Site d'intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

L’objectif global de cette procédure est d’identifier les sites d’intégration des vecteurs rétroviraux dans le génome de l’hôte et de quantifier les fréquences relatives des populations de cellules clonales partageant chacune le même site d’intégration. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la thérapie génique rétrovirale, telles que la partie du vecteur du génome de l’hôte qui s’est intégrée, comment une cellule génétiquement modifiée se repeuplera après la greffe et en quoi elles sont fonctionnellement différentes. Le principal avantage de cette technique est que les séquences de sites de rétro-intégration peuvent être analysées avec une précision et une sensibilité plus élevées en séquençant simultanément les jonctions d’ADN de l’hôte du vecteur en amont et en aval.

Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de l’innocuité des vecteurs et des cellules génétiquement modifiées dans les études de thérapie génique, elle peut également être appliquée à d’autres études de biologie fondamentale pour étudier le comportement cellulaire individuel in vivo. La première étape de cette procédure consiste à déterminer la concentration d’ADN et le rapport d’absorbance à 260 et 280 nanomètres de l’ADN génomique à analyser. Après cela, diluez un à deux microgrammes de l’ADN génomique de l’échantillon à un volume final de 170 microlitres de solution d’ADN génomique en utilisant de l’eau sans nucléases.