Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé ²⁺ Sensor CatchER ⁺

L’objectif global de cette expérience est de présenter nos protocoles pour la culture et la transfection des cellules HEK293 et C2C12 avec CatchER plus et son application pour la surveillance des transitoires calciques médiés par le récepteur ERSR dans la mesure du NC2KD. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la signalisation calcique et l’imagerie, telles que la concentration basale de calcium et ses changements rapides dans l’ERSR de cellules définies et comment appliquer le biocapteur CatchER plus pour ces mesures. Le principal avantage de cette technique est que la réponse de fluorescence de cellules individuelles peut être enregistrée en temps réel avec une cinétique rapide.

Les implications de cette technique s’étendent au diagnostic des maladies liées au calcium ERSR, car CatchER plus peut surveiller les transitoires calciques anormaux dans ces organites qui résultent d’éléments de signalisation calcique dysfonctionnels. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de transfection cellulaire et d’imagerie de fluorescence sont difficiles à apprendre car la culture cellulaire et la microscopie ont de multiples zones d’erreur. Florence Reddish, post-doctorante de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette expérience, ensemencez des cellules HEK293 sur les lames de microscope en verre stérilisé dans les boîtes de six centimètres et cultivez-les pendant un à deux jours jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à environ 70 % le jour de la transfection. Ensuite, videz le DMEM de la boîte et ajoutez trois millilitres de sérum réduit. Ensuite, ajoutez le mélange de réactifs de transfection de l’ADN dans la boîte et incubez pendant quatre à six heures à 37 degrés Celsius.

La transfection des cellules HEK293 est généralement plus facile que celle des autres lignées cellulaires, mais les cellules sont moins résistantes aux conditions difficiles. Par conséquent, il est essentiel de ne les exposer à des réactifs de transfection que pendant quatre à six heures pour éviter l’apoptose. Après quatre à six heures, lavez les cellules avec cinq à six millilitres de HBSS.

Jetez le HBSS du plat et remplacez-le par trois millilitres de DMEM frais. Par la suite, incuber les cellules pendant 48 heures à 37 degrés Celsius pour permettre l’expression de GECI. Pour les cellules myoblastiques C2C12, trypsinisez les cellules en ajoutant un à deux millilitres de trypsine pour couvrir le fond de la boîte.

Ensuite, placez le plat dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant deux à six minutes pour permettre à la trypsine de détacher les cellules du fond du bol. Une fois l’incubation terminée, retirez la trypsine et aspirez les cellules dans huit millilitres de DMEM. Pipetez soigneusement les cellules avec du DMEM pour disperser uniformément et remettre en suspension les cellules.

Ensuite, semez-les sur les lamelles stériles dans des boîtes de culture de six centimètres, puis ajoutez trois millilitres de DMEM pour obtenir une confluence finale de 60 %. Incuberez-les pendant 24 heures à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, lavez les cellules avec cinq à six millilitres de HBSS.

Jetez le HBSS du plat et remplacez-le par trois millilitres de DMEM frais. Ensuite, incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 48 heures pour permettre l’expression du GECI. Dans cette procédure, allumez le microscope et la source lumineuse, puis ouvrez le programme PCI simple.

À l’aide d’un coton-tige, couvrez le fond de la chambre d’imagerie à bain de diamant ouvert à profil bas avec une fine couche de scellant. Ensuite, sortez une lame contenant les cellules transfectées de l’incubateur et rincez-la doucement trois fois avec environ un millilitre de tampon de Ringer avec 10 millimolaires de glucose et 1,8 millimolaire de calcium préchauffé à 37 degrés Celsius. Laissez environ un millilitre de tampon Ringer dans le plat pour empêcher les cellules de sécher et utilisez une pince pour retirer la lame du plat.

Absorbez l’excès de solution en touchant le bord de la lame à un tissu de laboratoire. Ensuite, placez-le sur le côté de la chambre avec les cellules tournées vers la graisse. Ensuite, fixez la chambre sur le support de scène à l’aide d’un tournevis.

Ajoutez environ un millilitre de tampon Ringer dans la chambre pour éviter que les cellules ne sèchent tout en le montant sur la platine et en complétant la configuration du microscope. Basculez l’objectif du microscope sur l’objectif à immersion dans l’huile 40 fois. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion dans l’objectif.

Ensuite, placez la monture sur la platine du microscope. Ensuite, placez l’embout à vide dans la chambre pour maintenir la solution à niveau et éviter qu’elle ne se remplisse trop. Ensuite, soulevez l’objectif à l’aide du réglage de trajectoire jusqu’à ce que l’huile sur l’objectif touche le bas de la glissière.

