif de délivrance de vecteur sous-viral de la colonne vertébrale et d&#39;une technique permettant une délivrance sûre et efficace d&#39;AAV9 de la colonne vertébrale chez des souris adultes C57BL / 6J. Chez les souris épieillées et anesthésiées, la pia-mère (cervical 1 et le segment segmentaire lombaire 1-2) a été incisé avec une aiguille pointue de 34 G en utilisant un manipulateur XYZ. Une deuxième XYZ maLe nipulateur a ensuite été utilisé pour avancer une aiguille 36G émoussée dans l&#39;espace sous-espace lombaire et / ou cervical. Le vecteur AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copies du génome (gc)) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) a ensuite été injecté subtilement. Après les injections, la fonction neurologique (moteur et sensorielle) a été évaluée périodiquement, et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après la délivrance d&#39;AAV9 avec du paraformaldéhyde à 4%. L&#39;analyse des sections de la moelle épinière horizontale ou transversale a montré une expression du transgène dans toute la moelle épinière, tant en matière grise que blanche. De plus, une expression intense de GFP récidiviste a été observée dans les axones moteurs et les neurones descendants dans le cortex moteur, le noyau nucléaire et la formatio reticularis. Aucun dysfonctionnement neurologique n&#39;a été noté chez aucun animal. Ces données montrent que la technique de délivrance du vecteur sous-viral peut être utilisée avec succès chez la souris adulte, sans causer de lésions de la moelle épinière liée à la procédure, et est associée à un transgène très efficacePendant tout le neuraxis rachidien.

<html> Expression transgénique efficace dans les segments Subpially AAV9-injectés: L&#39;analyse de l&#39;expression du transgène (GFP) dans les sections de la moelle épinière à 14 jours après l&#39;accouchement de l&#39;AAV9 a montré une expression de la GFP dépendante de la dose AAV9 tout au long du parenchyme de la colonne vertébrale. Tout d&#39;abord, deux injections bilatérales de 3 μL d&#39;AAV9-UBI-GFP injectées dans l&#39;espace subpial lombaire supérieur o...

L&#39;objectif de la présente étude était de développer et de valider la puissance et la sécurité de la délivrance de gènes médiés par le virus 9 associé à l&#39;adéno-lésion spinale (AAV9) en utilisant une nouvelle technique de délivrance de gène subpial chez des souris adultes.

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

L'objectif général de cette technique de délivrance sous-piale d'AAV9 est d'obtenir une expression puissante du transgène dans le parenchyme médullaire sur toute la longueur de la moelle épinière chez la souris adulte. Cette méthode peut faciliter les études visant à moduler l'expression génique médullaire et contribuer à la compréhension des mécanismes de plusieurs troubles neurodégénératifs médullaires, notamment la sclérose latérale amyotrophique, les lésions médullaires traumatiques ou la douleur chronique. Le principal avantage de cette technique réside dans l'obtention d'une expression transgénique fortement efficace dans les substances grise et blanche de la moelle épinière, sur plusieurs segments médullaires adjacents au segment injecté avec l'AAV9 sous-pial.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l'étape d'ouverture de la dure-mère et le positionnement de l'aiguille sous-piale sont difficiles à apprendre sans démonstration visuelle. La procédure sera démontrée par Takahiro Tadokoro, chercheur postdoctoral dans notre laboratoire. Commencez par anesthésier correctement l'animal pour la chirurgie ; l'isoflurane est utilisé ici.Vérifiez l'absence d'une r

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Dans cette vidéo, nous démontrons l’administration de gènes basés sur le virus associé à l’adéno-adéno-recombinant chez le petit de souris. Cette méthode aide à étudier l’expression des gènes dans les cellules ciblées.

Administration de gènes basée sur un virus adénologique recombinant : une technique de livraison de transgènes et d’expression spécifique au cancer dans un modèle de rongeur

Source : Tadokoro, T., et al. Administration du vecteur du virus adéno-associé sous-pial 9 (AAV9) chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre une technique d’injection sous-piale pour l’administration de gènes à la moelle épinière chez la souris. La procédure consiste à exposer la dure-mère, à perforer la pie-mère et à injecter un virus adéno-associé recombinant (rAAV) portant un gène exprimant une protéine fluorescente dans l’espace sous-pial. Après l’injection et la...

