Expansion et adipogénèse Induction de progéniteurs d'adipocytes à partir de tissus adipeux périvasculaires isolés par tri magnétique de cellules activées

Les objectifs globaux de ces protocoles d’isolement et de différenciation sont d’obtenir des cellules progénitrices adipocytaires à partir de tissus adipeux périvasculaires et d’induire leur différenciation en adipocytes matures. Cette méthode permet d’analyser des populations spécifiques et définies de cellules progénitrices adipocytaires à partir de tissu adipeux périvasculaire, avec un impact minimal sur leur morphologie, leur viabilité et leur potentiel de prolifération et de différenciation. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une isolation accrue des cellules présentatrices d’antigènes par gramme de tissu adipeux, par rapport au tri cellulaire activé par fluorescence.

Après avoir confirmé une absence de réponse au pincement de l’orteil, faites une incision médiane verticale le long du sternum jusqu’à la zone périnéale du rat, pour accéder à la cavité abdominale. Exposez l’artère mésentérique supérieure, les petits vaisseaux de résistance mésentériques et l’aorte thoracique, et coupez toutes les connexions au mésentère et à l’aorte. Collectez le tissu adipeux gonadique et transférez les coussinets adipeux isolés dans un nouveau récipient de tampon de bicarbonate de Krebs-Ringer, ou solution KRBB, complétée par 10 tas millimolaires.

Transférez les récipients dans une boîte de Pétri contenant une solution de KRBB et placez la boîte sous un microscope à dissection. Retirer le tissu adipeux périvasculaire des petits vaisseaux de résistance mésentérique et de l’aorte. Dans une cagoule de biosécurité, transférez environ 50 milligrammes de tissu dans un tube de 1,7 millilitre contenant 1 millilitre de solution de collagénase de type I, et coupez le tissu en morceaux de 1 à 3 millimètres.

Il est important de hacher correctement le tissu adipeux pour permettre à la collagénase de s’infiltrer complètement dans le tissu conjonctif. Incuber les fragments à 37 degrés Celsius en secouant pendant 1 heure. Ensuite, filtrez séquentiellement le matériau digéré à travers des crépines individuelles de 100 et 40 microns dans un tube de 50 millilitres.

Recueillir le filtrat obtenu par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de lyse érythrocytaire. Transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube Microfuge de 1,7 millilitre pour une incubation de 5 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Ensuite, collectez les cellules de la fraction vasculaire stromale avec une autre centrifugation et remettez la pastille en suspension dans le milieu basal de la fraction vasculaire stromale pour le comptage.

Pour isoler les cellules progénitrices adipocytaires par tri cellulaire activé magnétiquement, collectez les cellules par centrifugation et remettez en suspension la pastille dans un tampon de blocage de tri cellulaire activé magnétiquement à une concentration de 1 fois 10 à 6 cellules par millilitre pour une incubation de 20 minutes à 4 degrés Celsius. Il est essentiel que toutes les étapes de l’isolement se fassent à 4 degrés Celsius, et non sur de la glace. Ensuite, incubez les cellules avec 5 microlitres d’anti-CD34 de souris conjuguées à la FITC pendant 30 minutes.

Collecter les cellules par centrifugation. Ensuite, incubez les cellules avec 4 microlitres de microbilles anti-FITC dans 96 microlitres de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement pendant 5 minutes dans l’obscurité. Pendant l’incubation des cellules, placez une colonne à plusieurs types dans le séparateur magnétique avec un tube de déchets de 5 millilitres sous la colonne.

Rincez la colonne avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement et jetez l’effluent et le tube de déchets. Ensuite, placez un nouveau tube sous la colonne et chargez les cellules sur le dessus de la colonne, en recueillant les cellules négatives CD34 non étiquetées dans le nouveau tube de collecte. Lorsque toutes les cellules sont passées par le haut de la colonne, lavez la colonne 3 fois avec 500 microlitres de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement dégazé, en continuant à regrouper l’éluat dans le tube de collecte.

Après le dernier lavage, transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte et utilisez le piston de la colonne pour rincer 1 millilitre de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement à travers la colonne dans le tube, afin de collecter les cellules CD34 positives. Recueillir les cellules progénitrices adipocytaires par centrifugation. Ensuite, incubez la fraction CD34 positive dans 10 microlitres de récepteur alpha du facteur de croissance antiplaquettaire de lapin pendant 30 minutes.

À la fin de l’incubation, centrifugez à nouveau les cellules et incubez la pastille dans 4 microlitres de microbilles IgG anti-lapin dans 96 microlitres de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement pour l’isolement par billes magnétiques des cellules positives du récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes, comme cela vient d’être démontré. Pour cultiver les cellules progénitrices adipocytaires positives du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes CD34 positives, ensemencez les cellules dans des plaques de culture tissulaire individuelles à 6 puits dans un milieu basal et placez les plaques dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après 3 passages en série, ensemencez les cellules dans des plaques de culture tissulaire noires à 96 puits à 1 fois 10 à 2 cellules par puits, et évaluez leur prolifération à 8, 24, 48 et 96 heures à 5 fois 10 à la 4e cellule par puits, dans des plaques de test à 24 puits, selon les protocoles standard de test de prolifération.

Pour induire l’adipogenèse, lorsque la culture cellulaire progénitrice adipocytaire atteint la confluence, nourrissez les cellules avec un milieu basal progéniteur adipocytaire pendant 48 heures, puis traitez les cultures avec la protéine morphogénique osseuse 4 pendant 48 heures supplémentaires. Le troisième jour, remplacer le milieu par un milieu d’induction de cellules progénitrices adipocytaires, sans IBMX ni examétasone pendant 14 jours. Le degré d’adipogenèse dans les cultures peut ensuite être évalué à 1 fois 10 à la 4e cellule par puits dans des plaques de culture tissulaire à 48 puits, selon les protocoles standard de test d’adipogenèse.

Bien que les deux méthodes présentent une distribution et une viabilité similaires de la population cellulaire, l’isolement cellulaire activé par magnétisme produit un plus grand nombre de cellules pour la culture, par rapport au tri cellulaire activé par fluorescence. Dans cette expérience représentative, la prolifération in vitro de cellules activées magnétiquement de la fraction vasculaire stromale triée et des cellules progénitrices adipocytaires, isolées de l’aorte thoracique, des petits vaisseaux de résistance mésentérique et du tissu adipeux gonadique de rats mâles, a été évaluée 8, 24, 48 et 96 heures après le placage, à l’aide d’un test d’ADN quantitatif. Aucune différence de site dans les taux d’expansion de la fraction vasculaire stromale n’a été observée à aucun moment, à l’exception des cellules progénitrices adipocytaires de l’aorte thoracique, qui ont montré une prolifération moindre au 96 heures, par rapport aux cellules vasculaires stromales du même site.

La stimulation des cellules progénitrices adipocytaires confluentes avec la protéine morphogénique osseuse 4 pendant 48 heures induit la différenciation des adipocytes, mise en évidence par une plus grande accumulation de lipides dans les gouttelettes, telle qu’évaluée à la fois par le test d’absorption des lipides fluorescents et la coloration Oil Red O. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 8 heures, si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des températures de 4 degrés Celsius pendant les étapes d’isolement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de différencier les cellules progénitrices adipocytaires.