À l’aide du mode Bright Field, réglez le gain à 175 et le temps d’exposition à 0,03 seconde pour faire la mise au point des cellules. Une fois les cellules focalisées, passez en mode fluorescence en utilisant une excitation de 488 nanomètres et modifiez le temps d’exposition à 0,07 seconde. Localisez un champ de vision qui comporte suffisamment de cellules saines avec une fluorescence adéquate pour l’imagerie.

Ensuite, prenez des photos en mode fluorescence et fond clair. Encerclez une région d’intérêt dans les cellules ou faites le tour de la cellule entière pour enregistrer l’intensité de la zone choisie. Maintenant, commencez la mesure de l’intensité avec la fréquence d’images réglée à une toutes les cinq secondes.

Laissez l’intensité de base se stabiliser pendant 20 à 30 images. Ensuite, calculez la quantité de 4-CMC nécessaire à partir d’un stock de 20 millimolaires en fonction du volume final de la chambre de 450 microlitres pour obtenir une concentration finale de 200 micromolaires. Ensuite, transférez soigneusement 60 microlitres de tampon de Ringer de la chambre dans un tube de microcentrifugation.

Diluez la quantité calculée de 4-CMC avec cette solution et ajoutez-la dans la chambre pour évoquer la réponse souhaitée des cellules imagées. Laissez le temps au médicament de se lier au récepteur et le signal diminue par la suite. Ensuite, lavez les cellules avec trois à six millilitres de tampon de Ringer tout en ajoutant simultanément le marqueur d’événement.

Répétez les procédures pour 100 micromolaires d’ATP et 15 micromolaires de CPA en utilisant une nouvelle lame des cellules transfectées pour chaque essai. Une fois la mesure terminée, terminez la collecte de données dans la fenêtre de mesure de l’intensité du programme PCI simple. Par la suite, prenez les images de fluorescence et de fond clair des cellules.

Ensuite, ouvrez le fichier de données de l’expérience. Encerclez à nouveau les cellules ou les régions d’intérêt pour recalculer les valeurs d’intensité si nécessaire. Pour déterminer les cellules myoblastiques NC2KD et C2C12, répétez la procédure de transfection et ajoutez un millilitre de tampon de Ringer sans calcium dans la chambre.

Perméabiliser les cellules avec 0,002 à 0,005 % de saponine et un tampon intracellulaire pendant 15 à 30 secondes pour vider les cellules de tout CatchER plus qui peut se trouver dans le cytosol. Ensuite, lavez les cellules avec trois à six millilitres de tampon KCL contenant de l’EGTA et 10 micromolaires d’ionomycine. Laissez l’intensité diminuer jusqu’à ce qu’un plateau soit atteint.

Ensuite, rincez les cellules avec trois à six millilitres de tampon KCL avec 10 micromolaires d’ionomycine et laissez l’intensité se stabiliser. Par la suite, ajoutez différentes solutions de calcium pour permettre à l’intensité d’atteindre un plateau entre chaque ajout. Pour calibrer le capteur pour la quantification de la concentration basale de calcium, utilisez EGTA et un tampon de calcium de 100 millimolaires pour obtenir l’intensité de fluorescence minimale et maximale.

Voici les caractéristiques représentatives de l’intensité normalisée recueillies à partir des cellules myoblastiques C2C12 perméabilisées transfectées avec CatchER plus. Les cellules ont été perméabilisées avec 0,005 % de saponine dans le tampon intracellulaire pendant 15 à 30 secondes. Des solutions d’EGTA et de calcium ont été préparées dans un tampon KCL et N fait référence au nombre de cellules imagées.

Ces images de fluorescence insérées sont les représentants des cellules avant et après le traitement. 0,2, 0,6, deux, cinq, 10, 20, 50 et 100 millimolaires de calcium ont été ajoutés aux cellules myoblastiques C2C12 perméabilisées en présence de 10 micromolaires d’ionomycine pour obtenir un KD de 3,1 plus ou moins 1,4 millimolaire. Cette figure montre une mesure représentative de l’intensité de CatchER plus des cellules transfectées aux valeurs minimales et maximales après l’ajout d’un EGTA millimolaire et de 100 millimolaires de calcium avec 10 micromolaires d’ionomycine chacun, respectivement.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 30 à 60 minutes pour l’imagerie ou en trois jours si l’on inclut la transfection. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de toujours manipuler les cellules dans un environnement stérile, de préparer les réactifs avant l’expérience, d’appliquer une couche uniforme de graisse sur la chambre et d’avoir votre vide fixé avant de commencer. Après cette procédure, d’autres méthodes comme le western blot peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le niveau d’expression de CatchER plus.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la signalisation et de l’imagerie calciques pour explorer la dynamique calcique de l’ERSR dans les cellules de mammifères. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de transfecter des cellules et de les imager à l’aide de CatchER plus.