Site d'intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les sites d’intégration des vecteurs rétroviraux dans le génome de l’hôte et de quantifier les fréquences relatives des populations de cellules clonales partageant chacune le même site d’intégration. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la thérapie génique rétrovirale, telles que la partie du vecteur du génome de l’hôte qui s’est intégrée, comment une cellule génétiquement modifiée se repeuplera après la greffe et en quoi elles sont fonctionnellement différentes. Le principal avantage de cette technique est que les séquences de sites de rétro-intégration peuvent être analysées avec une précision et une sensibilité plus élevées en séquençant simultanément les jonctions d’ADN de l’hôte du vecteur en amont et en aval.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’innocuité des vecteurs et des cellules génétiquement modifiées dans les études de thérapie génique, elle peut également être appliquée à d’autres études de biologie fondamentale pour étudier le comportement cellulaire individuel in vivo. La première étape de cette procédure consiste à déterminer la concentration d’ADN et le rapport d’absorbance à 260 et 280 nanomètres de l’ADN génomique à analyser. Après cela, diluez un à deux microgrammes de l’ADN génomique de l’échantillon à un volume final de 170 microlitres de solution d’ADN génomique en utilisant de l’eau sans nucléases.

Préparez une réaction PCR de 200 microlitres en mélangeant les éléments suivants dans un tube de microcentrifugation : 2,5 microlitres chacun d’amorces de biotine spécifiques du VIH-1, ou un total de 10 microlitres pour quatre amorces spécifiques du lentivirus, 20 microlitres de tampon d’ADN polymérase thermostable 10X, quatre microlitres de dNTP de 10 millimolaires, trois microlitres d’ADN polymérase thermostable et 163 microlitres d’ADN génomique. Divisez la solution également dans quatre tubes PCR et effectuez un seul cycle d’extension dans les conditions suivantes.

94 degrés Celsius pendant 5 minutes, 56 degrés Celsius pendant 3 minutes, 72 degrés Celsius pendant 5 minutes et 4 degrés C pour le stockage. Regroupez les quatre réactions de PCR dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. Suivez la procédure du fabricant d’un kit de purification PCR et éluez avec 50 microlitres de tampon d’élution.

Préparez-vous à une digestion de 100 microlitres en ajoutant les éléments suivants dans un tube de microcentrifugation : 50 microlitres d’ADN, 10 microlitres de tampon A 10X, deux microlitres d’enzyme RSAI et 38 microlitres d’eau sans nucléase. Incuber à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur pendant une heure.

Ensuite, ajoutez un microlitre d’enzyme CviQI à la réaction et incubez à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lorsque la digestion du RSAI et du CviQI est terminée, procédez immédiatement à la fin brutale. Préparez un mélange de 4,5 microlitres contenant 2,5 microlitres d’ADN polymérase I, grand fragment, et 2 microlitres de 10 millimolaires de dNTP.

Transférez 1 microlitre du mélange dans l’échantillon d’ADN. Le volume total sera de 102 microlitres. Bien mélanger par vortex et incuber à 25 degrés Celsius pendant une heure.

Procéder immédiatement à la liaison des billes de streptavidine lorsque l’incubation est terminée. Préparez les billes de streptavidine en faisant brièvement tourbillonner la solution de billes et en transférant 50 microlitres dans un nouveau tube de microcentrifugation de deux millilitres. Retirez le surnageant à l’aide d’un support magnétique et lavez les grains avec 200 microlitres de solution de liaison.

Remettez les billes en suspension dans 100 microlitres de solution de liant et éloignez le tube du support magnétique. Transférez 100 microlitres de l’ADN de l’échantillon dans les 100 microlitres de solution de billes en suspension et mélangez soigneusement par pipetage pour éviter toute formation de mousse de la solution. Incuber le tube à température ambiante pendant 3 heures sur une roue rotative.

Utilisez le support magnétique pour capturer les perles et jeter le surnageant. Lavez les billes deux fois dans 400 microlitres de solution de lavage et deux fois dans 400 microlitres de tampon 1X T4 DNA ligase. Remettez les billes en suspension dans 200 microlitres de tampon 1X T4 DNA ligase et placez-les à l’écart du support magnétique.

La ligature doit être effectuée immédiatement après la fixation des billes de streptavidine. Préparez une solution de réaction de ligature de 400 microlitres en mélangeant ce qui suit dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres. 0,5 microlitre de l’agent de liaison de l’ADN, 10 microlitres de tampon d’ADN ligase 10X T4, 20 microlitres de tampon d’ADN ligase 5X T4, 5 microlitres d’ADN ligase T4, 164,5 microlitres d’eau sans nucléase et 200 microlitres de billes remises en suspension.

Placez le tube de réaction sur une roue rotative à température ambiante pendant 3 heures. Lavez les billes deux fois avec la solution de lavage et deux fois avec un tampon d’ADN polymérase thermostable 1X. Remettez les billes en suspension dans 50 microlitres de tampon PCR à ADN polymérase thermostable 1X et placez-les à l’écart du support magnétique.