Livraison de gènes sous-piaux dans la moelle épinière de souris pour évaluer l’expression des gènes

Source : Li, D., et al. Injection intrathécale directe de virus adéno-associés recombinants chez des souris adultes. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’injection intrathécale de virus adéno-associés (AAV) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) d’une souris éveillée, couvrant la préparation de la seringue, l’alignement de la colonne vertébrale et l’insertion précise de l’aiguille. Cette méthode valide l’administration ciblée de gènes, soutenant ainsi son potentiel pour les...

Administration intrathécale de virus dans un modèle murin pour le traitement de maladies du système nerveux central

Source :Pourshafie, N., et al. Administration systémique de microARN à l’aide d’un virus adéno-associé recombinant de sérotype 9 pour traiter les maladies neuromusculaires chez les rongeurs. J. Vis. Exp. (2018).Dans cette vidéo, une souris atteinte d’amyotrophie spinale et bulbaire ou atteinte de SBMA subit une injection dans la veine de la queue de vecteurs AAV (vecteurs adéno-associés) recombinants porteurs d’un plasmide codant pour un microARN thérapeutique. Le vecteur produit des microARN...

Injection de vecteurs adéno-associés recombinants dans un modèle murin d’atrophie musculaire spinale et bulbaire

Nous décrivons ici la livraison des micro-ARN, à l’aide d’un sérotype de virus adeno-associé recombinant 9 dans un modèle murin d’une maladie neuromusculaire. Une seule administration périphérique chez les souris a entraîné surexpression de miRNA soutenue dans les muscles et les neurones moteurs, fournissant l’occasion de l’étude miRNA fonction et thérapeutiques potentiels in vivo.

Délivrance systémique des micro-ARN, à l’aide de Recombinant Adeno-associated Virus sérotype 9 pour traiter des maladies neuromusculaires chez les rongeurs

Méthodes pour une livraison de gène à grande échelle du système nerveux central chez le rat sont couvertes. Dans cet exemple, le but consiste à mimer une maladie qui affecte l’ensemble de la moelle épinière. La transduction généralisée peut être utilisée pour fournir une protéine thérapeutique à la CNS d’une administration unique, périphérique.

Méthodes et conseils pour l’Administration intraveineuse de Virus Adeno-associé à des Rats et d’évaluation de la Transduction du système nerveux Central

Nous présentons une technique d’injection intrathécale directe à l’aide de chlorhydrate de lidocaïne 1 % dans une solution virale pour assurer une prestation efficace virus adeno-associé à de petits animaux et de mettre en place un système de notation pour prédire l’efficacité de la transduction du central système nerveux selon le degré de faiblesse transitoire induit par la lidocaïne.

Direct Injection intrathécale de Recombinant Adeno-associated virus chez la souris adulte

Nous décrivons ici une stratégie efficace et reproductible pour produire, titre et contrôle de la qualité des lots de vecteurs de virus adeno-associé. Il permet à l’utilisateur d’obtenir une préparation de vecteur avec haut-titre (≥1 x 1013 vecteur génomes/mL) et une grande pureté, prêt à être utilisé in vitro ou in vivo .

Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

Une intervention chirurgicale est décrite pour effectuer des injections dans la citerne lombaire du rat juvénile. Cette approche a été utilisée pour l’administration intrathécale de vecteurs de thérapie génique, mais on s’attend à ce qu’elle puisse être utilisée pour une variété de traitements, y compris les cellules et les médicaments.

Administration intrathécale de vecteurs chez des rats juvéniles par injection dans une citerne lombaire

Nous détaillons ici un protocole optimisé pour l’injection latérale de la veine caudale chez la souris afin d’administrer systématiquement le virus adéno-associé (AAV) chez les souris adultes. De plus, nous décrivons les protocoles des tests couramment utilisés pour évaluer la transduction des AAV.

Administration constante du virus adéno-associé par injection latérale dans la veine caudale chez des souris adultes

Ce rapport détaille la méthode d’injection localisée des vecteurs AAV via le bassinet du rein pour un transfert de gènes efficace et sûr dans le rein de souris.

Administration efficace et sûre de gènes dans le rein de souris par injection rétrograde lente de vecteurs viraux adéno-associés

Découvrez la livraison sous-piale d'AAV9 pour une expression transgénique spinale puissante chez la souris adulte. Cette technique avance la recherche sur les maladies neurodégénératives de la moelle épinière.

La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

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