Pour commencer cette procédure, préparez une réaction PCR de 200 microlitres en ajoutant ce qui suit aux billes remises en suspension : 10 microlitres d’une amorce 1L, 10 microlitres d’amorce 1R, 20 microlitres d’amorce Link1, 10 microlitres de tampon d’ADN polymérase thermostable 10X, quatre microlitres de 10 dNTP millimolaires, huit microlitres d’ADN polymérase thermostable et 88 microlitres d’eau sans nucléase. Aliquote le mélange réactionnel dans quatre tubes PCR et effectue la PCR dans les conditions suivantes.

94 degrés Celsius pendant 2 minutes, 25 cycles de 94 degrés Celsius pendant 20 secondes, 56 degrés Celsius pendant 25 secondes et 72 degrés Celsius pendant deux minutes, et une extension finale à 72 degrés Celsius pendant 5 minutes. Regroupez les quatre réactions de PCR dans un tube de microcentrifugation de 2 ml. Suivez la procédure du kit de purification PCR et éluez avec 50 microlitres de tampon d’élution.

Déterminez la concentration d’ADN et le rapport d’absorbance à 260 et 280 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre UV-visible. L’ADN peut maintenant être stocké à moins 20 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’étape suivante. Étant donné que les procédures pour les amplifications spécifiques à la jonction gauche et à la jonction droite sont identiques, à l’exception des amorces utilisées dans la PCR, seule l’amplification de la jonction gauche sera démontrée.

Préparez une réaction PCR de 50 microlitres en mélangeant les éléments suivants dans un tube PCR. Cinq microlitres d’ADN, cinq microlitres de 10 micromolaires d’amorce 2L, cinq microlitres de 10 micromolaires d’amorce Link2, 5 microlitres de tampon d’ADN polymérase thermostable 10X, un microlitre de 10 dNTP millimolaires, deux microlitres d’ADN polymérase thermostable et 27 microlitres d’eau sans nucléase. Effectuez la PCR avec les conditions suivantes.

94 degrés Celsius pendant 3 minutes, 8 à 15 cycles de 94 degrés Celsius pendant 20 secondes, 56 degrés Celsius pendant 25 secondes et 72 degrés Celsius pendant deux minutes, et une extension finale à 72 degrés Celsius pendant 5 minutes. Utilisez le kit de purification PCR pour purifier l’ADN et éluer avec 50 microlitres de tampon d’élution. Déterminez la concentration d’ADN et le rapport d’absorbance à 260 et 280 nanomètres.

La dernière étape de la génération de banques de séquences de jonctions gauche et droite consiste à analyser les variations de longueur de l’amplicon PCR en effectuant une électrophorèse capillaire. Ce résultat représentatif montre des longueurs variables d’amplicons PCR dans les sites d’intégration de vecteurs lentiviraux pour les jonctions hôtes du vecteur en amont et en aval. Le marqueur de taille d’ADN se trouve dans la voie M.

Après le séquençage des amplicons PCR, l’analyse de la séquence du site d’intégration informatique est effectuée à l’aide d’un script de programmation interne. Le test du site d’intégration bidirectionnelle génère différentes tailles d’amplicons PCR pour les jonctions hôtes vectorielles en amont et en aval, visualisées par électrophorèse capillaire. Une comparaison du pourcentage d’intégration dans les gènes Alu et L1 des répétitions de vecteurs lentiviraux dans des cellules de souris humanisées repeuplant des cellules au sein d’événements d’intégration aléatoires générés par silico a révélé que les sites d’intégration sont significativement enrichis en gènes.

Les fréquences de détection relatives des intégromes vecteurs ont été calculées en utilisant uniquement les comptages de séquences des jonctions de sites d’intégration générant des amplicons PCR inférieurs à 500 pb. Environ 77 % des vecteurs ont pu être analysés quantitativement par l’approche bidirectionnelle. Dans la stratégie de quantification clonale, nous supposons que chaque clone individuel partage le même intégrome vecteur.

Les fréquences relatives des jonctions gauche et droite sont combinées pour représenter les quantités relatives des populations clonales, ou QVI. Ce schéma de couleurs montre les fréquences relatives de 44 clones QVI dans les cellules de repeuplement de souris humanisées. Sur la base d’une analyse d’intégration aléatoire in silico de 10 000, une surestimation de 1,25 fois des fréquences clonales est attendue lors de l’utilisation d’enzymes de motif GTAC, et une surestimation de 2,56 est attendue lors de l’utilisation d’une enzyme de motif TCGA.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être divisée en plusieurs parties et complétée en deux jours, si elle est correctement exécutée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les étapes de PCR sont extrêmement sensibles et que des précautions doivent être prises pour éviter toute contamination. Cette technique a ouvert la voie à l’examen de l’innocuité des vecteurs rétroviraux thérapeutiques et à l’exploration des modèles de repeuplement à long terme des clones de cellules souches hémotopoïétiques après une greffe chez les macaques rhésus.